康淼，郭瑜，馬薇薇，張宏麗，于鈺杰，王曉聞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

小米，谷子經(jīng)脫殼后制成的糧食，不僅是良好的營(yíng)養(yǎng)來源，還具有養(yǎng)腎氣、健脾胃、清虛解熱等功效［1］，與其它谷物相比，小米具有較高含量的脂肪［2］。不同小米的脂肪含量存在差異，這也直接影響到了其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食用品質(zhì)［3］。目前消費(fèi)者對(duì)小米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)尤為關(guān)注，因此小米油脂的含量及脂肪酸組成逐漸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。李紅等［4］研究發(fā)現(xiàn)小米油中亞油酸含量最高（65.30%），其不飽和脂肪酸含量約為飽和脂肪酸含量的5 倍，因此小米油是一種具有保健作用的油脂。趙陳勇等［5］研究小米谷糠油對(duì)高血脂型大鼠的血脂水平的影響，結(jié)果表明小米谷糠油相比其它谷物油降血脂效果最好。

目前對(duì)小米油脂的提取技術(shù)主要為索氏提取法，索氏提取法（Soxhlet extraction，SE）是一種傳統(tǒng)的提取方法，具有設(shè)備要求低和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但是使用該方法提取油脂的時(shí)間太長(zhǎng)，且對(duì)有機(jī)溶劑的消耗量大。加速溶劑萃取法（Accelerated Solvent Extraction，ASE）是Richter 等［6］提出的一種可以在高溫、高壓的條件下實(shí)現(xiàn)有機(jī)溶劑自動(dòng)萃取的新型萃取方法。升高溫度有助于有機(jī)溶劑對(duì)樣品的溶解，增加壓力有助于加快萃取的速度。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，在ASE 提供的條件下，有機(jī)溶劑的萃取率更高，這是由于溶質(zhì)溶解度增加，傳質(zhì)和擴(kuò)散速率得到改善［7］。ASE 方法經(jīng)濟(jì)，耗時(shí)少，溶劑使用量低，提取得率高［8］。在目前的提取技術(shù)領(lǐng)域，ASE 技術(shù)被推薦為各種過程的最佳提取技術(shù)之一，這些技術(shù)主要集中在草藥、食品、藥品和以營(yíng)養(yǎng)為基礎(chǔ)的研究和產(chǎn)品開發(fā)［9］。

本試驗(yàn)以晉谷21 小米為研究對(duì)象，通過加速溶劑萃取儀提取小米中的油脂，并采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)萃取劑的選擇、萃取溫度、萃取時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas chromatograohy-mass spectrometry，GC-MS）對(duì)小米油脂脂肪酸的組成進(jìn)行定性和定量分析，以期建立一種簡(jiǎn)單、快速地提取小米油脂的方法，為小米的進(jìn)一步開發(fā)及利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米：晉谷21，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所提供。

二氯甲烷：分析純；正庚烷、甲醇：色譜純，均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

表1 儀器型號(hào)及廠家Table 1 Instrument model and manufacturer

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將除雜后的小米粉碎，過100 目篩后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 小米油脂的提取

稱取約2 g 的小米粉，將其與硅藻土（2∶1）混合后置于萃取池中。待萃取完畢后，收集萃取液于旋蒸瓶中并濃縮，在60 ℃下烘至恒重。

油脂得率按下列公式計(jì)算：

式中：m0為樣品質(zhì)量（g），m1為空旋蒸瓶的質(zhì)量（g），m2為含脂肪的旋蒸瓶的質(zhì)量（g）。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇溶劑體積比、萃取溫度、萃取時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)4 個(gè)因素（表2），分析不同因素對(duì)小米油脂得率的影響。

表2 單因素變量試驗(yàn)因素水平Table 2 Factor level of single factor variable test

1.3.4 小米油脂脂肪酸組成分析

甲酯化方法 稱取油脂0.06 g，加入十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液2 mL。再加入4 mL 異辛烷，待試 樣 溶解后 加 入200 μL 的NaOH-CH3OH 溶 液并震蕩30 s。靜置至澄清后加入約1 g NaHSO4震蕩，待鹽沉淀后，取上層液待用。

