李思輝，趙明霞，陶佳麗，楊禹龍，劉倩，姜俊兵，*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西工程技術(shù)學(xué)院 礦業(yè)工程系，山西 陽泉 045000）

吡唑并嘧啶是由一個(gè)吡唑環(huán)和一個(gè)嘧啶環(huán)組成的稠雜環(huán)化合物，2 個(gè)活性單元的同時(shí)存在使得吡唑并嘧啶類衍生物具有良好的生物活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，吡唑并嘧啶類衍生物可作為Akt（蛋白激酶B）、Cdk4/6（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶）等抑制劑，對(duì)Hela，HepG2，Caco-2 等癌細(xì)胞有較好的抑制效果［1-3］；也可通過有效抑制NO 的產(chǎn)生和COX-2，IL-6 等炎癥因子的表達(dá)達(dá)到抗炎效果［4-5］；還可以作用于昆蟲GABA（γ-氨基丁酸）受體，抑制氯離子內(nèi)流，起到殺蟲作用，對(duì)絲蟲、球蟲、瘧原蟲等多種寄生蟲都有較好的殺滅作用［6-9］；其對(duì)大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等也顯示出較好的抑菌活性［10］，在鎮(zhèn)靜［11］、抗病毒［12］方面也有影響，在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。吡唑并［1，5-a］嘧啶類化合物是吡唑并嘧啶類化合物中的一類重要成員，在藥物靶標(biāo)的合成和研制中意義重大。吡唑并［1，5-a］嘧啶可以通過影響PDE2（磷酸二酯酶）改善阿爾茨海默癥［13］；對(duì)多種癌細(xì)胞的抑制有重要意義［14］，并且對(duì)白念珠菌、肺炎鏈球菌、黃曲霉菌等都具有較好的抑制作用［15-16］。

發(fā)根農(nóng)桿菌是一種廣泛存在于世界范圍的革蘭氏陰性菌，具有宿主范圍廣、易傳播、難治愈、危害大的特點(diǎn)，可通過侵染植物受傷部位產(chǎn)生冠癭瘤。發(fā)根農(nóng)桿菌常發(fā)生于根莖部和嫁接處，感染初期，患病植物的癥狀并不明顯，待晚期時(shí)，易出現(xiàn)植物弱生長，落花落果，嚴(yán)重時(shí)甚至干枯死亡，導(dǎo)致作物大量減產(chǎn)，對(duì)園藝植物和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有巨大危害［17-19］。

基于吡唑并［1，5-a］嘧啶類化合物優(yōu)良的抗菌活性，本研究以7-氯-5-（氯甲基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈為原料，通過改變7 位及5 位的取代基，設(shè)計(jì)并合成了17 個(gè)吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈衍生物，產(chǎn)物經(jīng)1H NMR、13C NMR 及MS（ESI）表征，并采用牛津杯法［20］檢測(cè)其對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的抑菌活性，初步討論了其結(jié)構(gòu)與抑菌活性之間的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化和發(fā)現(xiàn)抗菌譜更廣、抗菌活性更高的新型吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈類化合物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

RY-1 熔點(diǎn)測(cè)試儀（天津市精拓儀器有限公司）；Bruker AvanceⅢHD 400 MHz 型核磁共振儀（DMSO-d6為 溶 劑，TMS 為 內(nèi) 標(biāo)）；UPLC ICLASS-XE-VOG2-XSQTOF 型超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀。SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱（上海博迅），BSD-TX270 恒溫振蕩器（上海博迅），牛津杯（上海兢翀有限公司）等。

LB 培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），2-氟-4-氨基苯腈、3-羥基哌啶、4-氨基嗎啉、二甲胺、4-苯基哌啶、1-（4-吡啶）哌嗪、4-（1-哌啶基）哌啶、氨基丙二酸二乙酯、4-氨基水楊酸甲酯、3-氨基苯乙炔、4-羥基哌啶購于上海韶遠(yuǎn)科技有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 化合物的合成

本研究以7-氯-5-（氯甲基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈為原料，設(shè)計(jì)并合成了17 個(gè)吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈化合物（化合物2-5，7a，7b，8ak），其合成路線如圖1 所示。

