劉佳存 王瑞娜 呂權(quán)真 閻瀾

(海軍軍醫(yī)大學藥學系軍特藥研究中心，上海 200433)

目前常用的抗真菌藥包括唑類、棘白菌素類、多烯類以及嘧啶類似物等，但由于抗真菌藥物的長期使用以及白念珠菌自身較強的環(huán)境適應能力，白念珠菌的耐藥問題使臨床治療面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)[1]。本文就白念珠菌耐藥機制研究進展進行綜述。

1 藥物靶點突變或上調(diào)

1.1 唑類藥物靶點

唑類藥物以白念珠菌ERG11編碼的羊毛甾醇14α去甲基酶(Erg11p)為靶點，通過抑制真菌細胞膜麥角甾醇的生物合成產(chǎn)生抑菌作用。

由堿基突變引起的氨基酸替換可降低Erg11p與唑類藥物親和力，這是白念珠菌對唑類藥物產(chǎn)生抗性的常見機制。目前發(fā)現(xiàn)與白念珠菌耐藥性相關(guān)的Erg11p氨基酸取代位點主要包括：Y118A、F126V、Y132F、Y132H、K143R、F145L、P230L、Y257H、D278N、S279F、G307S、S405F、V437I、Y447H、G448E、F449Y、G450E、V456I、G464S、R467K、I471T、Q474K、V488I[4]、D116E、K128T、V159I、E266D[5]。

在白念珠菌中，鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Upc2p在唑類抗真菌藥物作用下可調(diào)節(jié)ERG11和其他參與麥角甾醇生物合成的基因(ERG1、ERG3、ERG4等)的表達。UPC2的功能獲得性突變(gain of function, GOF)可導致ERG11等表達增加，使白念珠菌對氟康唑產(chǎn)生耐藥性[6]。

1.2 棘白菌素類藥物靶點

棘白菌素類藥物以β-1, 3-D-葡聚糖合成酶的Fks1亞基為靶點，通過抑制β-1, 3-D-葡聚糖的合成從而破壞白念珠菌細胞壁的完整性。與野生型菌株相比，F(xiàn)KS1熱點區(qū)域(hot spot, HS)突變的白念珠菌葡聚糖合成酶的合成能力降低且對棘白菌素類耐藥[7]，且當耐藥菌細胞壁中的幾丁質(zhì)含量升高時，可進一步增強其對棘白菌素類藥物的耐藥[8]。

然而，Spettel等[9]對115株耐米卡芬凈的白念珠菌FKS1的HS1、HS2和HS3區(qū)進行突變篩查，均未發(fā)現(xiàn)這些熱點區(qū)域存在錯義突變，這提示除了FKS突變之外可能還存在其他棘白菌素類藥物耐藥機制有待進一步闡明。

2 外排泵基因表達增加

白念珠菌CDR1、CDR2和MDR1基因表達增加可以有效降低細胞內(nèi)的藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥[10-11]。Tac1p為調(diào)控能量依賴的轉(zhuǎn)運蛋白超家族(ATP-binding cassette, ABC)的關(guān)鍵因子，TAC1發(fā)生GOF(如H741D)可上調(diào)CDR1和CDR2的表達，介導唑類耐藥性的產(chǎn)生[12]。

Flo8p在白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)LO8缺失可引起白念珠菌CDR1和CDR2過表達，并導致對唑類藥物耐藥[13]。鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Mrr1p以及bZip轉(zhuǎn)錄因子Cap1p可調(diào)控MDR1的表達，Mrr1p和Cap1p的功能獲得性突變均可上調(diào)MDR1的表達從而導致白念珠菌耐藥[14-16]。此外，轉(zhuǎn)錄因子Mrr2p可上調(diào)CDR1的表達，從而導致白念珠菌對氟康唑耐藥[17]。但近期有研究認為，白念珠菌中野生型或突變型MRR2的過表達并不影響其CDR1的表達以及對氟康唑的敏感性[18]。

zi=β0+β1x1i+β2x2i+β3x3i+β4x4i+β5x5i+β6x6i+β7x7i+β8x8i

ABC轉(zhuǎn)運蛋白Mlt1p定位于白念珠菌的液泡膜，可特異性地將磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運到液泡腔。Mlt1p可將進入到胞漿內(nèi)的唑類藥物轉(zhuǎn)運到液泡中，從而降低細胞內(nèi)藥物的有效濃度以降低藥物毒性[19]，當Mlt1p第765位苯丙氨酸的缺失可導致Mlt1p的定位改變，失去原有抗唑類藥物的能力。

