趙彩良，張潔，唐銳敏，賈小云*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801）

甘薯是世界上營養(yǎng)豐富的塊根作物之一，富含維生素、類胡蘿卜素和花青素等對健康有益的抗氧化成分。黃心甘薯和橘心甘薯都富含類胡蘿卜素。類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，屬于類異戊二烯化合物，其成分主要是反式β-胡蘿卜素，能夠迅速轉(zhuǎn)化為維生素A，在低等生物、藻類、高等植物乃至動物中都普遍存在［1］，表現(xiàn)出黃色、橙紅色或紅色。類胡蘿卜素在植物中具有多種生物學(xué)功能［2-4］。高等植物中類胡蘿卜素的氧化裂解主要由類胡蘿卜素雙加氧酶（CCO）催化，根據(jù)作用底物的不同，將CCO分為類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCDs）和9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加 氧 酶（9-Cis Epoxycarote-noid Dioxygenase，NCEDs）［5］2 種類型。

目前類胡蘿卜素代謝途徑的許多結(jié)構(gòu)基因已從甘薯中分離出來并對其功能做了深入研究。在擬南芥中過表達(dá)甘薯IbGGPS基因增加了葉片α-胡蘿卜素和葉黃素的含量，并提高了植株對滲透壓脅迫的耐受性［6］。從甘薯栽培品種Nongdafu 14的貯藏根中分離獲得IbZDS基因的cDNA，在甘薯中過量表達(dá)后，大大增加了類胡蘿卜素的含量，并提高了植株的耐鹽性［7］。IbCHYB的RNAi 轉(zhuǎn)基因植株的貯藏根為橙色，其總胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的含量比對照提高約2.4 倍和16 倍，同時發(fā)現(xiàn)與對照相比，IbCHYB的RNAi 轉(zhuǎn)基因甘薯中IbNCED的表達(dá)量、ABA 含量和對鹽脅迫的耐受性都增加［8］。NCED3能夠降解類胡蘿卜素，參與植物激素脫落酸（Abscisic Acid，ABA）的生物合成［9］和逆境脅迫響應(yīng)。玉米中NCED基因的功能缺失導(dǎo)致ABA 含量降低，出現(xiàn)葉片萎蔫的表型［10］。AtNCED3過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中ABA 含量及對水分脅迫的耐受性較野生型均得到提高［11］。擬南芥中過量表達(dá)水稻OsNCED3和OsNCED4能增加植株體內(nèi)ABA 含量，同時提高其抗旱性［12］，而NCED基因敲除的植物在受脅迫時，葉片中ABA 的合成能力減弱［13］。但是關(guān)于甘薯塊根中IbNCED3在類胡蘿卜素代謝及逆境響應(yīng)中的功能還知之甚少。

cDNA 酵母文庫的構(gòu)建是提取特定組織或細(xì)胞的總RNA，然后分離其中的mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，將其連接到適當(dāng)?shù)妮d體后轉(zhuǎn)化酵母菌株，最終形成包含某個組織特定發(fā)育時期或特定處理后全部mRNA 信息的重組DNA 克隆群。目前已廣泛通過酵母單雜交（Yeast One-Hybrid，Y1H）和酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）技術(shù)篩選cDNA 酵母文庫，獲得與誘餌蛋白互作的蛋白。酵母單雜交技術(shù)是研究DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的方法，具有操作簡單、假陽性率低等特點。許奕等［14］構(gòu)建了干旱脅迫的香蕉cDNA 文庫并克隆了MaAQP1啟動子，為運用酵母單雜交技術(shù)篩選與MaAQP1啟動子互作的蛋白，解析其作用機制奠定了基礎(chǔ)。黃桂媛等［15］構(gòu)建了巨峰葡萄的酵母單雜交文庫，并篩選了開花相關(guān)基因VvFT啟動子上游的調(diào)控因子，為進(jìn)一步解析VvFT在調(diào)控葡萄開花的分子機制奠定了基礎(chǔ)。葉夏琳等［16］通過構(gòu)建南通小方柿的cDNA 文庫，利用酵母單雜交技術(shù)初步篩選了3 個與DkGA2ox2啟動子互作的蛋白，為探索其上游調(diào)控機制提供了理論支持。