圖1 化合物2-5，7a，7b，8a-k 的合成路線圖Fig.1 Synthetic route of compounds 2-5，7a，7b，8a-k

1.2.1 5-（氯甲基）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（7a）合成在150 mL 的圓形瓶中加入化合物1（6 mmol，1.36 g），2-氟-4-氨基苯腈（7.2 mmol，979.2 mg）和60 mL 乙醇。混合物加熱回流，TLC 檢測(cè)3 h 后反應(yīng)完畢，將反應(yīng)體系冷卻至室溫，析出淡黃色沉淀，抽濾，用冷乙醇洗滌，干燥，得到化合物7a。5-（氯甲基）-7-（1，3-二乙氧羰基丙基氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（2），5-（氯甲基）-7-（3-甲氧羰基-4-羥基苯氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（4），5-（氯甲基）-7-（3-乙炔基苯氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（7b）參照化合物7a 的合成方法合成。

1.2.2 5-（氯甲基）-7-（1，3-二羧丙基氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（3）的合成

將化合物2（1 mmol，351 mg）溶于四氫呋喃（6 mL），氫氧化鈉（4 mmol，160 mg）溶于蒸餾水（3 mL）中滴加至上述溶液，混合物加熱回流，TLC檢測(cè)2 h 后反應(yīng)完畢，旋蒸除去四氫呋喃，水溶液用稀鹽酸中和至中性，析出絮狀沉淀，抽濾，固體用水和冷乙醇洗滌，干燥，得到化合物3。

5-（氯甲基）-7-（3-羧基-4-羥基苯氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（5）參照化合物3 的合成方法合成。

1.2.3 5-（3-羥基哌啶）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8a）的合成

在25 mL 的圓形瓶中加入化合物7a（0.6 mmol，195.6 mg），3-羥基哌啶（0.9 mmol，90.9 mg），碳酸鉀（0.9 mmol，124.2 mg）和N，N-二甲基甲酰胺（3 mL）。混合物加熱至40 ℃，TLC 檢測(cè)，5 h 后反應(yīng)完畢，將反應(yīng)體系冷卻至室溫，加入15 mL 冷水，析出黃色沉淀，抽濾，用水洗和冷乙醇洗滌，干燥，得到化合物8a。

化合物8b～8k 參照化合物8a 的合成方法合成。

1.3 抑菌試驗(yàn)

1.3.1 化合物的抑菌作用

用DMSO 溶液分別將6 個(gè)化合物配置為6 mol·L-1的基準(zhǔn)溶液，然后用蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋，將6 個(gè)化合物稀釋為2，4，6，8，10，12 mmol·L-1的溶液。

取出預(yù)先保存的發(fā)根農(nóng)桿菌A599 室溫解凍，接種于加有利福平的LB 固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h 后，挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1震蕩培養(yǎng)。采用牛津杯法測(cè)定樣品抑菌活性，以發(fā)根農(nóng)桿菌為受試菌，取100 μL 菌液（濃度為107CFU·mL-1）均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基，放置4 個(gè)滅菌的牛津杯，并將100 μL 不同濃度的樣品溶液分別加入牛津杯中，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，以0.2% DMSO 溶液為陰性對(duì)照，于28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，觀察抑菌效果，并測(cè)量抑菌圈直徑大小。初步篩選出抑菌效果較好的化合物7a 和7b，用同樣的抑菌試驗(yàn)方法測(cè)試化合物8a～8k 的抑菌作用。

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Mircosoft EXCEL 和SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用單因素分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“Mean±SE”表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成

本文所合成的抑制劑和探針及中間產(chǎn)物經(jīng)1H NMR、13C NMR、MS 表征確定結(jié)構(gòu)正確。

5-（氯甲基）-7-（1，3-二乙氧羰基丙基氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（2），黃色固體，產(chǎn)率79%，m. p. 287～288 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 8.31（s，1H，-CH），7.52（d，1H，J=6.80 Hz，-NH），6.38（s，1H，-CH），4.98（d，1H，J=6.92 Hz，-CH），4.64（s，2H，-CH2），4.39（q，4H，J=7.08 Hz，-CH2），1.35（t，6H，J=7.08 Hz，-CH3）.13C NMR（100 MHz，CDCl3） ： δ 169.29， 165.42， 154.02， 150.91，116.62，92.21，84.35，66.78，49.20，16.84.MS（ESI+）m/z：366.2［M+H］+。