色譜條件 進(jìn)樣器溫度：270 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；載氣：氮?dú)?；程序升溫?00 ℃維持13 min，10 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持6 min；1 ℃·min-1升溫至200 ℃，維持20 min；最后以4 ℃·min-1的速率升溫至230 ℃，維持10.5 min；分流比：100∶1；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行方差分析；采用GraphPad Prim 8.0.2 繪制柱形圖；使用Design-Expert 8.0.5 設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析；脂肪酸物質(zhì)定性分析通過儀器自帶的NIST 數(shù)據(jù)庫檢索，定量結(jié)果采用面積歸一化法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 二氯甲烷-甲醇體積比對(duì)小米油脂得率d的影響

如圖1 所示，當(dāng)二氯甲烷-甲醇體積比為1∶1時(shí)，小米油脂得率最大為3.58%。二氯甲烷含量過高或過低，都會(huì)使小米油脂得率降低?；谙嗨葡嗳茉?，極性相近的物質(zhì)易相互溶解，可推測(cè)小米所含油脂的極性與體積比為1∶1 的二氯甲烷-甲醇混合液的極性接近。

圖1 二氯甲烷-甲醇體積比對(duì)小米油脂得率的影響Fig.1 Influence of dichloromethane-methanol volume ratio on yield of millet oil

2.1.2 萃取溫度對(duì)小米油脂得率的影響

如圖2 所示，在溫度為130 ℃時(shí)，小米油脂的得率最高為4.48%。隨溫度的升高，小米油脂得率呈升高趨勢(shì)。說明隨溫度的升高，小米油脂在有機(jī)溶劑中的溶解度會(huì)升高；當(dāng)溫度高于130 ℃時(shí)，小米油脂得率反而下降。這可能是因?yàn)榈蜏販p緩了脂肪溶出的速度，隨溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，樣品中的脂肪才易被提取，但是過高的溫度會(huì)使油脂降解，這就導(dǎo)致了油脂得率下降。

圖2 萃取溫度對(duì)小米油脂得率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on yield of millet oil

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)小米油脂提取的影響

如圖3 所示，在12 min 時(shí)，所提取的小米油脂含量最高為4.13%，低于12 min 時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，油脂得率升高；超過12 min 后，小米油脂萃取率降低。小米脂肪需經(jīng)過一定時(shí)間后才能被完全提取，所以油脂得率與時(shí)間成正比，但小米粉長(zhǎng)時(shí)間暴露于高溫高壓的環(huán)境下會(huì)使其油脂降解，因此導(dǎo)致油脂得率下降。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)小米油脂得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of millet oil

2.1.4 循環(huán)次數(shù)對(duì)小米油脂提取的影響

如圖4 所示，萃取循環(huán)次數(shù)為3 時(shí)，獲得最大提取量4.12%，循環(huán)1～2 次所獲得的小米油脂較少，可能是因?yàn)闆]有把小米中的油脂盡數(shù)提出。循環(huán)次數(shù)大于3 次時(shí)并沒有提高小米油脂得率。

圖4 循環(huán)次數(shù)對(duì)小米油脂得率的影響Fig.4 Influence of number of cycles on yield of millet oil

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以小米油脂得率作為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，用Design Expert 8.0.6.1 軟件中的BoxBehnken 模型，進(jìn)行3 因素（萃取溫度、萃取時(shí)間、循環(huán)次數(shù)）3 水平（-1、0、1）的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見表3，結(jié)果見表4。表3 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，得到回歸方程：Y=4.52+0.035A-0.075B+0.039C-0.028AB-0.022AC+7.547E-0.03BC-0.19A2-0.25B2-0.14C2

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平Table 3 Levels of each factor in response surface test design

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Response surface test design and results

式中Y 為小米油脂得率（%），A 為萃取時(shí)間（min），B 為萃取溫度（℃），C 為循環(huán)次數(shù)。由表5的方差分析結(jié)果可知，回歸模型P＜0.001，失擬項(xiàng)P＞0.05，說明該模型擬合度較高。決定系數(shù)R2=0.997 7，校正系數(shù)R2Adj=0.994 8，說明該模型與實(shí)際擬合較好。因此，該模型可用于小米油脂得率的分析與計(jì)算。A、B、C、AB、A2、B2、C2對(duì)小米油脂得率的影響均為極顯著（P＜0.01）；AC 對(duì)小米油脂得率的影響顯著（P＜0.05）；BC 對(duì)小米油脂得率的影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值的大小，判定3 個(gè)因素對(duì)小米油脂得率的影響程度依次為：B（萃取溫度）＞C（循環(huán)次數(shù)）＞A（萃取時(shí)間）。

