孫姚承, 湯建軍, 魏 來, 杭蘇寧,倉 杰, 王夢濤, 奚劍波

(1. 江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院/徐州醫(yī)科大學(xué)武進(jìn)臨床學(xué)院 普通外科, 江蘇 常州, 213002;2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江, 212013)

肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的主要原因[1]。肝癌起病隱匿, 70%～80%的肝癌患者確診時(shí)己是晚期，經(jīng)診斷后平均存活時(shí)間僅約6個(gè)月, 5年總生存率低于19%[2]。目前，臨床治療肝癌的主要方法有外科手術(shù)肝臟切除、介入治療、肝移植、化療等，外科手術(shù)肝臟切除為首選治療方法[3]。但肝癌患者肝切除后5年復(fù)發(fā)率高，其初期癥狀不明顯，不能早期篩查，多數(shù)發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，且已無手術(shù)指征[4]。當(dāng)前肝癌治療效果不佳，是由于其腫瘤形成的分子機(jī)制尚不清楚。因此，臨床人員亟需揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找有效的治療方式以改善肝癌患者預(yù)后。

N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾普遍存在于各種類別的RNA中，其中以信使RNA較為多見，表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)，其豐度水平直接影響轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。ALKBH5作為m6A修飾中非常重要的一個(gè)元件，其與多種腫瘤的臨床預(yù)后有關(guān)，通過不同的分子機(jī)制影響腫瘤的進(jìn)程。但ALKBH5在肝癌進(jìn)程中的作用尚未闡明，故本研究挖掘了ALKBH5的表達(dá)與臨床各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)的內(nèi)在關(guān)系，成功構(gòu)建shRNA干擾質(zhì)粒，篩選出穩(wěn)定低表達(dá)ALKBH5的細(xì)胞株，探討ALKBH5對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能中遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染: 本實(shí)驗(yàn)中所用的正常肝細(xì)胞系LO2以及2種肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2由江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存，所用培養(yǎng)基為DMEM與10%胎牛血清混合而成，在恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。在www.sigmaaldrich.cn/網(wǎng)站找到驗(yàn)證后的shALKBH5 oligos序列，上游序列5′-CCGGGAAAGGCTGTTGGCATCAATACTCGAGTATTGATGCCAACAGCCTTTCTTTTG -3′, 下游序列5′-AATTCAAAAAGAAAGGCTGTTGGCATCAATACTCGAGTATTGATGCCAACAGCCTTTC-3′。按照慢病毒包裝試劑盒說明書，使用pLKO.1-TRC載體質(zhì)粒、穿梭質(zhì)粒psPAX2和包裝質(zhì)粒pMD2. G共同構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒，同時(shí)把干擾質(zhì)粒sh-EGFP/sh-ALKBH5及其他2種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4～6 h后更換為培養(yǎng)基，放入溫箱孵育，細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，吸管吸取富含慢病毒顆粒的培養(yǎng)基液體備用。

轉(zhuǎn)染前24 h, 取適當(dāng)?shù)奶幱趯?duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化，用完全培養(yǎng)基重懸后將數(shù)量合適的細(xì)胞接種至6孔板中(大約為5×105個(gè)/孔)，保證細(xì)胞在孔中分布均勻。轉(zhuǎn)染前30 min, 吸管吸去培養(yǎng)皿中原有液體，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基，要求不含有抗生素及血清。根據(jù)分組配制慢病毒轉(zhuǎn)染液，加入相應(yīng)培養(yǎng)孔中，輕輕晃動(dòng)混勻，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。4～6 h后吸管吸去培養(yǎng)皿中原有液體，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24～48 h。

1.1.2 主要試劑: DMEM、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ECL試劑盒均由美國Thermo公司生產(chǎn); 兔抗人EMT抗體試劑盒購自美國Cell Signaling公司; LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司; 30%丙烯酰胺購自中國上海Takara公司產(chǎn)品; Tris-HCl(pH值8.8、pH值6.8)為中國康為世紀(jì)公司產(chǎn)品; Marigel基質(zhì)膠購自美國BD公司; 2×SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混合溶液購自美國Bioworld公司; Transwell小室購自美國Corning公司; 鼠抗人β-Tubulin購自美國Santa Cruz公司; RNA抽提Trizol試劑由Takara中國大連有限公司生產(chǎn); 胎牛血清購自美國Gibco公司; PVDF膜購自美國Millipore公司; 引物合成購自南京金斯瑞生物科技公司; 鼠抗人ALKBH5抗體購自美國Sigma公司。

