高麗 趙自屹 樊紅麗 張桂仙 李正倫

(1.云南省傳染病醫(yī)院 云南省艾滋病關(guān)愛中心，昆明 650301；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500；4.保山市人民醫(yī)院感染科，保山 678000)

截止2020年底，云南省累計(jì)治療艾滋病患者(AIDS)共計(jì)138 364人，累計(jì)死亡17 564人，正在治療113 478人。結(jié)核、隱球菌病、馬爾尼菲籃狀菌病是東南亞國家艾滋病患者排名前三的機(jī)會(huì)性感染[1-2]。隱球菌可以感染人體的任何組織和臟器，最常見有臨床癥狀的部位是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其次為肺部和皮膚。目前，在免疫抑制患者中，隱球菌感染的發(fā)病率為5%～10%，在AIDS患者中，隱球菌的感染率高達(dá)30%；而在免疫功能正常的人群中，隱球菌的感染率約為十萬分之一[3]。引起人類感染的隱球菌主要是新生隱球菌和格特隱球菌，在中國，隱球菌性腦膜腦炎多由新生隱球菌引起[4]。隱球菌所致感染易被誤診，病程長(zhǎng)，治療棘手，病死率高。本研究對(duì)我院11年來分離的424株新生隱球菌進(jìn)行鑒定與藥敏結(jié)果、臨床資料、患者治療、轉(zhuǎn)歸情況進(jìn)行分析，以期為隱球菌感染的診治及預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

我院2010年1月至2020年12月共培養(yǎng)出429株隱球菌，其中424株為新生隱球菌，5株為格特隱球菌(本文不做統(tǒng)計(jì))。424株新生隱球菌分離自住院艾滋病患者標(biāo)本，患者來自云南省16個(gè)地州市。同一患者相同標(biāo)本分離的新生隱球菌均進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，經(jīng)比較檢測(cè)結(jié)果相同，僅納入1次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同一患者不同樣本分離的新生隱球菌均納入研究。質(zhì)控菌株為克柔假絲酵母菌ATCC6258和近平滑假絲酵母菌ATCC22019。

1.2 菌株復(fù)蘇培養(yǎng)與鑒定

將-80℃保存的臨床分離新生隱球菌菌株置于20℃復(fù)蘇24 h，使其恢復(fù)繁殖活力。在無菌條件下，將其轉(zhuǎn)種至沙堡弱培養(yǎng)基(SGC)上，35℃孵育培養(yǎng)48～72 h，形成肉眼可見的菌落，然后進(jìn)行菌種復(fù)核鑒定。復(fù)核鑒定由本院微生物室工作人員參照全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第四版要求[5]，即根據(jù)菌落生長(zhǎng)特征、鏡下形態(tài)及生化反應(yīng)，結(jié)合VITEK2 YST卡進(jìn)行菌種鑒定(結(jié)合墨汁染色，同時(shí)采用真菌ITS分子檢測(cè)進(jìn)行復(fù)核)。

1.3 藥敏試驗(yàn)

采用ATB FUNGUS 3試劑條(法國生物梅里埃公司)以標(biāo)準(zhǔn)化微量肉湯稀釋法檢測(cè)新生隱球菌對(duì)5種常用抗真菌藥物的敏感性。5-氟胞嘧啶與氟康唑折點(diǎn)參考范圍見參考文獻(xiàn)[6]，與兩性霉素B三種藥物的判定標(biāo)準(zhǔn)均參考ATB FUNGUS 3真菌藥敏試劑盒說明書。伊曲康唑和伏立康唑直接報(bào)告最低抑菌濃度(minmum inhibitory concentration，MIC)。在藥敏板中，各抗真菌藥物及范圍分別為5-氟胞嘧啶4～16 μg/mL，兩性霉素B 0.5～16 μg/mL，氟康唑1～128 μg/mL，伊曲康唑0.125～4 μg/mL，伏立康唑0.06～8 μg/mL。