位于白念珠菌質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白CDR6/ROA1能夠外排小檗堿、羅丹明等外源物質(zhì)，CDR6/ROA1缺失突變株可通過激活TOR信號通路以及增加細胞膜的硬度，從而減少細胞內(nèi)唑類藥物的累積，導致菌株對唑類藥物耐藥[20]。

3 生物膜的形成

生物膜為高度組織化的微生物群落，通常被細胞外基質(zhì)所包圍。細胞外基質(zhì)既可以阻止抗真菌藥物滲透進入細胞內(nèi)，也可以抵抗宿主的免疫攻擊。因此，白念珠菌生物被膜的形成增加了治療難度，同時也是其致病的主要毒力因素之一[21]。過表達FKS1的生物膜對棘白菌素類和多烯類藥物的耐藥性增加，提示念珠菌生物膜葡聚糖隔離是一種多藥耐藥機制[22]。

有研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性念珠菌病患者機體內(nèi)白念珠菌生物膜形成可通過抑制中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NET)的形成對中性粒細胞的活性產(chǎn)生抑制作用[23]。

4 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶

真核生物鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種鈣調(diào)素激活的高度保守的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶，是由催化亞基A(calcineurin A, CNA)和調(diào)節(jié)亞基B(calcineurin B, CNB)組成的雜二聚體。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶作為細胞內(nèi)信號通路的重要組成部分，參與了包括真菌菌絲生長、耐藥、毒力、應激反應等多種生理過程，同時還參與介導了生物被膜對氟康唑的耐藥性[24]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑他克莫司(FK506)和環(huán)孢素A(CsA)對耐藥白念珠菌有較強的協(xié)同作用[24-25]。鈣通道拮抗劑氨氯地平與氟康唑聯(lián)合應用，可通過下調(diào)CNA1和CNB1對耐藥白念珠菌有協(xié)同作用[26]。

熱休克蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號網(wǎng)絡(luò)中的一個重要靶點，它是白念珠菌應激反應中一個關(guān)鍵的細胞調(diào)節(jié)因子，Hsp90抑制劑格爾達霉素(geldanamycin, GDA)可以顯著提高耐棘白菌素的白念珠菌對米卡芬凈和卡泊芬凈的敏感性[27]。

5 代謝改變

大多數(shù)與白念珠菌唑類耐藥相關(guān)的潛在生物標志物涉及氨基酸代謝、磷脂代謝等代謝過程，與減少內(nèi)源性活性氧的產(chǎn)生，改變細胞膜和線粒體的功能等相關(guān)。

5.1 生物標志物

通過代謝組學分析發(fā)現(xiàn)20種代謝物是與耐藥性水平相關(guān)的潛在生物標志物。在耐唑類藥物的白念珠菌中，甘油磷膽堿、谷胱甘肽、次黃嘌呤等13個標志物表達上調(diào)，而乳酸鹽、肌醇、精胺等表達減少，其中谷胱甘肽、多胺和3-羥基犬尿氨酸的調(diào)節(jié)會減少細胞內(nèi)的活性氧，從而降低真菌對藥物的敏感性[28]。

5.2 磷脂代謝改變

鞘磷脂是真菌細胞膜的主要成分，與唑類和多烯類抗真菌藥物的靶標麥角甾醇在功能上相互作用。Gao等[29]通過構(gòu)建fen1Δ/Δ和fen12Δ/Δ突變株分別驗證了這兩個菌株對氟康唑的抗性顯著升高。質(zhì)譜分析表明，這兩個突變體的細胞鞘脂組成都發(fā)生了變化，包括脂肪酸鏈較短的幾種甘露糖硫代磷酸酰胺的水平大幅增加，這種抗性依賴于鞘脂生物合成基因的上調(diào)，揭示了鞘脂代謝在唑類耐藥性產(chǎn)生中的作用。

6 線粒體功能改變

白念珠菌有三種特定的呼吸途徑:經(jīng)典呼吸鏈、替代呼吸鏈和平行電子傳遞鏈。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，用氰化物阻斷白念珠菌經(jīng)典呼吸途徑可誘導替代呼吸，同時增加對唑類藥物的耐藥性；用水楊基異羥肟酸(SHAM)抑制抗氰呼吸的替代氧化酶(alternative oxidase，Aox)則會增加白念珠菌對唑類藥物的敏感性。通過對Aox的誘導和抑制表明，在白念珠菌中替代呼吸途徑有助于形成唑類藥物的耐藥性[30]。Aox酶是真菌特異性的，因此是抗真菌藥物理想靶點。

