毛咪，呂長(zhǎng)平，帥佳琪，石楊，江莉娜，康敏

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林與藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省中亞熱帶優(yōu)質(zhì)花木繁育與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

牡丹根腐病是一種主要由茄病鐮刀菌（Fusarium. solani）引起的土傳真菌病害［1］，牡丹根腐病又稱(chēng)爛根病，主要危害牡丹根部，且在國(guó)內(nèi)發(fā)生十分普遍［2］。目前，牡丹根腐病的防治主要以農(nóng)業(yè)防治為基礎(chǔ)，以化學(xué)防治為關(guān)鍵，甲基托布津，多菌靈等都是常用的化學(xué)農(nóng)藥［3］，但長(zhǎng)期施用化學(xué)藥劑易污染環(huán)境并易使病菌產(chǎn)生抗藥性，有研究報(bào)道經(jīng)亞致死劑量汰選試驗(yàn)測(cè)定，茄病鐮刀菌極易對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性［4］。

在新農(nóng)業(yè)發(fā)展時(shí)代背景下，由拮抗菌制成的生物制劑因無(wú)副作用、環(huán)境相容性高、不產(chǎn)生農(nóng)藥殘留等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注［5］。在茄病鐮刀菌的生物防治方面，已經(jīng)報(bào)道的拮抗細(xì)菌主要為芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌、土壤桿菌屬（Agrobacterium）細(xì)菌和假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌［6］，其中應(yīng)用最多的是芽孢桿菌屬細(xì)菌，芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗逆性和易保存性［7］，因此在對(duì)牡丹根腐病的防治中有著較大的發(fā)展?jié)摿屠们熬啊ｍ憫?yīng)面分析法在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，能最大條件的優(yōu)化試驗(yàn)次數(shù)［8］，反應(yīng)出不同因素間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的交互影響［9］。目前，響應(yīng)面法優(yōu)化是菌株發(fā)酵條件中常用的方法，但利用響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹根腐病拮抗菌發(fā)酵條件的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地的健康牡丹根莖部分離獲得1 株對(duì)茄病鐮刀菌有明顯拮抗作用的菌株MRX2-1，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，生理生化指標(biāo)測(cè)定及16S rDNA 序列分析初步將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌，采用單因素試驗(yàn)并結(jié)合響應(yīng)面法分析優(yōu)化菌株MRX2-1 的發(fā)酵條件，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)發(fā)酵條件影響較大的溫度、接種量和pH 值3 個(gè)因素，以O(shè)D600作響應(yīng)值，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平的組合試驗(yàn)，獲得菌株MRX2-1 的最佳發(fā)酵參數(shù)，旨在為后續(xù)牡丹根腐病生防菌劑的研發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

菌株MRX2-1 由本課題組前期從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉實(shí)踐教學(xué)基地的健康牡丹根莖部分離獲得，現(xiàn)保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)。靶菌為牡丹根腐病致病菌茄病鐮刀菌，由患病牡丹根部分離獲得。

1.1.2 供試菌株培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基（g·L-1）：馬鈴薯粉6.0，葡萄糖20.0，瓊脂粉20.0，pH 值5.6±0.2；NB 固體培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10.0，牛肉浸粉3.0，NaCl 5.0，瓊 脂 粉15.0，pH 值7.2±0.2；LB 液 體 培 養(yǎng) 基（g·L-1）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 值7.0±0.1。上述培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑和儀器

TSINGKE 植物DNA 提取試劑盒，北京擎科生物科技有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海儀天科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 拮抗菌抑菌效果測(cè)定

采用平板對(duì)峙法［10］，以提前7 d 于PDA 平板上活化的茄病鐮刀菌為靶菌。用滅菌后的打孔器（5 mm）在距PDA 平板中心兩側(cè)3 cm 處各打一孔，用鑷子取靶菌菌餅接種于平板一側(cè)，制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的拮抗菌MRX2-1 菌液［11］，用移液槍吸取20 μL 菌液接種于另一側(cè)孔中。每個(gè)處理設(shè)置3 組重復(fù)，以單獨(dú)接種茄病鐮刀菌作為對(duì)照組，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，計(jì)算抑菌率。

1.3 拮抗菌MRX2-1 的鑒定

1.3.1 形態(tài)特征及生理生化特征

根據(jù)參考文獻(xiàn)［12-13］對(duì)菌株MRX2-1 的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化特性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