1.4 結(jié)果判讀

藥物敏感性判斷參考ATB FUNGUS 3真菌藥敏試劑盒說明書和新生隱球菌顯色微量肉湯稀釋法藥敏流行病學(xué)折點(diǎn)[6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)5種抗真菌藥物的MIC50、MIC90和MIC均數(shù)進(jìn)行分析。不同時(shí)間段隱球菌MIC值的比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)，不同時(shí)間段MIC值的兩兩比較采用秩變換結(jié)合完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本來源

共收集2010年1月—2020年12月自云南省傳染病醫(yī)院住院艾滋病患者臨床各類標(biāo)本分離的新生隱球菌共424株，標(biāo)本來源見表1。以腦脊液檢出比例最高，占62.50%(265/424)；其次是血液，占30.90%(131/424)；第三是痰液，占2.83%(12/424)；第四是骨髓，占1.88%(8/424)；胸水、尿液、活組織、棉拭子標(biāo)本中也偶有檢出。

表1 424株新生隱球菌標(biāo)本來源分布Tab.1 Distribution of specimen sources of 424 strains of C. neoformans

2.2 抗真菌藥物的敏感性

5種常用抗真菌藥物對(duì)新生隱球菌的MIC值藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，424株新生隱球菌對(duì)唑類抗真菌藥物伊曲康唑和伏立康唑MIC均≤2 μg/mL，多烯類的兩性霉素B MIC≤4 μg/mL，氟康唑及5-氟胞嘧啶的MIC≤64 μg/mL，見表2(5-氟胞嘧啶的藥敏梯度只有兩孔：4和16 μg/mL，>16 μg/mL的未能定量)。從時(shí)間角度分析，5種抗真菌藥物對(duì)424株新生隱球菌的MIC均數(shù)隨時(shí)間變化趨勢(shì)不規(guī)則，但總體呈下降趨勢(shì)；2020年由于受新冠肺炎疫情的影響，患者數(shù)量偏少不具統(tǒng)計(jì)意義(見表3)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同時(shí)間段組5-氟胞嘧啶對(duì)隱球菌分離株的MIC值差異為χ2=10.316，P=0.006，兩性霉素B者χ2=1.438，P=0.487，氟康唑者χ2=53.957，P<0.001，伊曲康唑者χ2=71.630，P<0.001，伏立康唑者χ2=52.053，P<0.001，MIC值的差異除兩性霉素B外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 五種抗真菌藥物對(duì)新生隱球菌的MIC值Tab.2 The MICs of 5 antifungal agents against C. neoformans (μg/mL)

表3 不同監(jiān)測(cè)時(shí)間段抗真菌藥物對(duì)新生隱球菌MIC值Tab.3 The MICs of the antifungal drugs against C. neoformans isolates at different surveillance time points (μg/mL)

新生隱球菌對(duì)5種抗真菌藥物的敏感性分析424株臨床分離的新生隱球菌對(duì)兩性霉素B的敏感性最高，為95.28%(404/424)；氟康唑次之，為80.66%(342/424)；5-氟胞嘧啶最差，為75.71%(321/424)；伊曲康唑和伏立康唑目前無針對(duì)新生隱球菌敏感性的判斷標(biāo)準(zhǔn)(見表4)。

表4 424株新生隱球菌對(duì)5種抗真菌藥物的藥敏結(jié)果Tab.4 In vitro susceptibility of 424 strains to 5 antifungal agents [%(株)]

2.3 云南省新生隱球菌流行病學(xué)折點(diǎn)

不同藥物MIC分布基本呈正態(tài)分布(5-氟胞嘧啶和兩性霉素B因?yàn)?4 μg/mL和<0.5 μg/mL之下未在細(xì)分，有本實(shí)驗(yàn)室另一研究[7]亦證明呈正態(tài)分布)，但5-氟胞嘧啶和氟康唑的MIC分布明顯高于其他3種抗真菌藥物。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各藥物的流行病學(xué)折點(diǎn)分別為：5-氟胞嘧啶和氟康唑——16 μg/mL；兩性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑——0.5 μg/mL。根據(jù)流行病學(xué)折點(diǎn)，5種藥物野生型菌株的累積百分率均>95.00%，見圖1。