本研究通過Gateway 方法構(gòu)建了甘薯塊根cDNA 酵母文庫，克隆了IbNCED3的啟動子序列，構(gòu)建了誘餌載體pAbAi-NCED3，并利用酵母單雜交技術(shù)篩選甘薯塊根cDNA 酵母文庫中與IbNCED3啟動子互作的蛋白。為后期深入研究IbNCED3在甘薯類胡蘿卜素代謝中的功能及表達(dá)調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、載體與試劑

甘薯品種：‘徐薯18’（XS-18，白心）、‘徐紫薯3 號’（XZS-3，紫心）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，‘紅東’（HD，黃心）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所提供，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院試驗田。生長90 d 后，分別挖取3 個甘薯品種的塊根，洗凈表面泥土，去皮，切成小塊，用液氮速凍后存于-80 ℃冰箱。

酵母文庫構(gòu)建所需的載體和試劑分別由山東歐易生物技術(shù)有限公司（山東，青島）和Invitrogen公司所提供。酵母培養(yǎng)所需的酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Yeast Nitrogen Base，YNB）、金擔(dān)子素A（Aureobasidin A，AbA）缺 陷 型 培 養(yǎng) 基（Do Supplement/-Ura，SD/-Ura 和 Do Supplement/-Leu，SD/-Leu）購自北京Coolaber 公司。酵母菌株Y187、酵母單雜交菌株Y1HGold（Saccharomyces cerevisiae）、誘餌載體pAbAi 及Prey 載體pGADT7均由山東歐易生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 總RNA 的提取與mRNA 的分離純化

將3 個甘薯品種的塊根等量混合，液氮研磨，采用Trizol 法提取甘薯塊根的RNA，提取的總RNA 按 照Oligotex mRNA Midi Kit 說明 書 進(jìn)行mRNA 的分離純化，對得到的RNA 通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白檢測儀NanoDrop 2000C（Thermo Scientifc）檢測其完整性和質(zhì)量。

1.3 cDNA 文庫（Uncut 型）的構(gòu)建

按照CloneMiner 說明書，對符合試驗要求的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA 第一鏈、cDNA 第二鏈，得到雙鏈cDNA。將cDNA 與三框attB1 重組接頭連接，3 種接頭各連接1 份，得到的3 份連接產(chǎn)物混勻后加入TEN Buffer 清洗過的分級柱，對cDNA 分級分離，進(jìn)行BP 重組反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B，加入4 mL SOC 培養(yǎng)基，37 °C 培養(yǎng)1 h 后，得到初級文庫菌液。提取初級文庫質(zhì)粒，建立LP 重組反 應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH10B，37 °C 培養(yǎng)12 h，得到次級文庫菌液。提取次級文庫質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)化子，得到酵母工作液。

1.4 文庫的質(zhì)量鑒定

吸取初級文庫轉(zhuǎn)化后的菌液，稀釋后涂布在含50 μg·mL-1卡那霉素（Kanamycin，Kan）的LB 平板，統(tǒng)計平板上長出的克隆數(shù)，按照庫容量（cfu·mL-1）=平板上的克隆數(shù)/50 μL×100 倍×1×103μL，文庫總庫容量（cfu）=cfu·mL-1×文庫菌液總體積（mL）進(jìn)行計算。同時，隨機挑取單克隆進(jìn)行PCR 反應(yīng)，對文庫的重組率與插入片段的大小進(jìn)行鑒定。

吸取次級文庫轉(zhuǎn)化后的菌液，稀釋后涂布在含50 μg·mL-1氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）LB 平板，按照上述方法進(jìn)行文庫的質(zhì)量鑒定。

