于亞明，趙 靜*，李開(kāi)放，崔書(shū)剛，張晨雨，王宏偉

(1.河南科技大學(xué) 環(huán)境與畜產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng) 471023；2.漯河市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南漯河 462000)

子宮內(nèi)膜包括上皮層和固有層，是構(gòu)成子宮內(nèi)壁的一層重要結(jié)構(gòu)，在接受胚胎著床及孕育胎兒的過(guò)程中起至關(guān)重要的作用[1]。子宮內(nèi)膜內(nèi)含有大量的間質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞，其中間質(zhì)細(xì)胞可增殖分化為蛻膜細(xì)胞誘導(dǎo)蛻膜化反應(yīng)的發(fā)生，使子宮內(nèi)膜出現(xiàn)較高的容受性，進(jìn)而可接納胚胎的著床，有利于妊娠的建立及維持；而上皮細(xì)胞具有分泌功能，可供給著床時(shí)早期胚胎所需的營(yíng)養(yǎng)[2-4]。子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的損傷可破壞胚胎著床和發(fā)育的微環(huán)境，是導(dǎo)致不孕癥發(fā)生的重要原因[5]。

反芻動(dòng)物對(duì)鉬極其敏感，攝入過(guò)量的鉬可拮抗反芻動(dòng)物對(duì)銅的吸收，誘導(dǎo)以腹瀉、被毛褪色、生長(zhǎng)不良為臨床癥狀的鉬中毒現(xiàn)象[6-7]。近年來(lái)，隨著鉬礦的開(kāi)采及鉬在工業(yè)中的應(yīng)用，鉬污染對(duì)動(dòng)物，尤其是對(duì)鉬污染地區(qū)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的危害，已嚴(yán)重干擾了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[8-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鉬可降低胚胎著床率和產(chǎn)子率[10-11]，但具體的病理學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚。為此，本研究以小尾寒羊?yàn)樵囼?yàn)用動(dòng)物，通過(guò)建立鉬處理綿羊模型，研究鉬對(duì)子宮病理形態(tài)學(xué)及其內(nèi)膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，旨在為闡明鉬的雌性生殖毒性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 試驗(yàn)共選取24只5月齡健康且體況相當(dāng)(體重20.4 kg±1.7 kg)的雌性小尾寒羊。所有受試綿羊均飼喂在河南科技大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)，將綿羊隨機(jī)分為4組，每組6只。鉬處理組綿羊每天分別灌喂含有不同劑量鉬酸鈉(10、20、50 mg/kg，以綿羊體重計(jì))的定量去離子水，并分別命名為鉬處理Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，而對(duì)照組綿羊每天被灌喂等量不含鉬酸鈉的去離子水。在鉬處理第28天，處死綿羊，迅速采集新鮮的子宮組織。

1.1.2 主要試劑 電鏡固定液(G1102)，DAPI(G1012)、Tunel試劑盒(G1501)、抗熒光淬滅封片劑(G1401)、HE染液套裝(G1003)，武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品；中性樹(shù)膠(10004160)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 組織切片機(jī)(RM2016)，上海徠卡儀器有限公司產(chǎn)品；染色機(jī)(Giotto)，意大利DIAPATH公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)、熒光顯微鏡(Nikon Eclipse C1)，日本尼康公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(JEM-F200)，日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 子宮組織塊在40 g/L多聚甲醛中固定24 h后，依次將組織塊浸入濃度梯度遞增的乙醇中進(jìn)行脫水處理。隨后，組織塊被轉(zhuǎn)入到二甲苯中透明，采用石蠟包埋組織塊。用切片機(jī)進(jìn)行5 μm連續(xù)切片。子宮組織切片在蘇木精和伊紅染色染液中進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察子宮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 透射電鏡 在裝有25 mL/L戊二醛的培養(yǎng)皿中將子宮組織塊修成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊，轉(zhuǎn)移至裝有新鮮的25 mL/L戊二醛EP管中固定4 h。隨后，將組織塊被轉(zhuǎn)入到10 mL/L鋨酸中進(jìn)行后固定。固定后，組織塊分別在濃度梯度遞增的乙醇中脫水，用環(huán)氧樹(shù)脂包埋組織塊進(jìn)行50 nm連續(xù)超薄切片。切片被置入到20 mL/L醋酸鈾和26 mL/L枸櫞酸鉛溶液中染色，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.3 Tunel染色 子宮組織塊經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定并用石蠟包埋后，進(jìn)行連續(xù)切片。隨后，子宮組織切片經(jīng)脫蠟至水，并滴加蛋白酶K工作液孵育。將Tunel試劑盒內(nèi)的TDT酶，dUTP，buffer按1∶5∶50比例混合，滴加到切片并在濕盒內(nèi)孵育。DAPI染液復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光淬滅封片劑封片處理，熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)均以平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，用SPSS軟件(SPSS 17.0，IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鉬對(duì)綿羊子宮組織病理形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)照組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞規(guī)則排列，細(xì)胞間隙清晰，同時(shí)可見(jiàn)基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布(圖1A1～A3)。在鉬處理后可見(jiàn)子宮組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)受損。鉬處理Ⅰ組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列紊亂，部分上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)丟失，細(xì)胞核皺縮、濃染，間質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)丟失(圖1B1～B3)。在鉬處理Ⅱ組(圖1C1～C3)和鉬處理Ⅲ組(圖1D1～D3)可見(jiàn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞間隙不清，細(xì)胞質(zhì)減少，空泡化嚴(yán)重，尤其在鉬處理Ⅲ組子宮形態(tài)損傷最為嚴(yán)重。

