葉瑋琪，蔡金音，陳 曦，范欣怡，趙 倩，蘇亮飛，和鳳平，張立梅，江康峰，李小兵

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650000)

隨著云南省奶牛業(yè)的迅速發(fā)展，奶牛疾病發(fā)生比例逐漸增多，尤其是奶牛酮病。奶牛酮病雖然病死率低，但導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能下降，繼發(fā)其他疾病，使牧場(chǎng)飼養(yǎng)成本增加，影響?zhàn)B殖效益[1]。奶牛新陳代謝中85%的葡萄糖由肝臟合成，肝臟是維持血糖穩(wěn)定的重要器官。奶牛因產(chǎn)前肥胖造成脂肪蓄積于肝臟，引起肝糖原含量減少，糖異生作用減弱，產(chǎn)犢時(shí)大量的體能消耗導(dǎo)致血糖降低。血糖濃度的降低會(huì)導(dǎo)致脂肪被大量分解為游離脂肪酸，游離脂肪酸的不完全氧化會(huì)生成大量酮體[2]。奶牛分娩后常處于能量負(fù)平衡(NEB)狀態(tài)[3]，使得體脂動(dòng)員產(chǎn)生的脂肪酸增多，肝臟只能利用一部分游離脂肪酸，合成過(guò)多的甘油三酯對(duì)肝臟產(chǎn)生浸潤(rùn)，肝臟運(yùn)行負(fù)荷過(guò)大，最終造成肝功能受損。奶牛酮病是NEB的結(jié)果，常呈高游離脂肪酸血癥、酮血癥、肝脂浸潤(rùn)[4]。肝脂浸潤(rùn)往往使能量代謝障礙更加嚴(yán)重[5]，引起血酮升高進(jìn)而加重NEB的惡性循環(huán)。

酮病的發(fā)生給奶牛生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此進(jìn)行酮病有效監(jiān)測(cè)十分必要[6]。飼料營(yíng)養(yǎng)的調(diào)整，飼養(yǎng)管理加強(qiáng)及產(chǎn)后護(hù)理措施的完善等，可顯著降低酮病的發(fā)病率，提高養(yǎng)殖效益。有報(bào)道稱，酮病在我國(guó)不同規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病率為16%～45%，并在產(chǎn)后2周內(nèi)發(fā)病率達(dá)到最高[7]。然而，關(guān)于云南省奶牛酮病的流行情況還未曾報(bào)道。因此，本研究通過(guò)調(diào)查云南省昆明市某集約化養(yǎng)殖場(chǎng)奶牛酮病的發(fā)病情況，檢測(cè)酮病奶牛相關(guān)血液指標(biāo)，分析酮病奶牛肝臟病理變化，為進(jìn)一步了解云南省集約化奶牛場(chǎng)奶牛酮病發(fā)病規(guī)律和酮病診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 云南省昆明市某集約化奶牛場(chǎng)隨機(jī)選擇40頭，胎次為2胎～4胎待產(chǎn)且體況正常的荷斯坦奶牛。體況正常包括無(wú)異常臨床癥狀，脈搏、心跳、呼吸、體溫等生理指標(biāo)正常。根據(jù)β-羥丁酸(BHBA)濃度進(jìn)行分組：血酮濃度≥1.2 mmol/L為酮病組、血酮濃度

1.1.2 主要試劑與儀器 牛β-羥基丁酸(BHBA)、牛游離脂肪酸(NEFA)ELISA檢測(cè)試劑盒，上海酶連生物科技有限公司產(chǎn)品；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、高密度脂蛋白(HDL)、葡萄糖(GLU)測(cè)定試劑盒，深圳雷杜生命科技有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)檢測(cè)儀，賽默飛世爾儀器有限公司產(chǎn)品；Chemray 800全自動(dòng)生化分析儀，深圳雷杜生命科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血液樣品采集 根據(jù)牛場(chǎng)管理軟件的預(yù)產(chǎn)時(shí)間，跟蹤采集產(chǎn)前5 d，生產(chǎn)當(dāng)天，產(chǎn)后5 d，產(chǎn)后10 d的血液樣品。采集尾根靜脈血10 mL，肝素鈉抗凝，室溫下以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液于EP管，分成2份，1份用于ELISA檢測(cè)，另1份用于其他指標(biāo)檢測(cè)。置-80℃冰箱內(nèi)凍存待檢。