吸取梯度稀釋10、100、1000 和10 000 倍的酵母工作液，分別涂布SD/-Leu 平板，統(tǒng)計克隆數(shù)，按照庫容量（cfu·mL-1）=平板上的克隆數(shù)/100 μL×稀釋倍數(shù)×1×103μL 對文庫的庫容量進(jìn)行計算。

1.5 IbNCED3 啟動子的克隆與pAbAi-Bait 誘餌載體的構(gòu)建

IbNCED3啟動子序列（基因組序列上游2000 bp）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所曹清河研究員課題組在‘徐薯18’基因組數(shù)據(jù)庫（未發(fā)表）中比對后提取。根據(jù)所提取的序列設(shè)計IbNCED3啟動子 的 擴 增 引 物 （Pro-NCED3-F： CTGCCTATAGTTGGCCGACC；Pro-NCED3-R：GCACAGATTGAGCAGAGCAG）。將擴增產(chǎn)物測序得到的序列通過網(wǎng)站https：//fruitfly. org/seq_tools/promoter. html 預(yù)測啟動子的核心啟動區(qū)。

合成Bait 序列，并在序列兩端加入酶切位點HindIII 和SalI。 用HindIII 和SalI 雙 酶 切pAbAi 質(zhì)粒，得到純化的線性化pAbAi 片段后與Bait 序列16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通 過100 μg·mL-1的Amp 進(jìn) 行抗性篩選。提 取陽性單克隆的質(zhì)粒DNA，用pAbAi 載體序列上的引物（pAbAi-seq：GTTCCTTATATGTAGCTTTCGACAT）測序，同時對質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證。

1.6 誘餌酵母菌株的獲得

利用同源重組的方法，將誘餌載體整合到Y(jié)1HGold 菌株中。用BstBI 酶對誘餌質(zhì)粒pAbAi-Bait 進(jìn)行單酶切。取1 μg 純化的線性化DNA 轉(zhuǎn)化至Y1HGold 菌株中，吸取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布SD/-Ura平板，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，對生長出的克隆進(jìn)行PCR 鑒 定 （ 檢 測 引 物 ： pAbAi-F：GCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTC 和pAbAi-R：CGGCTACATGGCAGTTTGGAG）。選 擇陽性克隆進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.7 抑制誘餌酵母菌株自激活活性的AbA 濃度

吸取500 μL 1.6 中陽性單克隆菌液，用0.9%的NaCl 重懸至OD600=0.002 時，吸取菌液分別涂布 到SD/-Ura/100 ng·mL-1AbA、SD/-Ura/150 ng·mL-1AbA 和SD/-Ura/200 ng·mL-1AbA 的 平板上。根據(jù)不同平板上單克隆的生長狀況，確定所需AbA 的最適濃度。

1.8 甘薯塊根cDNA 酵母文庫的篩選

將次級酵母文庫質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到誘餌酵母菌株Y1HGold［pAbAi-Bait］中，酵母菌液稀釋10、100、1000 倍后分別涂布于SD/-Leu 平板上，剩余菌液涂布于SD/-Leu/AbA（AbA 添加量為抑制誘餌酵母細(xì)胞自激活的濃度）平板。統(tǒng)計SD/-Leu 平板上的單克隆數(shù)量，用于文庫篩選克隆數(shù)的計算（文庫篩選克隆數(shù)=［cfu·mL-1on SD/-Leu］×［稀釋倍數(shù)］×［重懸體積（6 mL）］）。待SD/-Leu/AbA平板長出單克隆后在SD/-Leu/AbA 平板上重新再次劃線，進(jìn)行二次篩選。以T7-F：TAATACGACTCACTATAGGGC 和 3'AD-R： GTAGATGGTGCACGATGCACAG 為PCR 檢 測 引 物，篩選陽性克隆，送測序。測序序列在NCBI 網(wǎng)站比對，獲取該序列的注釋信息。

1.9 陽性克隆的酵母單雜交驗證

提取1.8 中陽性克隆的酵母質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化誘餌酵母的感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性單克隆，接種于SD/-Leu液體培養(yǎng)基中繁殖培養(yǎng)。用0.9%NaCl 將菌液按1∶10、1∶100、1∶1000 稀釋后，分別點滴于SD/-Leu和SD/-Leu/AbA 平板（AbA 添加量為抑制誘餌酵母細(xì)胞自激活的濃度），倒置于30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 初級文庫的質(zhì)量鑒定

