翁志華, 王 磊, 周 俊

(1. 江蘇省揚(yáng)州市第二人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225002;2. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225009)

在全球人類的惡性腫瘤中，肺癌發(fā)病率居首位，且其復(fù)發(fā)率和病死率也位居癌癥前列[1]。肺腺癌(LAC)是肺癌常見的病理類型，屬非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)范疇，其發(fā)病率和病死率逐年上升[2-3]。盡管醫(yī)學(xué)診療手段不斷進(jìn)步，但肺癌的診斷和治療效果還有待提高，故尋找新的肺癌診斷和預(yù)后判定指標(biāo)以及分子治療方案十分重要。小的非編碼RNA如微小RNA(miRNAs)、Piwi-相互作用RNA (piRNAs)、環(huán)狀RNA (circRNAs)和tRNA衍生的RNA碎片(tRFs)等與癌癥密切相關(guān)[4-6]。tRFs長(zhǎng)度為14～35 nt, 其在特定環(huán)境中總是從tRNA的5′端或3′端派生碎小片段。目前, tRFs的生物學(xué)功能仍然未知，其已逐步成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。Leu(CAG)-tRNA(tRF-LeuCAG)在NSCLC組織中表達(dá)水平高于癌旁正常組織，通過提高AURKA表達(dá)水平可加速細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，可以作為NSCLC分子標(biāo)志物[7]。本研究探討了tRF-LeuCAG在68例LCA組織中的作用和影響，發(fā)現(xiàn)tRF-LeuCAG在LAC中有促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、診斷及評(píng)估預(yù)后的作用。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本和資料收集

本研究的68對(duì)LAC組織和癌旁正常肺組織(距離癌灶周邊3 cm以上沒有腫瘤細(xì)胞的正常肺組織)為2018年1月—2019年4月?lián)P州大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除標(biāo)本?；颊吣挲g42～70歲，男40例，女28例。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 臨床、病理數(shù)據(jù)完整無缺失者; ② 經(jīng)病理學(xué)檢查確診為L(zhǎng)AC者; ③ 初治，術(shù)前未接受放化療、免疫治療等抗腫瘤治療者; ④ 患者知情同意，經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)備案。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 伴有其他惡性腫瘤者; ② 有重要器官功能障礙者; ③ 依從性較差者。所有患者臨床病理特征包括年齡、性別、吸煙、腫瘤大小、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(NM)和臨床TNM分期[分期標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版]。新鮮LAC組織采集后，除實(shí)驗(yàn)使用外，剩余組織放入液氮罐里，于-80 ℃冰箱內(nèi)長(zhǎng)期保存，以備后期實(shí)驗(yàn)所用。

1.2 細(xì)胞和質(zhì)粒

LAC細(xì)胞株A549、NCI-H1975和正常支氣管上皮細(xì)胞16HBE購自中科院上海生物細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS, HyClone公司)、120 IU/mL青霉素和120 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，加濕培養(yǎng)箱的溫度為37 ℃, 內(nèi)含5%二氧化碳。tRF-LeuCAG模擬物/抑制劑和陰性對(duì)照品(NC)均購自廣州RIBOBIO生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

使用InvitrogenTMLipofectamine 3000 (Life Technologies, 美國(guó))進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)實(shí)驗(yàn)說明書，將200 nmol/L的tRF-LeuCAG實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的產(chǎn)品(RIBOBIO, 廣州)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24～48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理，其中包括增殖和細(xì)胞周期分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

LAC標(biāo)本和細(xì)胞總RNA分離使用TRIzol試劑(Invitrogen公司)，得到的總RNA的光密度(OD)260 nm/OD230 nm值大于1.8。根據(jù)試劑盒說明書使用Takara公司的PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Takara)的步驟操作說明，在Applied Biosystems 7500 PCR儀器上進(jìn)行qRT-PCR。tRF-LeuCAG上游引物為GCCGAGCGGTCTAAGGCGC, 下游引物為通用引物。tRF-LeuCAG的相對(duì)定量是通過內(nèi)參U6表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化獲得。U6上游引物為AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG, 下游引物為CAGTGCAGGGTCCGAGGT。

1.5 RNA原位分子雜交(RISH)檢測(cè)tRF-LeuCAG的表達(dá)

68例LAC組織及癌旁正常組織石蠟包埋后，組織切片脫蠟至水。室溫下H2O2處理后，使用胃蛋白酶消化組織切片以便暴露核苷酸片段。滴加預(yù)雜交液放置培養(yǎng)箱中孵育組織切片，然后加入雜交液孵育12 h。清洗后加入密封液。加入生物素化地高辛。組織中加入鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)。加入生物素化過氧化物酶。組織進(jìn)行DAB染色、蘇木精復(fù)染、洗滌、脫水、透明、封閉。用預(yù)雜交液代替含有探針的雜交液作為空白對(duì)照，探針序列為GTCAGGATGGCCGAGCGGTCTAAGGCGC。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)tRF-LeuCAG對(duì)LAC細(xì)胞的遷移情況