利用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，用細(xì)菌通用 引 物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′） 和 1492R （5′-GGTTACCTTGTTAGACTT-3′）進(jìn)行PCR 的擴(kuò)增［14］。將擴(kuò)增好的PCR 產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序所得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，利用MEGA6.0 軟件分析序列，用N-J 法構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹(shù)［15］。

1.4 拮抗菌MRX2-1 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 拮抗菌MRX2-1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

將MRX2-1 種子液以1%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，以不接種子液設(shè)為對(duì)照組，設(shè)置3組平行 試驗(yàn)，置于28 ℃、180 r·min-1搖 床震蕩培養(yǎng)，采用紫外分光光度法每隔4 h 取樣測(cè)OD600值，共測(cè)13 個(gè)點(diǎn)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.4.2 單因素試驗(yàn)篩選最佳發(fā)酵條件

比較不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、pH（5、6、7、8、9）、轉(zhuǎn) 速（120、140、160、180、200 r·min-1）、溫度（28、30、32、34、36 ℃）4 個(gè)因素對(duì)拮抗菌MRX2-1 生長(zhǎng)的影響，以O(shè)D600為指標(biāo)，獲得最佳單因素發(fā)酵條件。

1.4.3 正交試驗(yàn)確定最佳組合

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取接種量、pH、溫度3 個(gè)因素為自變量，以O(shè)D600為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的組合設(shè)計(jì)（表1）。采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件的參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化［16］，以獲得最佳的發(fā)酵組合。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平和編碼Table 1 Response surface experimental design test factor levels and code of Box-Behnken

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS 26.0 和Excel 2016 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并進(jìn)行分析；采用Design-Expert 12 進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析；利用OriginPro8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌MRX2-1 抑菌結(jié)果

拮抗菌MRX2-1 的平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，MRX2-1 菌株對(duì)茄病鐮刀菌的抑菌效果顯著且穩(wěn)定，試驗(yàn)組抑制率可達(dá)52.78%±0.43%。表明菌株MRX2-1 對(duì)茄病鐮刀菌具有較好的拮抗作用，可作為1 株生防菌進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵條件優(yōu)化。

圖1 拮抗菌MRX2-1 對(duì)茄病鐮刀菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of antagonistic bacterium MRX2-1 on Fusarium solanacearum

2.2 拮抗菌MRX2-1 鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征及生理生化特征

菌株MRX2-1 在NB 固體培養(yǎng)基上于28 °C 培養(yǎng)2 d 后，菌落呈圓形、白色、菌體表面濕、邊緣不整齊且突起有褶皺、不透明，菌體呈桿狀（圖2A、2B），革蘭氏染色結(jié)果菌體呈現(xiàn)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖2C）。

圖2 拮抗菌MRX2-1 的形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Colony morphology of strain MRX2-1 and the result of Gram staining

菌株MRX2-1 的生理生化指標(biāo)：甲基紅、淀粉水解、V-P 試驗(yàn)、明膠液化等反應(yīng)均呈陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)檢測(cè)呈陰性，在15%NaCl 條件下可以生長(zhǎng)，可利用葡萄糖、蔗糖等碳源。

2.2.2 分子鑒定結(jié)果

提取MRX2-1 基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物的基因序列經(jīng)測(cè)序長(zhǎng)度為1380 bp，將基因序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知菌株基因序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，通過(guò)MEGA 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明，菌株MRX2-1 與Bacillus amyloliquefaciens（HM107808.1）聚于同一分枝，且相似度高達(dá)99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將生防菌株MRX2-1 鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的菌株MRX2-1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain MRX2-1 constructed based on 16S rDNA gene sequence

2.3 菌株MRX2-1 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

菌株MRX2-1 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖4 所示，對(duì)照組幾乎處于穩(wěn)定狀態(tài)，沒(méi)有較大起伏，菌株MRX2-1在接種的0～16 h 生長(zhǎng)速度較快，16～32 h 生長(zhǎng)速度降低，在32 h 到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期，故將32 h 作為菌株MRX2-1 的最佳生長(zhǎng)周期。

圖4 菌株MRX2-1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.4 Growth curve of strain MRX2-1