5-（氯甲基）-7-（1，3-二羧丙基氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（3），黃色固體，產(chǎn)率78%，m. p. 136～137 ℃；1H NMR（400 MHz，D2O）：δ 8.37（s，1H，-CH），6.25（s，1H，-CH），4.57（s，2H，-CH2），4.55（s，1H，-CH）.13C NMR（100 MHz， DMSO-d6）： δ 172.50， 160.86，150.45，147.62，147.02，114.50，89.19，78.82。

5-（氯甲基）-7-（3-甲氧羰基-4-羥基苯氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（4），黃色固體，產(chǎn)率79%，m. p. 230～231 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.80（s，1H，-CH），7.85（d，1H，J=9.16 Hz，-ArH），7.08（s，2H，-ArH），6.93（s，1H，-CH），4.77（s，2H，-CH2），3.89（s，3H，-CH3）.13C NMR（100 MHz，DMSOd6） ： δ 168.54， 160.87， 150.60， 147.08，145.67， 143.04， 131.35， 114.36， 113.72，111.26，110.46，90.72，79.83，52.41，45.82.MS（ESI+）m/z：358.1［M+H］+。

5-（氯甲基）-7-（3-羧基-4-羥基苯氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（5），黃色固體，產(chǎn)率80%，m. p. 197～198 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSOd6）：δ 10.75（s，1H，-NH），8.79（s，1H，-CH），7.86（d，1H，J=8.88 Hz，-ArH），7.01（s，2H，-ArH），6.91（s，1H，-CH），4.77（s，2H，-CH2）.13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）：δ 171.25， 162.08， 160.69， 150.60， 147.07，145.73， 142.79， 131.50， 114.03， 113.78，111.03，90.64，79.76，45.83. MS（ESI+）m/z：344.1［M+H］+。

5-（氯甲基）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（7a），黃色固體，產(chǎn)率76%，m. p. 285～286 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSOd6）：δ 10.78（s，1H，-NH），8.82（s，1H，-CH），8.05（dd，1H，J=5.60 Hz，J=2.40 Hz，-ArH），7.86-7.89（m，1H，-ArH），7.69（t，1H，J=8.80 Hz，-ArH），6.72（s，1H，-CH），4.75 （s，2H，-CH2）.13C NMR （100 MHz，DMSO-d6）：δ 161.12，151.07，147.70，147.22，134.11， 133.66， 130.63， 118.54， 118.34，114.32，113.97，101.56，90.21，80.10，46.24.MS（ESI+）m/z：327.1［M+H］+。

5-（氯甲基）-7-（3-乙炔基苯氨基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-甲腈（7b），黃色固體，產(chǎn)率78%，m.p. 148～149 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSOd6）：δ 10.69（s，1H，-NH），8.80（s，1H，-CH），7.46-7.56（m，4H，-ArH），6.66（s，1H，-CH），4.76（s，2H，-CH2），4.31（s，1H，-CH）.13C NMR （100 MHz，DMSO-d6）：δ 161.04，151.13， 147.62， 147.20， 137.18， 130.58，130.41， 128.41， 126.13， 123.52， 114.43，89.89，83.15，82.32，79.96，46.34. MS（ESI+）m/z：308.1［M + H］+。