1.2.2 血液指標(biāo)檢測(cè) ELISA操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)檢測(cè)儀檢測(cè)。用Chemray800全自動(dòng)血液生化分析儀對(duì)生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 酮病牛肝臟病理切片制作 將酮病組死亡和淘汰的牛解剖，在牛的右季肋區(qū)，從第5肋骨至第13肋骨之間的位置，用組織剪剪下部分肝組織，放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定。

取出40 mL/L多聚甲醛固定好的組織樣本用流水沖洗，梯度酒精依次脫水。750 mL/L酒精2 h、850 mL/L酒精2 h、900 mL/L酒精1.5 h、950 mL/L酒精2 h、無(wú)水乙醇Ⅰ 2 h、無(wú)水乙醇Ⅱ 2 h、醇苯40 min、二甲苯Ⅰ 40 min、二甲苯Ⅱ 40 min、65℃融化石蠟Ⅰ 0.5 h、65℃融化石蠟Ⅱ 1 h、65℃融化石蠟Ⅲ 3 h然后包埋成蠟塊。使用切片機(jī)切3 μm～5 μm厚石蠟切片，65℃烤片4.5 h；切片入蘇木素染液染3 min～5 min，自來(lái)水洗，分化液分化，自來(lái)水洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗；切片依次入850 mL/L、950 mL/L的梯度酒精脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min；切片依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min、無(wú)水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min，透明中性樹(shù)膠封片；光學(xué)倒置顯微鏡觀察，選取目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行拍照，分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩個(gè)組各時(shí)間點(diǎn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用比較平均值成對(duì)樣本t檢驗(yàn)，各時(shí)間點(diǎn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果用GraphPad Prism8.4.0軟件進(jìn)行對(duì)比作圖。

2 結(jié)果

2.1 酮病發(fā)病情況

40頭奶牛產(chǎn)前5 d和生產(chǎn)當(dāng)天，血酮值均低于1.2 mmol/L，無(wú)酮病發(fā)生；產(chǎn)后5 d，酮病奶牛有9頭，發(fā)病率為22.5%；產(chǎn)后10 d，新增發(fā)病奶牛10頭，酮病奶牛有19頭，發(fā)病率為47.5%。發(fā)生酮病的19頭牛為酮病組，另外21頭健康牛為健康組(圖1)。其中酮病組1頭奶牛在產(chǎn)后第13 d因出現(xiàn)神經(jīng)癥狀被淘汰，1頭在產(chǎn)后第15 d突然發(fā)生猝死。產(chǎn)犢后記錄奶牛從分娩后第1天至產(chǎn)后第60天每天的泌乳量，酮病奶牛平均每天產(chǎn)奶27.19 kg±1.33 kg，健康奶牛平均每天產(chǎn)奶32.06 kg±1.55 kg。

*P<0.05，**P<0.01

2.2 BHBA濃度變化

在分娩當(dāng)天，酮病組BHBA濃度為0.82 mmol/L±0.04 mmol/L，健康組BHBA濃度為0.67 mmol/L±0.05 mmol/L，組間差異不顯著，兩組奶牛均未發(fā)??；產(chǎn)后5 d，健康組BHBA濃度為(0.84±0.05)mmol/L，酮病組為1.28 mmol/L±0.16 mmol/L，酮病組極顯著高于健康組(P<0.01)；產(chǎn)后10 d，酮病組BHBA持續(xù)上升為1.48 mmol/L±0.18 mmol/L，健康組為0.74 mmol/L±0.05 mmol/L，酮病組極顯著高于健康組(P<0.01)。

2.3 能量指標(biāo)變化

產(chǎn)前5 d、生產(chǎn)當(dāng)天和產(chǎn)后5 d的NEFA濃度無(wú)明顯變化。產(chǎn)后10 d，酮病組NEFA濃度急劇升高，酮病組為1.1 mmol/L±0.40 mmol/L，健康組為0.64 mmol/L±0.45 mmol/L，酮病組極顯著高于健康組(P<0.01)；產(chǎn)前5 d，健康組和酮病組GLU濃度在4.0 mmol/L以下，生產(chǎn)當(dāng)天兩組GLU濃度均急劇升高，組間差異不顯著。產(chǎn)后5 d，健康組濃度降至3.18 mmol/L±0.88 mmol/L，酮病組濃度降至1.97 mmol/L±0.12 mmol/L，組間差異顯著；產(chǎn)后10 d，酮病組顯著低于健康組(P<0.05)(圖2)。

