謝沛璇，姜 巖，安 琪，張中懷，王春仁，張 旭

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

林蛙(Wood frog)在分類學(xué)上屬于脊索動物門(Chordata)、脊椎動物亞門(Vertebrata)、兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙屬(Rana)。林蛙分布廣泛，現(xiàn)已知全世界有林蛙30種左右，我國有17種[1]。林蛙多棲息在林溪中，其生活期可分為水中生活期和森林生活期。由于林蛙具有適應(yīng)水中和陸地不同環(huán)境的能力，使其感染寄生蟲的可能性大幅增加[2]。

線蟲屬于線形動物門(Nemathelminthes)、線蟲綱(Nematoda)，絕大多數(shù)為自由生活，少部分寄生在人體或動植物體內(nèi)[3]，其中蛙類是線蟲的重要宿主之一。線蟲的寄生可導(dǎo)致蛙類的正常發(fā)育受阻，影響蛙類的生產(chǎn)性能，而且有些線蟲還是人獸共患寄生蟲，曾在青蛙體內(nèi)檢出人獸共患的廣州管圓線蟲[4]，因此在食用或藥用蛙時(shí)，應(yīng)特別注意。為了解黑龍江省林蛙肺臟線蟲的種類及流行情況，為養(yǎng)殖林蛙寄生蟲病的防控提供科學(xué)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)室2019年-2020年在黑龍江省13個(gè)地市采集黑龍江林蛙和東北林蛙，對肺部進(jìn)行解剖鏡檢，檢出的蟲體采用形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，并對黑龍江省不同地點(diǎn)不同種蛙的肺臟線蟲的感染率和感染強(qiáng)度進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 2019年-2020年在黑龍江省13個(gè)地市采集黑龍江林蛙778只和東北林蛙174只，共952只。登記后，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、2×TaqPlus PCR Mix、DNA凝膠回收試劑盒均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、pMD18-T載體、大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；PCR儀，美國Gene Amp PCR System 9700；高速臺式離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱，寧波自動化儀表廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蟲體收集 對樣品稱重后采用直接剖檢法收集兩種林蛙的肺部線蟲，記錄每只蛙體檢獲的線蟲情況。

1.2.2 蟲體鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 用光學(xué)顯微鏡對采集的新鮮蟲體進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)觀察，對蟲體的大小及內(nèi)部重要器官進(jìn)行測量，并對口、食道、腸、陰門等部位進(jìn)行詳細(xì)觀察，參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[5-6]。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 對初步鑒定的蟲體按照DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行基因組DNA的提取。參照文獻(xiàn)報(bào)道的通用引物[7]：上游引物NC5(5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′)；下游引物NC2(5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′)擴(kuò)增蟲體rDNA-ITS基因部分序列。引物由哈爾濱擎科生物有限公司合成。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，具體如下： 2×TaqPlus PCR Mix 12.5 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物(10 pmol)各 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，混勻瞬離后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并保留圖片。PCR產(chǎn)物按照DNA凝膠回收試劑盒的說明書進(jìn)行純化。將pMD-18T與純化產(chǎn)物連接后，轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，篩選陽性菌落，經(jīng)菌液PCR鑒定后送至哈爾濱擎科生物有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2.3 序列和進(jìn)化分析 對擴(kuò)增獲得目的基因與GenBank公布的相關(guān)序列進(jìn)行Blast同源性分析。應(yīng)用MEGA 6.0軟件對序列進(jìn)行分析，同時(shí)采取最大簡約法構(gòu)建進(jìn)化樹，探討所獲得蟲體與其他線蟲的親緣關(guān)系。

1.2.3 感染情況調(diào)查 在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，計(jì)算蛙類肺臟線蟲的感染率和平均感染強(qiáng)度。感染率(%)=(肺線蟲感染陽性數(shù)÷被檢測林蛙總只數(shù))×100%；平均感染強(qiáng)度(條/只)=肺線蟲檢出總數(shù)÷肺線蟲感染陽性林蛙只數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總整理，應(yīng)用SPSS軟件對不同地點(diǎn)、不同種林蛙的感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 蟲體鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在顯微鏡下仔細(xì)對從肺部檢出的線蟲進(jìn)行詳細(xì)觀察，發(fā)現(xiàn)所有蟲體的大小、外部形態(tài)和內(nèi)容結(jié)構(gòu)均相似，初步認(rèn)定為一種蟲體。蟲體細(xì)長，口有6片不明顯的唇，口囊小且短寬；食道短鈍，后部明顯膨大，神經(jīng)環(huán)位于食道前部。腸呈黑色，寬而直；尾部基部寬大，尾端尖細(xì)；陰門位于體中(圖1)。蟲卵呈橢圓形，產(chǎn)出時(shí)卵內(nèi)已有幼蟲。線蟲的各個(gè)器官的測量數(shù)值見表1。根據(jù)形態(tài)和測量數(shù)據(jù)，初步鑒定該肺臟線蟲為蟾蜍棒線蟲(Rhabdiasbufonis)。

a.蟲體整體觀；b.蟲體頭端；c.蟲體中部；d.蟲體尾端

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 成功擴(kuò)增該蟲體的ITS序列，瓊脂糖凝膠電泳分析，約700 bp處有明顯條帶，條帶大小在預(yù)期目的片段范圍之內(nèi)(圖2)。測序結(jié)果顯示本研究的蟲體ITS基因序列長度為711 bp。經(jīng)過Blast比對分析發(fā)現(xiàn)該蟲體序列與GenBank上已發(fā)表的蟾蜍棒線蟲(KF999593)的ITS序列的相似性為99.43%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.蟲體ITS序列產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000; 1.ITS products of the lungworm