5-（3-羥基哌啶）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8a），黃色固體產(chǎn)物，產(chǎn) 率59%，m. p. 180～181 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.75（s，1H，-CH），8.01（t，J=2.80 Hz，1H，-ArH），7.87（dd，1H，J=8.00 Hz，J=3.60 Hz，-ArH），7.65（t，1H，J=8.80 Hz，-ArH），6.60（s，1H，-CH），4.73（s，1H，-OH），4.19（s，1H，-CH），3.67（s，2H，-CH2），2.65-2.78（m，2H，-CH2），2.54（d，2H，J=7.60 Hz，-CH2），1.91-2.01（m，2H，-CH2），1.55（dd，2H，J=8.00 Hz，J=4.40 Hz，-CH2）.13C NMR （100 MHz，DMSO-d6）：δ 164.68，151.16， 147.21， 146.84， 134.83， 133.04，130.03， 118.49， 118.28， 114.63， 113.98，101.60，89.42，79.40，69.85，63.00，61.22，52.93，34.94. MS（ESI+）m/z：392.1［M+H］+。

5-（嗎啉氨基）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8b），黃色固體，產(chǎn)率76%，m. p. 194～195 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.19（s，1H，-CH），7.41（t，1H，J=9.20 Hz，-ArH），7.33（dd，1H，J=5.60 Hz，J=2.40 Hz，-ArH），7.24-7.28 （m，1H，-ArH），6.05（s，1H，-CH），5.91（s，1H，-NH），4.46（s，1H，-CH2），4.01（t，1H，J=10.80 Hz，-CH2），3.88（d，2H，J=12.80 Hz，-CH2），3.68（dd，2H，J=12.40 Hz，J=2.40 Hz，-CH2），3.45（t，2H，J=11.60 Hz，-CH2）.13C NMR （100 MHz，DMSO-d6）：δ 160.13，151.89， 147.28， 146.54， 135.59， 130.12，128.12， 121.06， 120.83， 118.40， 115.16，107.86， 90.75， 78.55， 63.69， 44.88. MS（ESI+）m/z：393.2［M+H］+。

5-（二甲氨基）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8c），黃色固體，產(chǎn)率89%，m. p. 210～211 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 10.59（s，1H，-NH），8.75（s，1H，-CH），8.01（dd，1H，J=5.60 Hz，J=2.80 Hz，-ArH），7.84-7.88（m，1H，-ArH），7.68（t，1H，J=8.80 Hz，-ArH），6.53（s，1H，-CH），3.49（s，2H，-CH2），2.19（s，6H，-CH2）.13C NMR （100 MHz，DMSO-d6）：δ 164.66， 151.19， 147.15， 147.00， 133.16，133.07， 130.19， 118.55， 118.35， 114.66，114.03，101.64，89.28，79.41，65.10，45.71.MS（ESI+）m/z：336.1［M+H］+。

5-（4-苯基哌啶-1-基）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8d），淺紅色固體，產(chǎn)率87%，m. p. 240～241 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.71（s，1H，-CH），8.03（dd，1H，J=5.60 Hz，J=2.40 Hz，-ArH），7.81-7.85（m，1H，-ArH），7.67（t，1H，J=8.80 Hz，-ArH），7.16-7.30（m，5H，-ArH），6.65（s，1H，-CH），3.57（s，2H，-CH2），2.96（d，2H，J=11.20 Hz，-CH2），2.17（t，2H，J=11.60 Hz，-CH2），1.73（d，2H，J=12.00 Hz，-CH2），1.59（q，2H，J=12.40 Hz，-CH2）.13C NMR （100 MHz， DMSO-d6） ： δ 164.58，151.46， 147.11， 147.00， 146.58， 132.95，132.86， 129.59， 128.76， 127.16， 126.47，118.48， 118.27， 114.81， 114.03， 101.27，89.21，79.12，63.83，54.23，42.01，33.69. MS（ESI+）m/z：452.2［M+H］+。

5-（4-（吡啶-4-基）哌嗪）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8e），淺紅色固體，產(chǎn)率：83%，m.p. 252～253 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.74（s，1H，-CH），8.14（t，2H，J=5.20 Hz，J=1.20 Hz，-CH），8.02（dd，1H，J=5.60 Hz，J=2.80 Hz，-ArH），7.82-7.86（m，1H，-ArH），7.66（t，1H，J=9.20 Hz，-ArH），6.81（q，2H，J=5.20 Hz，J=1.20 Hz，-CH），6.67（s，1H，-CH），3.61（s，2H，-CH2），3.30（d，4H，J=4.00 Hz，-CH2），2.58（d，4H，J=4.00 Hz，-CH2）. MS（ESI+）m/z：454.2［M+H］+。