FZO1是白念珠菌線粒體發(fā)揮生物功能的關(guān)鍵成分。通過對fzo1Δ/Δ菌株的全基因組表達譜分析發(fā)現(xiàn)該菌株Cdr1p遷移至液泡，導致細胞膜上Cdr1p外排泵的活性降低，麥角甾醇生物合成途徑的基因下調(diào)以及細胞麥角甾醇水平相應降低，從而增加了對唑類藥物的敏感性[31]。而正常白念珠菌可能通過改變線粒體的有氧呼吸代謝，增加ATP的產(chǎn)生，減少ROS的產(chǎn)生，從而增強外排泵的活性，進而降低對氟康唑的敏感性[32]。

7 選擇性剪接

選擇性剪接(alternative splicing，AS)是指從一個mRNA前體中通過不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點組合)產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程，是真核生物中單個基因產(chǎn)生不同蛋白亞型的過程，真核基因中內(nèi)含子的存在是選擇性剪接的分子基礎(chǔ)。

Suraya等[33]對來自相同基因、對唑類藥物敏感和耐藥的白念珠菌的RNA進行測序，發(fā)現(xiàn)ARC19、PHA2和SOD3等14個基因的剪接異構(gòu)體表達存在差異，且所有基因的剪接異構(gòu)體在耐藥菌株中的表達增加，說明剪接異構(gòu)體在獲得性耐藥性過程中的功能十分重要。

8 非整倍體

微生物對一種環(huán)境的適應往往會影響到對另一種環(huán)境的適應性，這種現(xiàn)象稱為交叉適應(cross adaptation)。Yang等[34]發(fā)現(xiàn)，在含有抗癌藥物羥基脲(HU)環(huán)境中存活的白念珠菌同時也可獲得對卡泊芬凈的耐藥性，這種交叉適應的獲得與白念珠菌2號染色體三倍體的產(chǎn)生有關(guān)；白念珠菌5號染色體單體可導致對氟康唑和卡泊芬凈耐藥性。此外，我們課題組還發(fā)現(xiàn)白念珠菌R染色體三體突變可導致對唑類藥物的耐藥性[35]。

9 微量元素

在白念珠菌中，鎂(Mg)在細胞信號轉(zhuǎn)導、氧化磷酸化等生理中發(fā)揮重要作用，缺鎂不僅會影響細胞膜外排泵的活性，還會增強對抗真菌藥物的敏感性[36]。銅可以特異性增強氟康唑的抗真菌活性[37]，白念珠菌銅敏感轉(zhuǎn)錄因子Mac1p通過控制銅的攝入來調(diào)控細胞對銅饑餓的反應，而mac1Δ/Δ菌株比其親本菌株對氟康唑更敏感[38]。

10 微生物菌群

人體的微生物菌群包含細菌、真菌和病毒等多種微生物，不同菌種之間可利用群體感應(quorum sensing, QS)而相互影響。近期研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌的QS因子N-(3-氧碘癸酰)-L-高絲氨酸內(nèi)酯可通過逆轉(zhuǎn)抗真菌藥物對麥角甾醇生物合成途徑的影響，誘導白念珠菌對氟康唑產(chǎn)生耐藥性[39]。

11 展望與小結(jié)

綜上所述，白念珠菌耐藥問題并非由簡單的單一因素引起，其原因往往涉及到多種機制。除藥物靶點突變或上調(diào)、藥物外排增加、生物被膜形成等經(jīng)典機制外，代謝調(diào)節(jié)、線粒體功能改變、選擇性剪切等機制也受到了廣泛關(guān)注。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)了一些有抗耐藥真菌活性的化合物，但往往都是通過這些化合物來尋找相關(guān)靶點，鮮有通過新發(fā)現(xiàn)的耐藥靶點設(shè)計合成新穎結(jié)構(gòu)先導化合物的研究。隨著白念珠菌耐藥機制研究的不斷發(fā)展和深入，全新的耐藥機制和藥物靶點被不斷闡釋和開發(fā)，有望為研究全新結(jié)構(gòu)的抗真菌藥物和開發(fā)更多有效的抗耐藥真菌策略提供新的方法與思路。