1.1.3 納入病例: 本實(shí)驗(yàn)采集2016年1月—2020年1月江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院收治的50例肝癌患者的肝癌組織，所有患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn): 在本科進(jìn)行手術(shù)治療者，手術(shù)病理結(jié)果為肝細(xì)胞癌者; 術(shù)前預(yù)計(jì)生存時(shí)間大于3月者。排除標(biāo)準(zhǔn): 已接受肝癌手術(shù)治療者; 已接受肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)治療或化療者; 合并其他惡性腫瘤疾病者。具體實(shí)施計(jì)劃、方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR): 細(xì)胞RNA提取的步驟參考Trizol試劑說明書，隨后進(jìn)行PCR建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線。qRT-PCR反應(yīng)條件: 98 ℃預(yù)變性30 s; 98 ℃變性10 s; 56 ℃退火30 s; 72 ℃延伸10 s，所有步驟40個(gè)循環(huán)，合成產(chǎn)物置于冰上保存。ALKBH5上游引物序列5′-CACATCCTGGAAGGCAGCAA-3′, 下游引物序列5′-CCCCCAAAGTGGTGGTATCC-3′。GAPDH上游引物序列5′-TGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3′, 下游引物序列5′-CTGGAAGATGGTGATGGGA-3′。本實(shí)驗(yàn)將目的基因表達(dá)量作為1, 數(shù)據(jù)結(jié)果用2-△△Ct表示,GAPDH作為內(nèi)參，所有樣品均有復(fù)孔, 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot): 轉(zhuǎn)染48 h后收集對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞, 100 ℃煮沸10 min, 12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min。10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 分離后的蛋白質(zhì)在低溫調(diào)節(jié)為300 mA電流移動(dòng)黏附到膜上; 轉(zhuǎn)膜2 h后，將膜取出，常溫下5%脫脂牛奶封閉1 h, 洗膜緩沖液(TBST)洗膜2次，根據(jù)分子量切下目標(biāo)蛋白所處膜，一抗4 ℃孵育過夜; 洗膜3次完成后，常溫下二抗孵育1 h, 結(jié)束后洗膜3次。濾紙吸干所有液體，滴上適量ECL發(fā)光液涂抹均勻，拍照、顯影、儲(chǔ)存。

1.2.3 Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn): 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒, 48 h后以0.25%胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次, 600轉(zhuǎn)/min離心4 min, 棄上清液。加600 μL無血清DMEM重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，將1×106細(xì)胞種入Transwell小室上層(遷移實(shí)驗(yàn)不含基質(zhì)膠，侵襲實(shí)驗(yàn)含有基質(zhì)膠)，小室下層加入500 μL含血清的DMEM, 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。36～48 h后將小室取出，吸盡培養(yǎng)基，將小室于4%多聚甲醛固定20 min, 結(jié)晶紫染色30 min, 觀察拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.2.4 免疫組化: 切片烤片并脫蠟，檸檬酸鹽修復(fù)抗原封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗免疫顯色試劑37 ℃孵育30 min, DAB染色，蘇木精復(fù)染，乙醇去水，中性膠密封，高倍顯微鏡視野下結(jié)合色澤強(qiáng)弱和陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)百分比實(shí)行半定量檢測。不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色則為3分；陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分, 5%～25%為1分, >25%～50%為2分, >50%～75%為3分, >75%～100%為4分。評(píng)分相乘作為分組標(biāo)準(zhǔn), 0分為陰性, 1～4分為弱陽性, 5～8分為陽性, 9～12分為強(qiáng)陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ALKBH5蛋白水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)免疫組化半定量將標(biāo)本分為高表達(dá)組(陽性和強(qiáng)陽性)、低表達(dá)組(陰性和弱陽性)。ALKBH5表達(dá)與臨床分期、腫瘤分化程度存在相關(guān)性(P<0.05), 與血清甲胎蛋白(AFP)水平、腫瘤大小、年齡、性別均無相關(guān)性(P>0.05), 見表1。

表1 ALKBH5蛋白水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2 ALKBH5在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及獲得穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株

qRT-PCR結(jié)果顯示，在肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721中,ALKBH5mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1、(2.47±0.35); 人正常肝細(xì)胞LO2中ALKBH5mRNA相對(duì)表達(dá)量為(3.87±0.55)。Western blot檢測結(jié)果見圖1A。