2.3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

各單因素發(fā)酵條件對(duì)菌株MRX2-1 生長(zhǎng)量的影響如圖5 所示。pH 對(duì)菌株生長(zhǎng)影響較大，pH 在5～9 時(shí)，菌株活菌數(shù)呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH 在5～6 時(shí)，細(xì)菌處在酸性生長(zhǎng)環(huán)境下，菌株可以正常生長(zhǎng)且OD600值在增加，說(shuō)明菌株具有較強(qiáng)耐酸性，pH 為7 時(shí)，活 菌數(shù)達(dá) 到峰值，pH 繼 續(xù)增大，菌株活性逐漸降低但部分菌株仍可生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株具有一定的耐堿能力。當(dāng)pH 為7 時(shí)，OD600值達(dá)到最大，故選7 作為最佳發(fā)酵pH，同時(shí)，選擇pH 5、6、7 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。接種量在1%～5%范圍內(nèi)，OD600值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。接種量為2%時(shí)，菌株活菌數(shù)達(dá)到最大，即峰值。故將2%作為最佳發(fā)酵接種量，并選擇接種量1%、2%、3%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)影響顯著，OD600值隨溫度的增大而增大，溫度達(dá)到34 ℃時(shí)，OD600值達(dá)到峰值，溫度繼續(xù)上升，OD600值開(kāi)始下降，但仍高于最初值（溫度為28 ℃時(shí)），說(shuō)明菌株在一定程度上能耐高溫。當(dāng)溫度為34 ℃時(shí)，OD600值達(dá)到峰值，故選擇34 ℃作為最佳發(fā)酵溫度，并選擇溫度32、34、36 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)影響較大，隨著轉(zhuǎn)速的增加，OD600值逐漸增大，活菌數(shù)也逐漸增多，這是因?yàn)殡S著轉(zhuǎn)數(shù)的增加，使菌株與液體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸更加充分，菌株生長(zhǎng)中所需的氧氣含量也增高，滿(mǎn)足了菌株生長(zhǎng)中的代謝需求，故培養(yǎng)基中的菌株活菌量也隨之增加，且在該試驗(yàn)中轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時(shí)，OD600值達(dá)到最大，故將200 r·min-1作為試驗(yàn)的最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

圖5 不同發(fā)酵條件對(duì)菌株MRX2-1 生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different fermentation conditions on the growth of strain MRX2-1

2.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以接種量（A）、溫度（B）、pH（C）為自變量，OD600為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件的參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化（表2）。

利用Design Expert12 軟件對(duì)表2 中的結(jié)果進(jìn)行擬合，得到回歸方程：Y=1.92+0.088 4A-0.010 0B-0.023 9C-0.001 7AB+0.018 0AC+0.019 7BC-0.163 5A2-0.043 8B2-0.115 0C2。對(duì)模型進(jìn)行方差分析（表3）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

由表3 可見(jiàn)，所建模型的P值＜0.000 1，模型呈顯著差異；失擬項(xiàng)P值=0.235 9＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，模型不失擬，選擇合理。方程決定系數(shù)R2=0.996 1，說(shuō)明該模型能解釋99.61%的響應(yīng)值變化，校正決定系數(shù)R2Adj=0.991 1，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合較好；誤差較小。綜合試驗(yàn)回歸方程方差分析結(jié)果，表明該響應(yīng)面優(yōu)化模型具有可行性。同時(shí)，模型一次項(xiàng)的A、C 及二次項(xiàng)的A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響均為極顯著（P＜0.01）；交叉項(xiàng)AC、BC 對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。響應(yīng)面模型極顯著地反映出了OD600值與接種量、溫度、pH 三個(gè)因素之間的關(guān)系。由表3 的F 值大小判斷，3 個(gè)因素對(duì)OD600值影響程度大小依次為：接種量＞pH值＞溫度。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation of response surface experiment

響應(yīng)面是指響應(yīng)值對(duì)試驗(yàn)中的各因子所形成的三維空間的曲面圖［17］，響應(yīng)面可以直接反映出試驗(yàn)中接種量、pH、溫度交互作用對(duì)OD600值的影響，響應(yīng)面圖形坡度越陡，則交互作用越明顯，坡度越緩，則交互作用越弱［18］，試驗(yàn)中各因素交互作用對(duì)OD600值影響的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖6。