圖1 5種抗真菌藥物對(duì)新生隱球菌菌株MIC值分布、流行病學(xué)折點(diǎn)以及野生型菌株累積百分率Fig.1 The MIC,ECVs against C. neoformans and the cumulative percentages of wild strains

2.4 治療與轉(zhuǎn)歸

隱球菌性腦膜腦炎誘導(dǎo)期抗真菌治療首選兩性霉素B與5-氟胞嘧啶聯(lián)合，但在臨床實(shí)際診療中會(huì)綜合各方面的因素，如采取氟康唑、5-氟胞嘧啶、兩性霉素B的單藥治療；氟康唑聯(lián)合5-氟胞嘧啶治療；兩性霉素B聯(lián)合5-氟胞嘧啶及氟康唑治療等方案。在這些抗真菌藥治療的同時(shí)會(huì)用甘露醇等藥物脫水降顱壓，使用糖皮質(zhì)激素抑制炎癥反應(yīng)(艾滋病患者慎用)等。424株臨床分離的新生隱球菌來自317例患者，均經(jīng)病原學(xué)確診，其中101例為2種以上類型標(biāo)本均培養(yǎng)出新生隱球菌。317例患者中，除未治療即轉(zhuǎn)院26例，死亡12例，放棄治療38例，好轉(zhuǎn)出院241例，治愈率為82.82%(241/291)。

在兩性霉素B或氟康唑耐藥的30例患者中，放棄治療3例，死亡2例，轉(zhuǎn)院5例，余下的20例患者臨床醫(yī)生在獲得藥敏結(jié)果之后及時(shí)更換用藥方案，患者積極配合服藥的基礎(chǔ)上病情得到控制好轉(zhuǎn)出院。

3 討 論

新生隱球菌為條件致病真菌，主要感染免疫力低下或免疫缺陷人群。臨床表現(xiàn)復(fù)雜，常以亞急性或慢性起病，誤診率極高，據(jù)國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，誤診疾病達(dá)38種[8]。隱球菌感染最初吸入肺，通常由血行播散到腦和腦膜。在許多艾滋病患者中，隱球菌病是首發(fā)表現(xiàn)，由于新生隱球菌感染的表現(xiàn)復(fù)雜且不具有特異性，許多臨床醫(yī)生對(duì)該菌引起的感染認(rèn)識(shí)不足，加之艾滋病合并多系統(tǒng)機(jī)會(huì)性混合感染，常掩蓋病情，造成誤診、漏診，因此在艾滋病患者診療過程中，應(yīng)不忘隱球菌病。

本研究結(jié)果顯示新生隱球菌陽性標(biāo)本以腦脊液和血液為主(腦脊液與血液同時(shí)檢出不剔，故采用菌株總數(shù)計(jì)算)，占93.40%(395/424)；痰液的檢出率次之，占3.79(12/317)；骨髓的檢出率第三，占2.52%(8/317)。這與我院患者主要以隱球菌性腦膜腦炎為主相一致；其次隱球菌感染患者血流感染的比例不低；在痰中檢出隱球菌的比例近3年有上升趨勢(shì)，提示隱球菌性腦膜腦炎患者可能同時(shí)并發(fā)肺隱球菌病，臨床醫(yī)生在今后的診療中要提高痰液標(biāo)本查隱球菌的送檢比例。據(jù)報(bào)道，新生隱球菌在廣西[9]、云南[10]以及長(zhǎng)沙[11]地區(qū)艾滋病患者骨髓標(biāo)本中的檢出率為2%～3.62%，本研究結(jié)果與其基本一致。提示艾滋病患者可聯(lián)合送檢腦脊液、血液、痰液和骨髓等標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，如有其他部位的感染諸如活組織、胸水、尿液也曾檢出過新生隱球菌，為提高新生隱球菌的檢出率，建議加大各種類型標(biāo)本的送檢量。