5-（4-（哌啶-1-基）哌啶）-7-（3-氰基-4-氟苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8f），黃色固體，產(chǎn)率86%，m. p. 148～149 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.71（s，1H，-CH），8.00（dd，1H，J=5.60 Hz，J=2.80 Hz，-ArH），7.78-7.82（m，1H，-ArH），7.67（t，1H，J=9.20 Hz，-ArH），6.56（s，1H，-CH），3.50（s，2H，-CH2），2.88（d，2H，J=11.20 Hz，-CH2），2.29（t，2H，J=11.20 Hz，-CH2），2.01（t，2H，J=11.60 Hz，-CH2），1.68（d，2H，J=11.20 Hz，-CH2），1.48（d，2H，J=4.40 Hz，-CH2），1.38-1.44（m，11H，-CH2，-CH）.13C NMR（100 MHz， DMSO-d6）： δ 164.53， 151.48，147.16， 146.99， 132.98， 132.89， 129.55，118.48， 118.28， 114.81， 114.00， 101.24，89.07，79.04，63.34，62.22，53.26，50.04，27.93，26.19，24.72. MS（ESI+）m/z：459.3［M+H］+。

5-（二甲氨基）-7-（3-乙炔基苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8g），黃色固體，產(chǎn)率75%，m. p. 135～136 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSOd6）：δ 8.73（s，1H，-CH），7.54（s，1H，-ArH），7.52（d，2H，J=4.80 Hz，-ArH），7.44（d，1H，J=4.40 Hz，-ArH），6.58（s，1H，-CH），4.30（s，1H，-CH），3.48（s，2H，-CH2），2.18 （s，6H，-CH3）.13C NMR （100 MHz，DMSO-d6）：δ 161.20，151.01，147.96，147.50，139.09， 135.40， 134.73， 129.05， 129.02，116.71，114.27，111.31，90.18，80.22，64.20，46.15. MS（ESI+）m/z：317.4［M+H］+。

5-（4-羥基哌啶）-7-（3-乙炔基苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8h），黃色固體，產(chǎn) 率80%，m. p. 228～229 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.73（s，1H，-CH），7.56（s，1H，-ArH），7.51（t，2H，J=2.80 Hz，-ArH），7.42-7.44（m，1H，-ArH），6.70（s，1H，-CH），4.54（s，1H，-OH），4.27（s，1H，-CH），3.51（brs，3H，-CH2，-CH），2.71（dd，2H，J=11.60 Hz，J=7.60 Hz，-CH2），2.14（t，2H，J=10.00 Hz，-CH2），1.69（dd，2H，J=10.40 Hz，J=5.60 Hz，-CH2），1.33-1.40（m，2H，-CH2）.13C NMR （100 MHz， DMSO-d6） ： δ 165.03，151.30， 147.07， 146.76， 137.69， 130.36，129.85， 127.80， 125.56， 123.39， 114.69，88.88，83.09，82.14，79.23，66.30，63.52，51.41，34.87. MS（ESI+）m/z：373.2［M+H］+。

5-（4-苯基哌啶-1-基）-7-（3-乙炔基苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8i），黃色固體，產(chǎn) 率78%，m. p. 154～155 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.75（s，1H，-CH），7.60（s，1H，-ArH），7.52（t，2H，J=2.80 Hz，-ArH），7.44-7.46（m，1H，-ArH），7.30（t，2H，J=7.60 Hz，-ArH），7.17-7.23（m，3H，-ArH），6.77（s，1H，-CH），4.24（s，1H，-CH），3.59（s，2H，-CH2），2.95（d，2H，J=11.20 Hz，-CH2），2.50（brs，1H，-CH），2.17（t，2H，J=11.20 Hz，-CH2），1.76（d，2H，J=12.0 Hz，-CH2），1.56-1.66（m，4H，-CH2）.13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）：δ165.01，151.35，147.13， 146.81， 146.57， 137.73， 130.47，129.96， 128.81， 127.74， 127.14， 126.46，125.76，123.35，114.72，88.98，83.14，82.01，79.26，63.76，54.22，41.92，33.68. MS（ESI+）m/z：433.2［M+H］+。