為了獲得穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞株，將已感染慢病毒的細(xì)胞用高濃度嘌呤霉素篩選，后將存活的細(xì)胞以低濃度嘌呤霉素維持培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，收獲蛋白質(zhì)及總RNA。HepG2和SMMC7721細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組(sh-ALKBH5)ALKBH5蛋白質(zhì)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); HepG2和SMMC7721細(xì)胞干擾組ALKBH5mRNA水平分別為(0.38±0.03)、(0.29±0.04), 均低于對(duì)照組(sh-EGFP), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 干擾效果明顯。見圖1B。

A: ALKBH5在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況; B: ALKBH5在肝癌細(xì)胞中敲低效率驗(yàn)證。與對(duì)照組比較, **P<0.01。圖1 在肝癌細(xì)胞中ALKBH5 mRNA表達(dá)和ALKBH5蛋白表達(dá)

2.3 下調(diào)ALKBH5基因促進(jìn)HepG2和SMMC7721細(xì)胞遷移、侵襲

Transwell遷移試驗(yàn)顯示, HepG2細(xì)胞中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的每高倍鏡視野(200倍)下穿透細(xì)胞數(shù)為(123±22)、(335±21)個(gè); SMMC7721細(xì)胞中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的每高倍鏡視野(200倍)下穿透細(xì)胞數(shù)為(220±27)、(453±23)個(gè)。Transwell侵襲試驗(yàn)顯示, HepG2細(xì)胞中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的穿透細(xì)胞數(shù)為(118±29)、(282±17)個(gè); SMMC7721細(xì)胞中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的穿透細(xì)胞數(shù)為(200±11)、(388±20)個(gè), 2組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。由此表明，下調(diào)ALKBH5基因，肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721細(xì)胞遷移和侵襲能力受到促進(jìn)。

A: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)ALKBH5對(duì)HepG2和SMMC7721細(xì)胞遷移能力的影響; B: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)ALKBH5對(duì)HepG2和SMMC7721細(xì)胞侵襲能力的影響。與sh-EGFP比較, **P<0.01, ***P<0.001。圖2 下調(diào)ALKBH5對(duì)HepG2和SMMC7721細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

2.4 下調(diào)ALKBH5基因促進(jìn)HepG2和SMMC7721細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)

下調(diào)ALKBH5表達(dá)水平后, Western blot檢測結(jié)果顯示，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin、Snail蛋白表達(dá)水平增高，說明下調(diào)ALKBH5表達(dá)水平促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的EMT。見圖3。

圖3 下調(diào)ALKBH5對(duì)HepG2和SMMC7721細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

N6-甲基腺嘌呤修飾是眾多轉(zhuǎn)錄后調(diào)控事件的一種，與其他RNA修飾相比，動(dòng)態(tài)可逆性調(diào)控使其具有獨(dú)特的生物學(xué)功能[6]。最新的m6A修飾測序技術(shù)[7-9]發(fā)現(xiàn)，大量m6A修飾位于長鏈的外顯子和終止密碼子附近, m6A修飾和其他mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾過程類似，如剪接除去內(nèi)含子、3′-端加上多聚核苷酸、5′-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)等，均是通過m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的修飾[10]。m6A修飾的調(diào)控是通過一些被稱為“書寫器”(writer)的甲基轉(zhuǎn)移酶，如甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(METTL3)、Wilms′腫瘤蛋白1相關(guān)蛋白(WTAP)和甲基轉(zhuǎn)移酶樣14(METTL14), 一些被稱為“擦除器”(eraser)的脫甲基酶，如脂肪量和肥胖相關(guān)基因(FTO)和ALKBH5, 以及一些被稱為“閱讀器”(reader)的識(shí)別蛋白，如YTH結(jié)構(gòu)域m6A RNA結(jié)合蛋白1(YTHDF1)、YTH結(jié)構(gòu)域m6A RNA結(jié)合蛋白2(YTHDF2), 以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)可逆的平衡[11]。研究[12-15]顯示，參與m6A修飾的各種元件一直被認(rèn)為和癌癥的發(fā)病有密切關(guān)系，如WTAP是白血病的一個(gè)關(guān)鍵性抗原;FTO基因突變會(huì)增高結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌的發(fā)生也與FTO等位基因的變異有直接關(guān)系;METTL3的磷酸化作用可以導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷和腫瘤形成。近年來研究[16]指出, m6A修飾在癌癥的初始階段和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程中扮演了非常重要的角色。