在艾滋病合并隱球菌性腦膜腦炎患者中，誘導(dǎo)治療初始階段使用兩性霉素B的患者，較不使用者死亡風(fēng)險(xiǎn)更低[12]。因此在艾滋病合并隱球菌感染的臨床路徑[13]和專家共識(shí)[4]中，治療首選藥物推薦兩性霉素B聯(lián)合5-氟胞嘧啶。建議先用兩性霉素B 聯(lián)合5-氟胞嘧啶治療(誘導(dǎo)期)≥兩周或治療腦脊液培養(yǎng)轉(zhuǎn)為陰性，然后口服氟康唑治療(鞏固期)8～10周，最后口服氟康唑治療1年以上防止復(fù)發(fā)(維持期)。本研究中兩性霉素B對(duì)424株新生隱球菌的MIC范圍是<0.5～4 μg/mL，MIC50和MIC均數(shù)(<0.5 μg/mL和0.27 μg/mL)均與國內(nèi)外的文獻(xiàn)結(jié)果較一致[6,14-15]。在本研究中有1株新生隱球菌兩性霉素B的MIC為4 μg/mL，屬罕見情況，故對(duì)此株新生隱球菌的藥物敏感試驗(yàn)進(jìn)行了兩次復(fù)檢，復(fù)檢與初檢結(jié)果一致，出現(xiàn)此種情況可能與艾滋病患者播散性隱球菌病的復(fù)發(fā)率高，反復(fù)使用兩性霉素B治療有關(guān)，提示高耐藥菌株的出現(xiàn)藥物選擇壓力很關(guān)鍵。本研究中5-氟胞嘧啶對(duì)424株新生隱球菌的MIC范圍是<4～>16 μg/mL，MIC50和MIC均數(shù)(<4 μg/mL和3.74 μg/mL)均與國內(nèi)的文獻(xiàn)結(jié)果較一致[6,14]。本研究中氟康唑?qū)?24株新生隱球菌的MIC范圍是<1～64 μg/mL，MIC50和MIC均數(shù)(2 μg/mL和4.02 μg/mL)均低于國內(nèi)外的文獻(xiàn)結(jié)果[14-16]。

本研究結(jié)果顯示，424株臨床分離的新生隱球菌對(duì)兩性霉素B、氟康唑及5-氟胞嘧啶的敏感性分別為95.28%(404/424)、80.66%(342/424)、75.71%(321/424)，而對(duì)于伊曲康唑及伏立康唑尚無敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)，提示新生隱球菌對(duì)兩性霉素B屬于野生菌株的可能性較大，而氟康唑及5-氟胞嘧啶在這么多年的臨床用藥過程中已慢慢出現(xiàn)非敏感菌株。

氟康唑等唑類藥物在隱球菌病的治療中扮演著重要的角色。根據(jù)本研究建立的新生隱球菌的流行病學(xué)折點(diǎn)：5-氟胞嘧啶和氟康唑16 μg/mL；兩性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑0.5 μg/mL。三種唑類藥物中，非野生型菌株的比例有所差異，氟康唑有3株，伏立康唑有7株，伊曲康唑有17株。這與范欣等[6]檢出的無伊曲康唑非野生株不一致。

新生隱球菌對(duì)兩性霉素B的敏感性較好，而氟康唑及5-氟胞嘧啶在這么多年的臨床用藥過程中已慢慢出現(xiàn)非敏感菌株，伊曲康唑和伏立康唑MIC范圍≤2 μg/mL。新生隱球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果為臨床醫(yī)生用藥提供參考依據(jù)，建議首選兩性霉素B，聯(lián)合5-氟胞嘧啶或者唑類藥物治療，如果出現(xiàn)兩性霉素B或者氟康唑耐藥的菌株，建議選擇伏立康唑或者伊曲康唑來治療。

隱球菌病缺乏特異性臨床表現(xiàn)，易誤診而延誤正確的診斷和治療，尤其是有多種基礎(chǔ)疾病并發(fā)隱球菌敗血癥或隱球菌中樞系統(tǒng)感染，臨床表現(xiàn)極易被基礎(chǔ)疾病或其他疾病掩蓋，而致漏診、誤診；早期的病原學(xué)檢測(cè)對(duì)疾病的診斷和治療十分重要。隱球菌作為臨床重要的致病真菌，實(shí)驗(yàn)室及臨床均應(yīng)給予高度重視。