各組肺癌細(xì)胞分別用無血清DMEM培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液(約含1 × 105個(gè)細(xì)胞)。將0.2 mL細(xì)胞懸液吸取至Transwell小室的上室內(nèi)，并將20%FBS的DMEM培養(yǎng)液0.6 mL吸至Transwell小室的下室內(nèi)，置于有濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24～48 h。小室取出后用棉簽擦掉沒穿膜的肺癌細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后添加95%乙醇固定20 min, 再用結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目，分析肺癌細(xì)胞的遷移情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 tRF-LeuCAG在LAC中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明, 68例LAC組織中tRF-LeuCAG的表達(dá)量為(6.76±1.39), 癌旁正常組織(NC)中的表達(dá)量為(3.52±1.02)，提示LAC組織中tRF-LeuCAG表達(dá)水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。在淋巴結(jié)(NM)轉(zhuǎn)移方面，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(NM+,n=29)tRF-LeuCAG表達(dá)量為(7.76±1.93), 高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(NM-,n=39)的(2.52±1.12), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。tRF-LeuCAG的表達(dá)與LAC的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05), 但與年齡、性別、吸煙、腫瘤直徑、腫瘤分級(jí)及TNM分期無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

與對(duì)應(yīng)組織比較, *P<0.05。圖1 tRF-LeuCAG在不同組織中的表達(dá)量

表1 tRF-LeuCAG表達(dá)水平與LAC臨床病理特征的關(guān)系

2.2 tRF-LeuCAG在LAC中的陽性表達(dá)情況

采用RISH檢測(cè)68對(duì)LAC組織和癌旁肺組織中 tRF-LeuCAG的陽性表達(dá)情況。RISH結(jié)果表明，在LAC中RF-LeuCAG主要為陽性表達(dá)，陽性顆粒為棕黃(褐)色，大小不一、顏色深淺不一，分布在細(xì)胞質(zhì)(漿)中，見圖2。在LAC組織中tRF-LeuCAG的陽性率為73.53%(50/68), 高于鄰近正常肺組織的13.24%(9/68), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.246,P=0.022), 見表2。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次驗(yàn)證了tRF-LeuCAG在LAC中表達(dá)水平上調(diào)。

A、B: LAC組織中tRF-LeuCAG陽性表達(dá)圖; C: LAC組織中tRF-LeuCAG陰性表達(dá)圖; D、E: 癌旁正常肺組織中tRF-LeuCAG陰性表達(dá)圖; F: 癌旁正常肺組織中tRF-LeuCAG陽性表達(dá)圖。B、E放大倍數(shù)為400倍,其余放大倍數(shù)為200倍。圖2 tRF-LeuCAG在LAC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

表2 tRF-LeuCAG和CEA表達(dá)水平對(duì)肺腺癌的診斷價(jià)值

2.3 tRF-LeuCAG和癌胚抗原(CEA)表達(dá)水平對(duì)LAC的診斷價(jià)值

CEA是LAC常用的腫瘤檢測(cè)標(biāo)志物，故本研究將CEA作為對(duì)比參數(shù)。ROC曲線結(jié)果顯示，在LAC組織中tRF-LeuCAG和CEA診斷效能指標(biāo)見表2、圖3, 提示tRF-LeuCAG和CEA在LAC組織中診斷效能幾乎一致，推測(cè)tRF-LeuCAG未來可能成為新的LAC檢測(cè)生物分子標(biāo)志物。

圖3 tRF-LeuCAG和CEA水平診斷LAC的ROC曲線

2.4 tRF-LeuCAG與LAC患者生存預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)qRT-PCR結(jié)果, 68例LAC組織中tRF-LeuCAG表達(dá)水平(大于其在癌旁正常組織的表達(dá)水平)升高的病例有53例(升高組)，其余表達(dá)水平正?；蛳陆档牟±?5例(正常和下降組)。升高組的3年中位總生存時(shí)間(OS)為14個(gè)月(四分位區(qū)間為 6～28個(gè)月)，正常和下降組中位OS為22個(gè)月(四分位區(qū)間為11～36個(gè)月)。升高組OS短于正常和下降組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.72,P=0.002;HR=2.968, 95%CI為1.669～5.277), 見圖4。

圖4 tRF-LeuCAG表達(dá)水平與患者3年預(yù)后的生存曲線圖

2.5 tRF-LeuCAG促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移

上述研究表明tRF-LeuCAG與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究tRF-LeuCAG對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移的影響。首先通過qRT-PCR驗(yàn)證過表達(dá)tRF-LeuCAG(過表達(dá)組)和降低tRF-LeuCAG表達(dá)(降低表達(dá)組)的有效性(圖5A、5B)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5C、5D), 過表達(dá)tRF-LeuCAG促進(jìn)了肺癌細(xì)胞A549和NCI-H1975的遷移，而降低tRF-LeuCAG表達(dá)則阻礙了遷移(P<0.05), 提示tRF-LeuCAG能促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移，進(jìn)而向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。

A、B: qRT-PCR證實(shí)tRF-LeuCAG在A549和NCI-H1975細(xì)胞中過度表達(dá)或降低表達(dá)有效; C、D: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549和H1650細(xì)胞的遷移情況。與對(duì)照組比較, *P<0.05。圖5 tRF-LeuCAG促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移(放大倍數(shù)400倍)