2.4 肝功能指標(biāo)變化

圖2酮病組與對(duì)照組NEFA(A)、GLU(B)的變化曲線

健康組和酮病組AST、TG、ALT、TBIL和ALB濃度變化見(jiàn)圖3，健康組和酮病組AST在產(chǎn)前10 d、產(chǎn)前5 d、生產(chǎn)當(dāng)天均無(wú)顯著差異。產(chǎn)后10 d AST濃度上升，酮病組為128.64 μ/L±6.11 μ/L，健康組為105.24 μ/L±3.23 μ/L，組間差異極顯著(P<0.01)；酮病組和健康組產(chǎn)前5 d至生產(chǎn)當(dāng)天TG濃度急劇下降，并持續(xù)至產(chǎn)后5 d。產(chǎn)后10 d，健康組下降為0.11 mmol/L±0.0047 mmol/L，酮病組上升為0.15 mmol/L±0.0067 mmol/L，酮病組顯著高于健康組(P<0.05);健康組和酮病組在監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)ALT、TBIL、ALB濃度未出現(xiàn)顯著性差異。兩組TBIL濃度在生產(chǎn)當(dāng)天均有一定程度的上升，之后逐漸下降至正常水平。

2.5 高密度脂蛋白、對(duì)氧磷酶1變化

HDL、PON-1變化見(jiàn)圖4，健康組和酮病組在監(jiān)測(cè)期內(nèi)差異不顯著，生產(chǎn)當(dāng)天HDL濃度下降到最低；產(chǎn)前5 d到產(chǎn)后10 d,PON-1呈一個(gè)逐漸上升的趨勢(shì)，產(chǎn)后10 d，酮病組對(duì)氧磷酶1濃度為4.87 mg/mL±0.17 mg/mL，健康組為5.56 mg/mL±0.22 mg/mL，酮病組顯著低于健康組(P<0.05)。

2.6 酮病奶牛肝臟病理學(xué)變化

酮病奶牛肝臟均勻性增大，邊緣鈍而厚，表面光滑，質(zhì)如面團(tuán)，表面呈黃紅色和灰黃白色，有油膩感。刀切時(shí)，硬度較健康肝臟稍增加，刀面有脂肪沾染。切面呈黃紅或淡黃色，有油膩感(圖5)。健康奶牛肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿，未見(jiàn)明顯水腫固縮壞死等變性(圖6)，酮病奶牛圖(圖6C、圖6D)肝組織整體結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，組織可見(jiàn)大量肝細(xì)胞脂肪變性，脂變的肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴。脂肪變性初期脂滴較小，逐漸變大后，緊密分布于胞漿內(nèi)，病變明顯部位可見(jiàn)空泡樣(箭頭所示)；酮病奶牛的肝組織整體結(jié)構(gòu)異常，組織肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，可見(jiàn)肝細(xì)胞廣泛水腫(圖6E、圖6F)箭頭所示; 部分肝細(xì)胞核固縮溶解消失。

3 討論

酮病是奶牛圍產(chǎn)期普遍發(fā)生的一種代謝性疾病，酮病的發(fā)病因素有很多，包括產(chǎn)前過(guò)度肥胖、機(jī)體能量負(fù)平衡(NEB)、營(yíng)養(yǎng)不均衡等[8]。奶牛在圍產(chǎn)期經(jīng)歷妊娠、分娩、泌乳等一系列變化，干物質(zhì)攝入較少，但泌乳對(duì)能量的需求較高，采食量不能滿足泌乳需求而出現(xiàn)能量負(fù)平衡，機(jī)體只能通過(guò)動(dòng)用脂肪和蛋白質(zhì)來(lái)滿足需求，結(jié)果導(dǎo)致乙酰乙酸和β-羥丁酸的生成過(guò)多而引起酮病[9]。該集約化養(yǎng)殖場(chǎng)干奶期的飼養(yǎng)密度較大，奶牛運(yùn)動(dòng)量小，導(dǎo)致了奶牛胖瘦不均。研究表明，放牧的奶牛酮病發(fā)病率低于集約化養(yǎng)殖的奶牛[10]。奶牛產(chǎn)犢后開(kāi)始泌乳，由于奶牛食欲恢復(fù)較慢，攝入的能量和葡萄糖還不能完全滿足泌乳需求，從而導(dǎo)致血糖迅速下降。在本次研究中，酮病組GLU濃度在產(chǎn)后5 d、10 d顯著低于健康組，呈現(xiàn)低血糖癥，這與楊威等研究結(jié)果一致[11],GLU濃度在分娩時(shí)突然升高，之后又迅速下降，這與遲景波等研究結(jié)果相吻合[12]。