2.1.3 進(jìn)化分析 以日本麗尾線蟲(Cosmocercajaponica，LC052772)為外群，13種線蟲構(gòu)建進(jìn)化樹見圖3。所有線蟲分為兩大支，Serpentirhabdias屬線蟲為一支，而Rhabdias屬和Entomelas屬線蟲形成另一支。本實(shí)驗(yàn)蟲體與Rhabdias屬其他肺線蟲聚集在一起，形成一個(gè)小的分支，并且與蟾蜍棒線蟲(Rhabdiasbufonis，KF999593)聚集在一起。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果，鑒定該蟲體為蟾蜍棒線蟲。

2.2 黑龍江省林蛙肺線蟲感染情況

2.2.1 黑龍江省不同種類林蛙肺線蟲感染情況 在剖檢的952只林蛙中共檢出肺線蟲11 646條。陽性蛙866只，感染率為90.97%，平均感染強(qiáng)度為13.45條(表2)。由此可見，黑龍江省東北林蛙和黑龍江林蛙肺臟線蟲感染率和感染強(qiáng)度都較高。兩種林蛙之間感染率差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 黑龍江省不同地點(diǎn)林蛙肺臟線蟲感染情況 黑龍江省林蛙肺線蟲感染非常廣泛，不同地點(diǎn)林蛙體內(nèi)均檢出了大量蟲體(表3)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，黑龍江地區(qū)感染率最高的是綏化(98.29%)，最低的為伊春(80.95%)；感染強(qiáng)度最大的為大慶(93條)。不同地點(diǎn)2種林蛙的感染率和感染強(qiáng)度差異均不顯著(P>0.05)。

表1線蟲的測量結(jié)果(單位：mm)

圖3基于ITS序列的進(jìn)化分析

表2黑龍江省兩種林蛙肺臟線蟲感染情況

3 討論

寄生蟲的分類鑒定是寄生蟲研究的基礎(chǔ)，準(zhǔn)確的鑒定寄生蟲種類對預(yù)防和控制寄生蟲病有重大的意義[11]。長期以來，動物寄生蟲鑒定主要以形態(tài)學(xué)鑒定方法為主。由于寄生蟲形態(tài)學(xué)特征易受地理環(huán)境的影響，且要求研究人員必須具有一定的理論知識和豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)，對寄生蟲鑒定有一定的局限性。由于棒線蟲屬中各種線蟲形態(tài)非常相似，為了準(zhǔn)確鑒定，我們在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上結(jié)合了分子生物學(xué)方法。

表3黑龍江省不同地市林蛙肺臟線蟲感染率和感染強(qiáng)度

自20世紀(jì)80年代以來，分子生物學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的快速發(fā)展，為寄生蟲的鑒定開辟了全新的道路[12]。rDNA-ITS即核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，因其PCR擴(kuò)增效率和測序成功率較好，還具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，因而被作為種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的一種重要的分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于寄生蟲鑒定、親緣關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究[13-16]。

本試驗(yàn)檢獲的蟲體，在形態(tài)上完全一致，形態(tài)學(xué)初步鑒定為蟾蜍棒線蟲。蟲體的ITS序列與GenBank已發(fā)表的蟾蜍棒線蟲(KF999593)的相似性達(dá)到了99.43%，進(jìn)化分析顯示，本實(shí)驗(yàn)蟲體與蟾蜍棒線蟲處于同一分支中，因此結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察以及分子生物學(xué)結(jié)果，鑒定此線蟲為蟾蜍棒線蟲。

棒線屬線蟲種類繁多，主要寄生于兩棲爬行動物的肺臟內(nèi)，全世界有30余種。國內(nèi)報(bào)道的蛙類棒線蟲有5種，分別為蟾蜍棒線蟲(Rhabdiasbufonis)、日本棒線蟲(Rhabdiasnipponica)、球頭棒線蟲(Rhabdiasglobocephala)、雙冠棒線蟲(Rhabdiasbicornis)和蜥蜴棒線蟲(Rhabdiasincerta)。本研究檢出的蟾蜍棒線蟲與李卓等[17]在長白山林區(qū)中國林蛙肺中檢出的雙角棒線蟲(Rhabdiasbufonis)為同物異名。

感染情況調(diào)查結(jié)果顯示，黑龍江地區(qū)林蛙肺線蟲的感染率高(90.97%)，感染強(qiáng)度大(13.45條)，感染率明顯高于已有報(bào)道[18-19]。本結(jié)果顯示東北林蛙和黑龍江林蛙肺臟線蟲的感染率和感染強(qiáng)度無顯著差異，不同地點(diǎn)2種林蛙的感染率和感染強(qiáng)度差異均不顯著(P>0.05)，這可能與黑龍江省的蛙類生活環(huán)境相似有關(guān)。

林蛙作為蛤蟆油的基源動物，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其市場需求大，黑龍江省在林蛙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展有著天然優(yōu)勢[20]。在剖檢過程中發(fā)現(xiàn)肺臟組織充血腫脹，有大量線蟲堆積堵塞氣管的情況。因此認(rèn)為，林蛙肺臟線蟲可嚴(yán)重危害林蛙的生長發(fā)育，嚴(yán)重甚至可導(dǎo)致個(gè)體死亡，這會為養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對黑龍江省的黑龍江林蛙和東北林蛙的肺臟寄生線蟲的種類進(jìn)行鑒定，并對其感染率和感染強(qiáng)度進(jìn)行了調(diào)查，為黑龍江省養(yǎng)殖林蛙肺線蟲病防控提供了科學(xué)依據(jù)。