3 討 論

目前，肺癌發(fā)病率居各類腫瘤首位，也是癌癥死亡的常見類型[8-9]。肺癌患者死亡的原因主要為肺癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥性[10], 因此尋找肺癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物變得越來越迫切。

轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNAs)是一種經(jīng)典的非編碼RNA，能將信使RNA (mRNA)上的遺傳信息轉(zhuǎn)化為氨基酸序列信息，從而合成蛋白質(zhì)。在內(nèi)分泌失調(diào)、缺氧等應(yīng)激條件作用下，tRNA裂解出許多碎片，包括tiRNAs和tRFs。研究[11-13]表明tRNA片段可作為信號(hào)分子和基因表達(dá)的調(diào)控因子，在腫瘤、代謝性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等重大疾病中具有重要的調(diào)控作用。在肺癌研究中，無論是在患者血漿還是在肺癌組織中，正常人和LAC患者的tRNA片段分布都存在顯著差異，其中tRF-16-L85J3KE、tRF-21-RK9P4P9L0和tRF-16-PSQP4PE參與了許多癌癥的信號(hào)途徑，能作為新的診斷生物標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)[14]。一項(xiàng)研究[15]通過基因測(cè)序驗(yàn)證了3個(gè)tRF(tRF-Ser-TGA-010、tRF-Arg-CCT-018和tRF-Val-CAC-017)在LAC組織中呈低表達(dá)水平，這些下調(diào)的tRF-1可能參與LAC的發(fā)病機(jī)制，并可能作為潛在的生物診斷標(biāo)志物，或協(xié)調(diào)藥物開發(fā)的靶基因。研究[7]發(fā)現(xiàn), tRF-LeuCAG表達(dá)水平升高并在NSCLC中得到了驗(yàn)證; 在肺癌細(xì)胞H1299功能研究中得出抑制tRF-LeuCAG的表達(dá)則能抑制細(xì)胞增殖并阻礙細(xì)胞周期; tRF-LeuCAG可能參與調(diào)節(jié)NSCLC的發(fā)生并可能成為NSCLC潛在的治療靶點(diǎn)。然而，關(guān)于tRF-LeuCAG調(diào)控LAC細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的影響和作用，以及其能否作為診斷和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)的研究較少。

本研究通過qRT-PCR和RISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，tRF-LeuCAG在LAC組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，即tRF-LeuCAG表達(dá)水平越高，LAC的分化程度越低，且患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性就越大。過表達(dá)tRF-LeuCAG促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移，降低tRF-LeuCAG表達(dá)則抑制了細(xì)胞的遷移。這些結(jié)果表明在LAC的發(fā)生發(fā)展過程中, tRF-LeuCAG可能起到促癌基因和促遷移、轉(zhuǎn)移的作用。ROC曲線分析表明, tRF-LeuCAG和CEA的診斷效能基本一致，推測(cè)tRF-LeuCAG也可能在不久的將來作為L(zhǎng)AC診斷的一種新的分子標(biāo)志物。本研究與相關(guān)研究[4, 13]均證實(shí)tRNA碎片可能會(huì)成為腫瘤的診斷指標(biāo)。本研究結(jié)果表明, tRF-LeuCAG升高組的3年OS為14個(gè)月，而正常和下降組中位OS為22個(gè)月，升高組OS顯著短于正常和下降組。這一結(jié)果再次證實(shí)了檢測(cè)tRF-LeuCAG表達(dá)對(duì)提高LAC治療效果和預(yù)后評(píng)估有重要的臨床意義。此外, tRF-LeuCAG表達(dá)也與腫瘤的分化相關(guān)，而分化也反映了腫瘤的惡性程度和預(yù)后: 分化越低的腫瘤組織越會(huì)出現(xiàn)tRF-LeuCAG高表達(dá)，因而LAC惡性程度高，患者預(yù)后差、生存時(shí)間較短; 高表達(dá)的tRF-LeuCAG預(yù)示著腫瘤細(xì)胞容易有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同樣患者預(yù)后較差，與相關(guān)研究[7, 14]結(jié)果相一致。上述結(jié)果表明tRF-LeuCAG可作為L(zhǎng)AC患者預(yù)后評(píng)估的一個(gè)的強(qiáng)有力的生物學(xué)指標(biāo)。但本研究存在一定局限性，僅研究了tRF-LeuCAG對(duì)診斷和預(yù)后的影響以及對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的作用，沒有研究tRF-LeuCAG對(duì)轉(zhuǎn)移作用的具體調(diào)控機(jī)制，這將會(huì)在今后的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探討。

綜上所述，檢測(cè)tRF-LeuCAG在LAC組織中的表達(dá)具有臨床病理意義，該指標(biāo)未來可能成為L(zhǎng)AC患者診斷、生存期評(píng)估的新型標(biāo)志物。本研究為尋找LAC個(gè)性化治療和診斷、預(yù)后評(píng)估指標(biāo)提供了有臨床價(jià)值的理論依據(jù)。