初級文庫轉(zhuǎn)化的菌液稀釋100 倍后，在平板上長出約1400 個單克隆，轉(zhuǎn)化平板的庫容量（cfu·mL-1）=1400 ∕50 μL×100×1000 μL=2.8×106cfu·mL-1，文 庫 的 總 克 隆 數(shù)（cfu）=2.6×106cfu·mL-1×4 mL=1.12×107cfu。24 個隨機挑選的單克隆都擴增得到了條帶，重組率為100%，插入片段大小約在800～2500 bp（圖1）。

圖1 酵母初級文庫的庫容量與插入片段大小的鑒定Fig.1 Identification of yeast primary library capacity and inserted fragment size

2.2 次級文庫質(zhì)量鑒定

次級文庫的轉(zhuǎn)化菌液稀釋100 倍后，在平板上共長出約1800 個單克隆，轉(zhuǎn)化平板的庫容量（cfu·mL-1）=1800 ∕50 μL×100×1000 μL=3.6×106cfu·mL-1，文 庫的 總 克隆 數(shù)（cfu）=3.6×106cfu·mL-1×4 mL=1.44×107cfu。24 個隨機挑選的單克隆都擴增得到了條帶，重組率為100%，插入片段大小約在600～2000 bp（圖2）。

圖2 酵母次級文庫的庫容量與插入片段大小的鑒定Fig.2 Identification of yeast secondary primary library capacity and inserted fragment sizes

2.3 甘薯塊根酵母文庫質(zhì)量鑒定

將次級文庫cDNA轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187。利用血細(xì)胞計數(shù)儀計算細(xì)胞密度：3×107cells·mL-1。對文庫滴度進(jìn)行檢測，轉(zhuǎn)化菌液稀釋10 000倍后取100 μL涂板，共長出約700 個單克隆，轉(zhuǎn)化平板滴度=700∕100 μL×10 000×1000 μL=7×107cells·mL-1。24個隨機挑選的單克隆都擴增得到了條帶，重組率為100%，插入片段大小約在600～2000 bp（圖3）。

圖3 甘薯塊根酵母文庫質(zhì)量鑒定Fig.3 Quality identification of sweet potato root tuber yeast library

2.4 IbNCED3 啟動子的克隆與核心啟動區(qū)分析

選取測序獲得的序列中起始密碼子ATG 上游序列作為啟動子序列，命名為IbNCED3-Pro。網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，IbNCED3-Pro 存在4 個核心啟動區(qū)域（表1），根據(jù)它們的分布位置，選取包括3 和4（-311～-86）區(qū)域序列作為誘餌序列。為了降低誘餌序列在酵母單雜交系統(tǒng)中的自激活活性，去除這些序列中連續(xù)5 個以上的重復(fù)堿基，獲得序列（GTTAATCTTTGAAATCGATTTAATAGC CCGAGTTGTTGACTCATCAATTTAAAGT AACTGTGACAGTCTGTTTCGGTGATATA AGTACTGTACGGGGTCAAATAAGTTAAG CAATAGAGTGGCATTTGCACATATCCAA CACGTGTTTATCTCCTACATGTTAGAAG TGGACCTTAAAGCCTTCTCATTATAAAT GGCCTCTCCCCATATCCCTTCTCCCTAC -CACTGTCTCTTC，下劃線分別表示核心啟動區(qū)域3 和4 的序列）。經(jīng)分析，該序列含有1 個ABA響應(yīng)元件、1 個光響應(yīng)元件與1 個低溫響應(yīng)元件。將其構(gòu)建到酵母單雜交載體pAbAi，命名為pAbAi-NCED3（表2）。