5-（4-（吡啶-4-基）哌嗪）-7-（3-乙炔基苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8j），黃色固體，產(chǎn) 率78%，m. p. 238～239 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.75（s，1H，-CH），8.16（s，2H，J=6.40 Hz，-CH），7.58（s，1H，-ArH），7.51（d，2H，J=5.60 Hz，-ArH），7.38-7.40（m，1H，-ArH），6.81（d，2H，J=6.80 Hz，-CH），6.75（s，1H，-CH），4.25（s，1H，-CH），3.62（s，2H，-CH2），3.29（brs，4H，-CH2），2.58（brs，4H，-CH2）.13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）：δ 164.10，154.97，151.40，150.20， 147.12， 146.86， 137.89， 130.48，129.82， 127.74， 125.64， 123.29， 114，72，108.84，89.19，83.18，82.11，79.28，63.19，52.60， 46.02. MS （ESI+） m/z： 435.2［M+H］+。

5-（4-（哌啶-1-基）哌啶）-7-（3-乙炔基苯氨基）-吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈（8k），黃色固體，產(chǎn) 率75%，m. p. 123～124 ℃1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 8.72（s，1H，-CH），7.42-7.56（m，4H，-ArH），6.68（s，1H，-CH），4.25（s，1H，-CH），3.50（s，2H，-CH2），2.87（d，2H，J=10.40 Hz，-CH2），2.43（brs，4H，-CH2），2.04（t，1H，J=10.40 Hz，-CH），1.64（brs，2H，-CH2），1.47（brs，2H，-CH2），1.23-1.38 （m，8H，-CH2）.13C NMR （100 MHz，DMSO-d6） ： δ 9165.69， 150.39， 146.44，145.16， 135.93， 130.47， 130.15， 126.65，124.20，123.75，113.39，88.28，82.24，81.37，78.82，63.97，62.36，53.75，50.30，28.13，26.32， 24.77. MS （ESI+） m/z： 440.3［M+H］+。

2.2 抑菌試驗(yàn)

2.2.1 抑菌試驗(yàn)初篩選結(jié)果

化合物1～5，7a，7b 在不同濃度下對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的抑菌作用如表1 所示。由表1 可知，化合物2，3 在各個(gè)濃度均無明顯抑菌作用；化合物1，4，5，7a，7b 對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的抑菌作用隨著化合物濃度的升高而增強(qiáng)；與化合物1，4，5 相比，化合物7a 和7b 的抑菌效果整體顯著增強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為32、21 mm，且化合物7a 的抑菌效果更佳。

表1 化合物1～5，7a，7b 對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of compounds 1～5，7a，7b on Agrobacterium tumefaciens 單位：mm

2.2.2 化合物8a～8k 的抑菌作用

化合物8a～8k 在不同濃度下對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的抑菌作用如表2 所示。由表2 可知，8a～8k 在濃度為2 mmol·L-1時(shí)，對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌均無抑菌作用，從4 mmol·L-1開始，8a～8k 對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的抑制作用呈現(xiàn)隨藥物濃度增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)，且在濃度為12 mmol·L-1抑菌效果最好。在濃度為4 mmol·L-1時(shí)，化合物8a 出現(xiàn)抑菌圈，其它化合物無抑菌效果；在濃度為6 mmol·L-1時(shí)，化合物8f 的抑菌效果最好，8a 次之，均顯著強(qiáng)于其它試驗(yàn)組；在濃度為8 mmol·L-1時(shí)，化合物8a，8d 和8f 的抑菌效果較好，其抑菌圈大小無顯著差異，抑菌效果均顯著強(qiáng)于其它試驗(yàn)組；在濃度為10 mmol·L-1時(shí)，化合物8a和8f 抑菌效果較好，其抑菌圈大小無顯著差異，8d和8e 次之，其抑菌圈大小無顯著差異，抑菌效果均顯著強(qiáng)于其它試驗(yàn)組；在濃度為12 mmol·L-1時(shí)，化合物8f 的抑菌效果最好，8a 次之，且8f 的抑菌圈顯著大于8a，抑菌圈直徑為42.7 mm，抑菌效果均顯著強(qiáng)于其它試驗(yàn)組；與各試驗(yàn)組相比，陽性組有較強(qiáng)的抑菌活性。

