陳志江 阮紫曦 程 楠 肖利娟, 彭 亮, 韓博平, 雷臘梅,

(1. 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)學(xué)系, 廣州 510632; 2. 廣東省水庫藍(lán)藻水華防治中心, 廣州 510632)

拉氏擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii,簡稱擬柱孢藻)為念珠藻科, 柱孢藻屬, 最近有研究者建議將尖頭藻和擬柱孢藻合并, 稱該藻為拉氏尖頭藻(Raphidiopsis raciborskii)[1]。擬柱孢藻是一種具有固氮能力的絲狀水華藍(lán)藻, 對(duì)氮、磷營養(yǎng)鹽的利用效率高, 對(duì)溫度和光照波動(dòng)的適應(yīng)性強(qiáng), 目前已廣泛分布世界各地的淡水水體中, 可在熱帶地區(qū)的湖泊和水庫中常年形成水華, 在亞熱帶和溫帶水體形成季節(jié)性水華[2,3]。擬柱孢藻還可產(chǎn)生擬柱孢藻毒素(Cylindrospermopsin, CYN)和石房蛤毒素(Saxitoxin, STX)等藍(lán)藻毒素, 嚴(yán)重危害人類健康和淡水生態(tài)系統(tǒng)安全[4—6]。

全基因組測序是對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體基因組測序的一項(xiàng)技術(shù), 1977年第一代測序技術(shù)誕生, 至21世紀(jì)以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為代表的第二代高通量測序的廣泛應(yīng)用, 極大推動(dòng)了不同物種基因組研究進(jìn)展[7], 隨后的第三代技術(shù)向序列讀長長, 精度高方向發(fā)展[8]。全基因組測序可揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性, 對(duì)了解一個(gè)物種的分子進(jìn)化、基因組成和基因調(diào)控等方面具有重要的意義[9]。目前三代測序技術(shù)已在水華藍(lán)藻中得到廣泛應(yīng)用, 如2016年發(fā)布的片狀微囊藻(Microcystis panniformis)FACHB-1757基因組數(shù)據(jù)[10]及2018年發(fā)布的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)NIES-2481基因組數(shù)據(jù)[11], 都使用了三代測序技術(shù)。研究者們利用測序技術(shù)對(duì)藍(lán)藻基因組的解析促進(jìn)了他們對(duì)該物種的生態(tài)學(xué)、生理學(xué)和毒素合成機(jī)制等相關(guān)特性的了解, 同時(shí)基于比較基因組的分析進(jìn)一步揭示了它們的全球地理分布與進(jìn)化起源[12,13]。

相比較而言, 擬柱孢藻的基因組研究相對(duì)較晚。2009年, 美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布了最早完成全基因組測序的擬柱孢藻藻株CS-505(C. raciborskiiCS-505), 該藻株的基因組相對(duì)較小, 為3.89 Mb, 在當(dāng)時(shí)已完成全基因組測序的絲狀藍(lán)藻中, 擬柱孢藻是除尖頭藻外基因組最小的絲狀藍(lán)藻[14]。Stucken等[14]通過基因組分析發(fā)現(xiàn)擬柱孢藻CS-505基因組存在水平基因轉(zhuǎn)移, 并探討了其絲體形成、異形胞發(fā)育及固氮能力的分子基礎(chǔ)。Sinha等[15]于2014年通過比較基因組發(fā)現(xiàn)澳大利亞產(chǎn)毒與非產(chǎn)毒擬柱孢藻的最大區(qū)別是擬柱孢藻毒素合成酶基因簇是否存在。隨著擬柱孢藻在全球的快速擴(kuò)張, 人們對(duì)更多來源不同的擬柱孢藻開展了全基因組測序, 如2018年Willis等[16]和Abreu等[17]分別進(jìn)行了同一地區(qū)的9株擬柱孢藻和不同地區(qū)的8株擬柱孢藻的比較基因組分析, 以期為該藻靈活的生理生態(tài)策略、個(gè)體發(fā)育及逆境應(yīng)答等研究提供參考[16,17]。