2.2 鉬對(duì)綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步評(píng)估鉬對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，用透射電鏡觀察鉬處理后內(nèi)膜上皮亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化(圖2)。對(duì)照組可清晰地觀察到線粒體嵴和雙層核膜(圖2A1～A4)。鉬處理后可見(jiàn)線粒體明顯損傷，表現(xiàn)為線粒體嵴的溶解或消失，線粒體腫脹，空泡化，也可觀察到細(xì)胞核受損，表現(xiàn)為核膜模糊，雙層核膜消失，常染色質(zhì)變多，異染色質(zhì)變少，且子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷隨著灌喂鉬劑量的增加而加重(圖2B1～B4、C1～C4、D1～D4)。

2.3 鉬對(duì)綿羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組未見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡(圖3A1～A2)，而鉬處理組凋亡的細(xì)胞明顯地增多(圖3B1～B2，C1～C2，D1～D2)。與對(duì)照組相比，鉬處理組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05或P<0.01)(圖3E)，且細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性，隨著灌喂鉬的增多，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡率也逐漸升高。

不同劑量鉬對(duì)子宮組織病理形態(tài)學(xué)的影響。A1～A3為對(duì)照組，B1～B3為鉬處理Ⅰ組，C1～C3為鉬處理Ⅱ組，D1～D3為鉬處理Ⅲ組

A1～A4為對(duì)照組，B1～B4為鉬處理Ⅰ組，C1～C4為鉬處理Ⅱ組，D1～D4為鉬處理Ⅲ組。Mi為線粒體，N為細(xì)胞核，NM為核膜

3 討論

鉬作為機(jī)體必需微量元素，是多種酶的輔助因子，在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖中發(fā)揮著至關(guān)重要作用[12]。然而，過(guò)量的鉬攝入可加速脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程，誘導(dǎo)氧自由基的生成增加，過(guò)多的自由基蓄積可攻擊細(xì)胞膜，最終造成多種組織器官的結(jié)構(gòu)及功能受損[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)在灌喂10 mg/kg鉬酸鈉后即可觀察到子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的損傷，且隨著鉬劑量的增加，子宮內(nèi)膜損傷逐漸加重，這可能是過(guò)量的鉬引起銅缺乏，進(jìn)而誘導(dǎo)銅依賴性抗氧化酶活性降低，加快體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程的結(jié)果[15]。子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于維持胚胎著床及發(fā)育的微環(huán)境至關(guān)重要，鉬誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜損傷可能對(duì)胚胎著床存在潛在威脅。

A1～A2為對(duì)照組，B1～B2為鉬處理Ⅰ組，C1～C2為鉬處理Ⅱ組，D1～D2為鉬處理Ⅲ組，E為子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率。*P< 0.05，**P< 0.01

子宮內(nèi)膜發(fā)揮正常功能離不開(kāi)線粒體的供能。線粒體內(nèi)膜向內(nèi)皺褶形成的線粒體嵴是產(chǎn)生ATP的主要部位，為機(jī)體各項(xiàng)生命活動(dòng)提供所需能量[16]。此外，存在于線粒體內(nèi)膜的線粒體呼吸鏈可合成活性氧。正常生理狀態(tài)下，活性氧的產(chǎn)生和消耗受機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控而保持平衡。研究表明，過(guò)量的鉬可降低機(jī)體抗氧化能力，打破體內(nèi)氧化與抗氧化的平衡，導(dǎo)致活性氧生成增多[17-18]。活性氧的產(chǎn)生和消耗一旦失衡，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生，進(jìn)而損傷線粒體的結(jié)構(gòu)與功能[19]。本研究在灌喂10 mg/kg鉬酸鈉后，可觀察到子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的損傷，呈現(xiàn)線粒體空泡化，線粒體嵴溶解，消失核膜模糊，隨著灌喂鉬劑量的增加，線粒體空泡化更加明顯，表明鉬具有明顯的線粒體毒性，造成這一結(jié)果的主要原因可能是鉬誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所引發(fā)。

鉬引起線粒體損傷可能激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體超微結(jié)構(gòu)一旦受損可引起線粒體內(nèi)促凋亡因子細(xì)胞色素C進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，促使細(xì)胞色素C與凋亡酶激活因子相互作用形成凋亡復(fù)合體，復(fù)合體又進(jìn)一步促進(jìn)下游caspase-9和caspase-3的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究灌喂10 mg/kg鉬酸鈉后，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡率顯著地升高，灌喂20 mg/kg和50 mg/kg鉬酸鈉后，細(xì)胞凋亡率極顯著地上升，表明鉬具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力，且凋亡率呈劑量依賴性，這可能與鉬損傷線粒體進(jìn)而觸發(fā)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡相關(guān)。

綜上所述，過(guò)量鉬攝入可嚴(yán)重?fù)p傷子宮內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡發(fā)生，進(jìn)一步破壞子宮內(nèi)膜為胚胎著床及發(fā)育提供的微環(huán)境，但其具體作用機(jī)制有待深入研究。