ALKBH5作為m6A修飾中非常重要的一個(gè)元件，與多種腫瘤的臨床預(yù)后有關(guān)，通過不同的分子機(jī)制影響腫瘤進(jìn)程。研究[17]發(fā)現(xiàn),ALKBH5過表達(dá)能夠降低干性基因胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵因子(NANOG)mRNA甲基化的水平，增加NANOG的表達(dá)以及乳腺癌干細(xì)胞的豐度，誘導(dǎo)缺氧表型的發(fā)生; 在乳腺癌干擾ALKBH5的水平后，裸鼠體內(nèi)腫瘤形成的能力明顯減弱[17]。另一研究[18]發(fā)現(xiàn),ALKBH5高表達(dá)與腦惡性膠質(zhì)患者的臨床預(yù)后有關(guān),ALKBH5通過提高叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(FoxM1)起始區(qū)域內(nèi)去甲基化水平，增高了FoxM1轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，誘導(dǎo)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的干性,ALKBH5-FoxM1軸在增殖及體內(nèi)成瘤過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。在胰腺癌中,ALKBH5可作用于LncRNA KCNK15-AS1, 進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力[19], 但其對(duì)肝癌細(xì)胞的影響及作用的相關(guān)報(bào)道較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌中ALKBH5蛋白表達(dá)與分化程度、臨床分期存在負(fù)相關(guān)，與性別、年齡、腫瘤大小、血清AFP水平均無相關(guān)性，提示ALKBH5與肝癌的臨床預(yù)后密切相關(guān);ALKBH5在2種肝癌細(xì)胞株中差異性表達(dá)，且顯著低于正常肝細(xì)胞LO2。本研究分別選擇2種不同的肝癌細(xì)胞系(HepG2和SMMC7721細(xì)胞)進(jìn)行基因沉默實(shí)驗(yàn)，以探討ALKBH5對(duì)肝癌細(xì)胞的影響; 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測了細(xì)胞遷移、侵襲能力變化。結(jié)果表明，抑制ALKBH5表達(dá), HepG2和SMMC7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，說明ALKBH5對(duì)于肝癌的遷移、侵襲作用有顯著影響，但其具體作用機(jī)制仍然不清楚。

EMT是一個(gè)特有過程，上皮細(xì)胞經(jīng)過一系列的分子生物改變，逐漸失去排列極性、細(xì)胞與細(xì)胞間存在緊密連接、附著力等特征，由不能移動(dòng)的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為具有遷移、侵襲的能力的間質(zhì)細(xì)胞。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要限速環(huán)節(jié)，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[20]。本研究表明，下調(diào)ALKBH5表達(dá)水平后，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin、Snail蛋白表達(dá)水平增高。E-cadherin的主要功能是維持上皮細(xì)胞形態(tài)完整性，其是存在于人和動(dòng)物上皮的一種鈣依賴性細(xì)胞黏附分子; E-cadherin可以在多個(gè)環(huán)節(jié)影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，表達(dá)減少或缺失可導(dǎo)致細(xì)胞失去原有的形態(tài)，細(xì)胞間相互融合能力下降，進(jìn)而移動(dòng)性增加; 在上皮性腫瘤中，突破上皮和基底膜的限制，通過內(nèi)滲進(jìn)入周圍組織細(xì)胞轉(zhuǎn)移或侵入淋巴管血管，這些血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞到達(dá)目的區(qū)域后，借助間質(zhì)上皮過程完成侵略過程，故E-cadherin是防止腫瘤向惡性轉(zhuǎn)化、發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的一種保護(hù)性因子[21]。Snail在病理狀態(tài)(尤其是癌癥中)常呈現(xiàn)過度表達(dá)狀態(tài)，研究[22]發(fā)現(xiàn), Snail的核轉(zhuǎn)運(yùn)參與調(diào)節(jié)EMT，可以特異性識(shí)別E-cadherin的啟動(dòng)子區(qū)域后結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平抑制其表達(dá)，繼而啟動(dòng)EMT。同時(shí), Snail可以聯(lián)合SMAD同源物3/SMAD同源物4(Smad3/Smad4)影響蛋白激酶B(AKT)與E-cadherin結(jié)合，表達(dá)水平受到核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad(TGF-β/Smad)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、糖原合酶激酶-3 (GSK-3β)等多條復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究未探討ALKBH5抑制EMT進(jìn)程的信號(hào)通路及具體機(jī)制，還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,ALKBH5與臨床預(yù)后密切相關(guān)，且能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT, 提示ALKBH5作為一種抑癌基因參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，但其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，通過靶向藥物來逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有望為肝癌治療提供新思路。