表1 IbNCED3-Pro 的核心啟動區(qū)域Table 1 Core promoter sequence of IbNCED3-Pro

表2 pAbAi-NCED3 誘餌序列的順式作用元件Table 2 Cis-element of bait sequence in pAbAi-NCED3

2.5 誘餌質(zhì)粒的鑒定

將合成的誘餌片段和線性化載體pAbAi 連接，構(gòu)建重組載體pAbAi-NCED3。根據(jù)pAbAi 載體序列，重組載體pAbAi-NCED3 經(jīng)EcoRI、HindIII 雙酶切后應(yīng)產(chǎn)生4866 bp 的大片段和814 bp 的小片段。如圖4 所示，結(jié)果與預(yù)期相符。

圖4 誘餌載體pAbAi-NCED3 的酶切鑒定Fig.4 Identification of pAbAi-NCED3 by enzymatic digestion

2.6 誘餌菌株的轉(zhuǎn)化與鑒定

將構(gòu)建好的誘餌載體pAbAi-NCED3 用BstBI 單酶切線性化后，轉(zhuǎn)化酵母Y1HGold 菌株。通過PCR 檢測誘餌載體是否成功轉(zhuǎn)入Y1HGold 酵母菌株，擴增產(chǎn)物應(yīng)為515 bp。結(jié)果顯示（圖5），轉(zhuǎn)化后的酵母DNA 中得到了500 bp 左右的目的條帶，而陰性對照（水和Y1HGold 菌株）沒有擴出條帶，表明誘餌載體pAbAi-NCED3 成功轉(zhuǎn)入到Y(jié)1HGold 酵母菌株中。

圖5 誘餌菌株pAbAi-NCED3 的PCR 鑒定Fig.5 Identification of positive Y1H with pAbAi-NCED3 by PCR

2.7 篩選誘餌菌株的AbA 最佳使用濃度

如圖6 所示，誘餌酵母Y1H［pAbAi-NCED3］在添加100 ng·mL-1AbA 的SD/-Ura 培養(yǎng)基 上不能生長。因此，誘餌酵母Y1H［pAbAi-NCED3］的AbA 最佳使用濃度是100 ng·mL-1。

圖6 誘餌酵母Y1H［pAbAi-NCED3］在添加不同濃度AbA 平板上的生長情況Fig.6 Growth of bait yeast Y1H［pAbAi-NCED3］on the SD/-Ura plates supplemented with different concentration of AbA

2.8 誘餌載體篩選甘薯塊根cDNA 酵母文庫

將構(gòu)建好的甘薯塊根cDNA 酵母文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘餌菌株Y1H［pAbAi-NCED3］，統(tǒng)計長出的克隆數(shù)。稀釋1000 倍后的菌液在SD/-Leu 平板上共長出17 個單克隆，篩選克隆總數(shù)=17/100 μL×1000×6 mL=1.02×106＞1.0×l06（表3），表明甘薯塊根cDNA 酵母文庫的轉(zhuǎn)化效率符合文庫篩選要求。

表3 誘餌酵母文庫篩選克隆總數(shù)統(tǒng)計結(jié)果Table 3 Summary of total numbers of clones screened by bait yeasts Y1H［pAbAi-Bait］

文庫的初次篩選共獲得17 個單克隆，分別在SD/-Leu/100 mg·mL-1AbA 培養(yǎng)基劃線，經(jīng)二次篩選后共獲得3 個陽性單克隆（圖7）。

圖7 酵母文庫的二次篩選Fig.7 Second screening of yeast library

2.9 陽性克隆的序列分析

挑選PCR 檢測陽性且條帶較亮的產(chǎn)物送測序，獲得的測序結(jié)果在NCBI（https：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）中 比對。Y1H［pAbAi-NCED3］為誘餌篩選到的3 個陽性克隆，其中1 個為DnaJ 蛋白，是廣泛存在于植物中的分子伴侶，可以響應(yīng)各種環(huán)境脅迫；1 個為FRIGIDA-Like 蛋白，是春化途徑中調(diào)控開花的重要蛋白；1 個為功能未知蛋白（表4）。