表5 回歸方程方差分析表Table 5 Regression equation variance analysis table

萃取時(shí)間、溫度以及循環(huán)次數(shù)兩兩交互作用對(duì)小米油脂得率影響的響應(yīng)面3D 圖和等高線圖如圖5～圖7 所示。隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，小米油脂得率先升高后小幅度下降；隨萃取溫度的升高，小米油脂得率先升高后呈下降趨勢(shì)，由其等高線圖可看出，沿萃取時(shí)間軸等高線較萃取溫度軸等高線稀疏，說明萃取時(shí)間對(duì)小米油脂得率的影響不如萃取溫度的影響顯著，等高線的形狀可以體現(xiàn)交互作用的強(qiáng)弱，越接近橢圓交互作用越顯著［10］，圖中等高線呈橢圓形，說明萃取時(shí)間（A）與萃取溫度（B）的交互作用顯著。隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)和循環(huán)次數(shù)增加，小米油脂得率逐漸升高后小幅度下降，由其等高線圖可看出，沿萃取時(shí)間軸等高線較循環(huán)次數(shù)軸等高線稀疏，說明循環(huán)次數(shù)對(duì)小米油脂得率的影響較萃取時(shí)間對(duì)其的影響顯著，等高線呈橢圓形，說明萃取時(shí)間（A）與循環(huán)次數(shù)（C）的交互作用顯著。隨萃取溫度的升高，小米油脂得率先升高后下降，隨循環(huán)次數(shù)的增加，小米油脂得率變化不是很大，由其等高線圖可看出，沿萃取溫度軸等高線較循環(huán)次數(shù)軸等高線密集，說明萃取溫度對(duì)小米油脂得率的影響較循環(huán)次數(shù)對(duì)其的影響顯著，等高線呈圓形，說明萃取溫度（B）與循環(huán)次數(shù)（C）的交互作用不顯著。綜上，萃取時(shí)間（A）與萃取溫度（B）的交互作用極顯著，萃取時(shí)間（A）與循環(huán)次數(shù)（C）的交互作用顯著，萃取溫度（B）與循環(huán)次數(shù)（C）的交互作用不顯著，影響小米油脂得率因素的主次順序?yàn)檩腿囟龋˙）＞循環(huán)次數(shù)（C）＞萃取時(shí)間（A），與方差分析結(jié)果一致。響應(yīng)面最高點(diǎn)在模型設(shè)計(jì)范圍之內(nèi)，說明此響應(yīng)面變量設(shè)計(jì)較好，可用于后續(xù)分析。

圖5 萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)小米油脂得率影響的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Fig.5 Response surface（left）and contour（right）of effects of extraction temperature and time on yield of millet oil

圖7 循環(huán)次數(shù)和萃取溫度對(duì)小米油脂得率影響的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Fig.7 Response surface（left）and contour line（right）of influence of number of cycles and extraction temperature on yield of millet oil

對(duì)上述回歸方程求解，得到小米油脂得率達(dá)到最大值時(shí)的提取條件為：時(shí)間12.20 min，溫度128.45 ℃，循環(huán)次數(shù)3.12 次，小米油脂得率達(dá)4.527 74%。采用軟件預(yù)測(cè)的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到實(shí)際小米油脂得率為4.53%，非常接近預(yù)測(cè)值，表明利用響應(yīng)面法優(yōu)化小米油脂的提取工藝具有可行性。

2.3 小米脂肪酸的GC-MS 分析結(jié)果

將小米油脂的甲酯化產(chǎn)物，經(jīng)GC-MS 分析所得脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜色譜圖及相對(duì)含量，分別見圖8、表6。

表6 小米油脂脂肪酸組成Table 6 Fatty acid composition of millet oil

圖8 小米油脂肪酸組成的氣-質(zhì)色譜圖Fig.8 The GC-MS spectrogram of millet oil fatty acid

圖6 循環(huán)次數(shù)和萃取時(shí)間對(duì)小米油脂得率影響的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Fig.6 Response surface（left）and contour line（right）of effects of cycles and extraction time on yield of millet oil