表2 化合物8a～8k 對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of compounds 8a～8k on Agrobacterium rhizogenes 單位：mm

3 討論

化合物2，4，7a，7b 可以通過化合物1 與相應(yīng)氨基化合物在乙醇中回流得到，反應(yīng)時(shí)間為2～3 h，產(chǎn)物收率高，作為前體化合物合成步驟簡短、操作方便?；衔? 和4 與氫氧化鈉在四氫呋喃和水混合溶液中發(fā)生水解反應(yīng)，水解完全后用稀鹽酸調(diào)至中性產(chǎn)生沉淀，抽濾洗滌后得到化合物3 和5，產(chǎn)率也相對(duì)較高?；衔?a 和7b 與不同的取代胺在N，N-二甲基甲酰胺中碳酸鉀存在下40 ℃反應(yīng)得到目標(biāo)化合物8a～8k。對(duì)目標(biāo)化合物8a～8k 合成的時(shí)間和溫度進(jìn)行了摸索，通過TLC 檢測(cè)反應(yīng)完成情況，發(fā)現(xiàn)室溫下該反應(yīng)時(shí)間過長并且反應(yīng)不完全，最終選擇在40 ℃條件下反應(yīng)，時(shí)間為4～8 h。對(duì)目標(biāo)化合物收率做了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)過程中含疏水性基團(tuán)的胺反應(yīng)活性優(yōu)于含親水性基團(tuán)的胺，且位阻小的胺反應(yīng)時(shí)間更短，產(chǎn)率相對(duì)較高。由于目標(biāo)化合物8a～8k 不溶于水，在后處理的方法上采用了加水溶解碳酸鉀同時(shí)析出固體產(chǎn)物后抽濾的方式進(jìn)行，相比萃取法產(chǎn)率更高。

通過比較化合物1～5，7a 和7b 對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，在吡唑并［1，5-a］嘧啶類化合物7 位引入的取代基中，苯環(huán)對(duì)抑菌活性的增強(qiáng)有積極作用，且7 位引入三鍵取代基有助于提高吡唑并［1，5-a］嘧啶衍生物的抑菌活性，引入3-氰基-4-氟苯基的化合物7a 抑菌效果要好于引入3-乙炔基苯基的化合物7b。因此，本試驗(yàn)在7a 和7b 的基礎(chǔ)上，對(duì)其5 位進(jìn)行修飾改造，得到化合物8a～8k，通過抑菌結(jié)果的分析可以看出，與修飾前相比，化合物8a～8k 的抑菌活性大部分增強(qiáng)；當(dāng)吡唑并［1，5-a］嘧啶7 位的取代基相同，5 位用不同的取代基進(jìn)行修飾后，5 位引入（哌啶基）哌啶的化合物8f 和8k抑菌活性相對(duì)較好，且化合物8f 的抑菌活性要好于化合物8k。

4 結(jié)論

本研究以7-氯-5-（氯甲基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈為原料，通過對(duì)其7 位及5 位進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計(jì)并合成了17 個(gè)吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈的衍生物，其結(jié)構(gòu)1H NMR、13C NMR 及MS（ESI）表征，通過抑菌試驗(yàn)從1～5，7a，7b 中篩選出了抑菌效果較好的化合物7a 和7b，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其5 位進(jìn)行修飾，得到11 個(gè)化合物8a～8k，并進(jìn)行抑菌試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示，8f 在濃度為12 mmol·L-1時(shí)的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到42.7 mm。表明吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈化合物7 位氨基連有3-氰基-4-氟苯基，5 位取代基為（哌啶基）哌啶時(shí)，體外抗菌活性最好，這為進(jìn)一步研究抗菌譜更廣、抗菌活性更高的新型吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-碳腈類化合物提供了理論依據(jù)。