2.10 酵母單雜交驗證

將表4 中列出的以Y1H［pAbAi-NCED3］為誘餌篩選到的3 個陽性克?。ň幪?、2、3）進(jìn)行酵母單雜交驗證，結(jié)果顯示（圖8），在SD/-Leu 上，誘餌酵母細(xì)胞都能生長，說明AD 質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入誘餌酵母細(xì)胞。在添加100 ng·mL-1AbA 的缺陷型培養(yǎng)基SD/-Leu/100 ng·mL-1AbA 上，陽性對照與3 個陽性克隆均能生長，表明3 個陽性克隆均與IbNCED3啟動子互作。

圖8 IbNCED3 啟動子互作蛋白的酵母單雜交驗證Fig.8 Validation of proteins interacted with promoter of IbNCED3 by Yeast One-Hybrid

表4 Y1H［pAbAi-NCED3］為誘餌篩選到的序列信息Table 4 Sequence information of clones interacted with Y1H［pAbAi-NCED3］

3 討論

cDNA 文庫質(zhì)量的高低與庫容量和平均插入片段的長度相關(guān)，庫容量越大，文庫所涵蓋的信息越完整。當(dāng)cDNA 文庫庫容量大于1×106時，才能確保篩選到低豐度的基因［17］。本研究構(gòu)建的甘薯塊根cDNA 酵母文庫的庫容量達(dá)到了1.12×107，高于1×106，重組率為100%，片段插入長度為600～2500 bp，說明該酵母文庫質(zhì)量較高。

在構(gòu)建好的甘薯塊根cDNA 酵母文庫中，通過酵母單雜交技術(shù)篩選到了3 個與IbNCED3啟動子互作的蛋白，測序序列經(jīng)NCBI 比對顯示，與1號克隆相似性最高的序列為未知蛋白；與2 號克隆相似性最高的序列為XM_031256956.1（Ipomoea triloba）-DnaJ 蛋白，一種熱激蛋白，響應(yīng)各種生物和非生物脅迫；與3 號克隆相似性最高的序列為

XM_031247458.1（Ipomoea triloba）-FRIGIDALike（FRL）蛋白，是春化途徑中影響開花的一種蛋白。番茄中DnaJ 蛋白（SlDnaJ20）的表達(dá)受冷害、NaCl、聚乙二醇和H?O?誘導(dǎo)，尤其在熱脅迫下大量表達(dá)，SlDnaJ20的過量表達(dá)增強了轉(zhuǎn)基因番茄的耐熱性［18］。OR 蛋白也屬于DnaJ 蛋白的一種［19］，研究表明它可以穩(wěn)定PSY 的活性，促進(jìn)類胡蘿卜素的生物合成并提 高 植 物 的 抗 逆 性［20-21］。Risk［22］等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，至少存在7 個同源基因與FRI共同構(gòu)成FRIGIDA-Like 基因家族。FRIGIDA（FRI）基因和FLOWERING LOCUS C（FLC）基因參與開花調(diào)控的春化途徑［23］，對開花具有決定性作用。FLC抑制開花，F(xiàn)RI通過促進(jìn)FLC的表達(dá)而推遲植物開花［24］。FRI功能喪失型擬南芥，體內(nèi)FLC水平降低，植物提前開花［25］，而具有FRI顯性基因的擬南芥，則促進(jìn)FLC的表達(dá)，植物晚開花［26］。這表明IbNCED3可能通過 與DnaJ 蛋白和FRIGIDA-Like 蛋白互作參與植物類胡蘿卜素代謝、脅迫響應(yīng)和開花調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究采用Gateway 方法構(gòu)建了高質(zhì)量的甘薯塊根cDNA 酵母文庫，文庫的庫容量、重組率及插入片段的大小均符合文庫篩選條件，可用于通過酵母單雜交和酵母雙雜交技術(shù)篩選誘餌載體的互作蛋白。利用酵母單雜交技術(shù)在甘薯塊根cDNA 酵母文庫中篩選并驗證了3 個與IbNCED3啟動子互作的蛋白。