小米中一共鑒定出了16 種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸有7 種，包括3 種單不飽和脂肪酸（12.04%）和4 種多不飽和脂肪酸（73.54%），n-6與n-3 的比值為22∶1；飽和脂肪酸有9 種，相對(duì)含量為14.42%。根據(jù)每個(gè)脂肪酸的相對(duì)含量可知，小米中的主要脂肪酸為：亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬酯酸、α-亞麻酸、花生酸和山萮酸，其中亞油酸含量最高，占脂肪酸總量的70.38%。

3 討論

由于ASE 法具有儀器簡(jiǎn)單、精密度好、節(jié)約溶劑、萃取效率高、安全性好、操作方便等突出特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。唐曉偉等［11］采用ASE 分析5 種蔬菜種子的含油量，結(jié)果表明西瓜種子的含油量最高，辣椒種子的含油量最低；劉有添等［12］比較了3 種方法對(duì)烏賊膏脂肪酸的提取效率，結(jié)果表明加速溶劑萃取法的提取效率最高，且節(jié)約溶劑和時(shí)間；周連寧等［13］研究萃取溫度和時(shí)間對(duì)小球藻油脂得率的影響，結(jié)果表明油脂得率隨萃取溫度、時(shí)間的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。ASE 法還應(yīng)用于黃酮類化合物、人參皂苷、農(nóng)藥等的分離提取，ASE 法比常規(guī)萃取法的速度更快、萃取率更高［14-16］。崔素萍等［17］分析經(jīng)索氏提取以及超聲波輔助提取的6 種小米脂肪的脂肪酸組成，先通過超聲波輔助提取小米脂肪30 min，后進(jìn)行索氏抽提2 次，而加速溶劑萃取法，只需12 min 就可得到與其得率相當(dāng)?shù)男∶子椭?。提取脂肪常用的索氏提取法，雖然應(yīng)用較多，但該方法不僅需要耗費(fèi)大量的溶劑和時(shí)間，且油脂提取率低，說明ASE法可以節(jié)約小米油脂提的溶劑和時(shí)間。張義茹等［18］研究晉谷21 小米的脂肪酸組成，結(jié)果顯示該小米中主要含有油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬酯酸、花生酸和山萮酸，其中，亞油酸所占的比例最高與本研究結(jié)果一致，研究表明亞油酸可以促進(jìn)新陳代謝，預(yù)防動(dòng)脈硬化［19］。因此，小米油是一種營(yíng)養(yǎng)健康的油脂；霍權(quán)恭［20］等發(fā)現(xiàn)其研究的6 種小米的不飽和脂肪酸含量為不飽和脂肪酸總量82.02%～90.39%，本文研究得到小米不飽和脂肪酸含量介于此區(qū)間內(nèi)為85.58%；李良玉等［21］研究微波處理對(duì)小米油的脂肪酸組成的影響，結(jié)果表明微波處理會(huì)使小米油中不飽和脂肪酸含量顯著下降，而加速溶劑萃取法并未對(duì)其不飽和脂肪酸含量有顯著影響。

本研究通過加速溶劑萃取法提取小米中的油脂，采用與氯仿性質(zhì)相似但毒性較小的二氯己烷、甲醇混合溶劑作為提取劑［22］，與傳統(tǒng)的油脂提取方法相比，不僅提高了油脂得率，大大節(jié)約萃取時(shí)間和萃取溶劑，且對(duì)小米油的脂肪酸組成沒有顯著影響，操作簡(jiǎn)單極大地提高了工作效率，顯示出了ASE 法的優(yōu)越性，表明用加速溶劑法提取小米油脂具有可行性。

4 結(jié)論

本研究分析了加速溶劑萃取法提取小米油脂的最優(yōu)工藝以及小米油脂的脂肪酸組成。結(jié)果表明，小米油脂模型預(yù)測(cè)的最佳組合為：二氯甲烷-甲醇體積比1∶1，萃取時(shí)間12.20 min，萃取溫度128.45 ℃，循環(huán)次數(shù)3.13 次，預(yù)測(cè)的最大得率為4.527 74%，實(shí)際結(jié)果為4.53%。小米油脂中含有的亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬酯酸、α-亞麻酸、花生酸和山萮酸等7 種脂肪酸，其中亞油酸含量最高為70.38%。該研究可為今后小米油脂的提取及加工利用等提供參考。