ALT、AST可作為反映肝細(xì)胞損傷及嚴(yán)重程度的指標(biāo)[13]。在本次研究中，AST的含量在產(chǎn)后10 d極顯著高于對(duì)照組，并且從生產(chǎn)當(dāng)天到產(chǎn)后呈逐漸上升的趨勢(shì)；ALT濃度雖然未表現(xiàn)顯著性差異，但酮病組ALT濃度在產(chǎn)后10 d高于對(duì)照組，表明產(chǎn)后10 d左右酮病組奶牛肝臟受損嚴(yán)重。酮病奶牛TG濃度在產(chǎn)后10 d顯著高于健康組，提示酮病奶牛肝臟有脂肪的蓄積。TG增加會(huì)引起肝臟狀態(tài)和功能的改變。酮病奶牛的肝臟常伴有腫脹，邊緣鈍圓，切面蒼白至黃色，并伴有腎臟、心肌和骨骼肌的大量TG浸潤(rùn)[14]。對(duì)酮病奶牛進(jìn)行肝穿刺病理檢查能夠評(píng)價(jià)酮病導(dǎo)致的肝臟炎癥和脂肪蓄積程度，評(píng)估病情，預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展。在平行于大轉(zhuǎn)子通過(guò)第10肋間空間的位置，能夠容易安全地實(shí)施經(jīng)胸腔的針吸肝臟活組織檢查[15]。然而，活組織樣品檢測(cè)的主要缺點(diǎn)是目前沒(méi)有關(guān)于奶牛肝組織活檢風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的相關(guān)報(bào)道。從肝臟病理切片的觀察發(fā)現(xiàn)，酮病

圖3酮病組與健康組AST(A)、TG(B)、ALT(C)、TBIL(D)、ALB(E)的變化曲線

圖4酮病組與健康組HDL(A)、 PON-1(B)的變化曲線

圖5酮病奶牛的肝臟

奶牛肝細(xì)胞腫大，充滿大量大小不一的脂滴。肝細(xì)胞個(gè)體體積增大，細(xì)胞核固縮。引起細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能減弱，造成萎縮，壞死。通過(guò)對(duì)該場(chǎng)酮病奶牛病理切片分析，說(shuō)明酮病奶牛肝臟存在嚴(yán)重的脂肪蓄積，出現(xiàn)器官實(shí)質(zhì)性病變。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酮病組奶牛血液中PON-1濃度與健康組相比顯著下降(P<0.05)，原因可能是圍產(chǎn)期奶牛的生理狀況，代謝水平發(fā)生了劇烈的變化，導(dǎo)致機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，同時(shí)體脂會(huì)大量動(dòng)員產(chǎn)生脂肪酸，在肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體氧化中釋放大量的活性氧(ROS)。過(guò)多的ROS會(huì)造成抗氧化物的平衡失調(diào)，造成脂質(zhì)間過(guò)度氧化，會(huì)產(chǎn)生大量有細(xì)胞毒性物質(zhì)，引起肝細(xì)胞壞死，在肝臟受到損傷時(shí)，在血液中PON-1合成減少，活性下降，這可能是機(jī)體的氧化應(yīng)激與PON-1活性成反比導(dǎo)致的結(jié)果。趙暢等在牛PON-1單克隆抗體夾心ELISA方法建立與初步應(yīng)用的研究中，明確了血中 PON-1 可作為奶牛酮病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警指標(biāo)及其預(yù)警值為62.37 nmol/L[16]。酮病組奶牛血漿中的PON-1活性顯著低于健康組[17]。本次試驗(yàn)關(guān)于PON-1的結(jié)果與先前的研究相一致，因此臨床檢測(cè)PON-1可能對(duì)奶牛酮病有一定的診斷價(jià)值。

圖6健康奶牛和酮病牛肝臟組織切片