由圖6 可見(jiàn)，3 個(gè)響應(yīng)面均為曲面，且開(kāi)口均向下，各響應(yīng)面上存在最高點(diǎn)，表明3 個(gè)響應(yīng)面的響應(yīng)值均存在極高值。3 組響應(yīng)面中的等高線(xiàn)均為橢圓形，說(shuō)明各因素間存在交互作用。接種量和pH 的交互作用最強(qiáng)，溫度和pH 交互作用最弱。利用Design Expert12 軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，確定最佳發(fā)酵條件為接種量1.99%、pH=6.97、溫度34.41 ℃，在此條件下，預(yù)測(cè)OD600的值為1.929。考慮到試驗(yàn)可行性和實(shí)操性，將最佳發(fā)酵參數(shù)修改為接種量2%、pH=7、溫度34 ℃。在此最優(yōu)條件下，OD600值為1.879，與模型預(yù)測(cè)值（1.929）相差較小，驗(yàn)證了模型的可靠性，說(shuō)明響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化具有可行性。

圖6 各因素交互作用對(duì)菌株MRX2-1 發(fā)酵中OD 值影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface analysis of the effect of the interaction of various factors on the OD value in the fermentation of strain MRX2-1

3 討論

研究表明芽孢桿菌屬細(xì)菌具有提高植物耐鹽性和抗氧化酶活性的能力［19］，提高植物自身的抗病性。針對(duì)牡丹根腐病，吳玉柱等［20］用枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis制劑、巨大芽孢桿菌B. megaterium制劑和枯草芽孢桿菌B. subtilis制劑進(jìn)行牡丹根腐病進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，結(jié)果表明3 種生防菌劑對(duì)牡丹根腐病防治效果良好，防治效果均達(dá)70%以上。孟國(guó)慶等［21］通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)獲得了兩株對(duì)牡丹根腐病據(jù)有拮抗作用的細(xì)菌菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定2 株細(xì)菌均為芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌。

本研究中分離出對(duì)牡丹根腐病最具拮抗作用的菌株MRX2-1，其同源性比對(duì)與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）最為接近。解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系最高，并在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物［22］，使其產(chǎn)生較強(qiáng)的抑菌能力，能有效抵御各種細(xì)菌和真菌對(duì)植物造成的威脅。劉東等［23］通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)證明解淀粉芽孢桿菌可以有效抑制大豆疫霉菌絲的生長(zhǎng)及孢子囊的形成；蔣凱麗等［24］經(jīng)研究表明，解淀粉芽孢桿菌對(duì)鏈格孢菌、擬康寧木霉和膠孢炭疽菌等多種番茄病原菌均有較好抑制效果，且抑制率均高達(dá)65%以上。張木清等［25］從甘蔗健康葉片中分離獲得了1 株解淀粉芽孢桿菌，并對(duì)其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)對(duì)甘蔗鞭黑穗病病原菌抑制效果顯著。

通過(guò)優(yōu)化生防菌培養(yǎng)條件可以提高菌體的有效活菌數(shù)和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量［26-27］。通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化能更好地挖掘并且展現(xiàn)出拮抗菌株的拮抗作用，一方面提高菌株活菌量，另一方面能使菌株產(chǎn)生更多抑菌代謝產(chǎn)物，從而提高防效［28］。正交試驗(yàn)是研究多因素多水平的一種設(shè)計(jì)方法，通過(guò)正交試驗(yàn)，可以有效減少試驗(yàn)次數(shù)，選擇一部分有代表性水平組合進(jìn)行試驗(yàn)，體現(xiàn)出各因素之間的交互作用。解淀粉芽孢桿菌MRX2-1 液體發(fā)酵條件的優(yōu)化涉及多個(gè)因素和水平，若是采用傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法，則工作量加重且不易得到清晰的試驗(yàn)結(jié)果。采用Box-Behnken 響應(yīng)面分析法可以有效的篩選出影響菌株MRX2-1 發(fā)酵條件的主要因素，從而達(dá)到優(yōu)化的目的。

4 結(jié)論

本研究以菌株MRX2-1 的生長(zhǎng)量為考量指標(biāo)，通過(guò)Box-Behnken 設(shè)計(jì)并結(jié)合響應(yīng)面分析優(yōu)化菌株發(fā)酵條件。結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度34 ℃，初始pH 7，接種量2%。在此條件下，OD600值可達(dá)1.879，實(shí)際OD600值與預(yù)測(cè)OD600值相比，其相對(duì)誤差僅為2.59%，驗(yàn)證了響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化的可行性。優(yōu)化后的發(fā)酵條件提高了菌株MRX2-1 的有效活菌數(shù)，節(jié)約了發(fā)酵成本。為后期菌株MRX2-1 作為微生物菌劑用于牡丹根腐病的田間防治提供一定的參考。