磷是藍(lán)藻生長必需的營養(yǎng)元素, 分無機(jī)磷、有機(jī)磷兩大類, 藍(lán)藻基因組中存在多種用于吸收不同磷源的機(jī)制[18], 其中低親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)存在于部分藍(lán)藻中, 以適應(yīng)在高磷環(huán)境下吸收無機(jī)磷,高親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在藍(lán)藻中普遍存在, 可在低磷環(huán)境下吸收無機(jī)磷。此外, 藍(lán)藻中還存在雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)用于調(diào)節(jié)磷代謝、有機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體介導(dǎo)磷酸酯的轉(zhuǎn)運(yùn)、C-P裂解酶裂解磷酸酯和堿性磷酸酶特異性水解磷酸單酯[18—22], 藍(lán)藻的磷調(diào)控機(jī)制高度多樣化, 以適應(yīng)不同的生活環(huán)境[18]。擬柱孢藻擁有快速吸收和儲(chǔ)存無機(jī)磷的能力, 不但能在高磷環(huán)境中生長良好, 還能適應(yīng)低磷環(huán)境, 在無機(jī)磷濃度極低的環(huán)境中占優(yōu)勢[6,23,24], 已有研究發(fā)現(xiàn)在擬柱孢藻CS-505和CS-506中存在以上完整的磷調(diào)控機(jī)制[25]。目前關(guān)于擬柱孢藻磷代謝基因排列特征的描述較為匱乏, 從基因組水平上分析擬柱孢藻磷代謝途徑基因?qū)⒓由顚?duì)擬柱孢藻生存優(yōu)勢形成的認(rèn)識(shí), 進(jìn)一步了解磷代謝以及磷在基因型選擇和進(jìn)化中發(fā)揮的作用[18]。

迄今為止, 美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫已有27株擬柱孢藻全基因組測序信息, 其中一半以上的藻株來自澳大利亞, 目前尚未有中國地區(qū)擬柱孢藻全基因組數(shù)據(jù)的發(fā)布。近年來, 擬柱孢藻在廣東省大部分水庫常年存在并取代微囊藻成為危害該地區(qū)水庫供水安全的首要藍(lán)藻, 在廣東省江門市鎮(zhèn)海水庫中常年優(yōu)勢度可達(dá)93.5%, 目前已有的研究多關(guān)注于環(huán)境因子對(duì)擬柱孢藻優(yōu)勢形成的影響[21,22]。本文以從鎮(zhèn)海水庫中分離的擬柱孢藻N8為材料, 進(jìn)行測序及基因組分析, 并針對(duì)其親緣關(guān)系、毒素合成基因和磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因進(jìn)行了初步探索。本研究的開展有助于了解華南地區(qū)擬柱孢藻的基因組特性, 豐富擬柱孢藻基因組數(shù)據(jù)庫,從分子水平上加深人們對(duì)擬柱孢藻生態(tài)優(yōu)勢形成的認(rèn)識(shí), 為有效防控?cái)M柱孢藻水華提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 擬柱孢藻N8的來源與培養(yǎng)

擬柱孢藻N8分離自廣東省江門市鎮(zhèn)海水庫(22°34′7′′N、112°32′58′′E), 其藻絲體筆直不彎曲,可形成端生的長圓形或卵圓形異形胞[21]。藻株置于光照強(qiáng)度為35 μmol/(m2·s)、溫度為(25.5±1)℃、光暗周期比為12h﹕12h的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng), 使用的培養(yǎng)基為BG11[25]。

1.2 擬柱孢藻N8基因組DNA的提取

使用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)按照制造商的說明從樣本中提取高質(zhì)量的基因組DNA。使用Nanodrop One核酸分析儀測定DNA樣品260和280 nm處的光吸收值, 根據(jù)A260/A280的比值確定DNA純度(1.8

1.3 全基因組測序與組裝

使用PacBio RS測序系統(tǒng)的SMRT(Single Molecule Real-Time)[26]技術(shù)進(jìn)行測序, 利用PacBio?SMRTbellTMTemplate Prep Kit(PacBio, 美國)構(gòu)建文庫, 在PacBio RS II平臺(tái)上進(jìn)行測序反應(yīng)。用Pac-Bio SMRT Analysis 5.1[23]軟件進(jìn)行質(zhì)控并組裝成一條環(huán)狀的基因組序列。以上工作委托北京諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.4 基因組注釋

使用RepeatMasker 4.1.2[27]、RNAmmer 1.2[28]、tRNA-scan-SE 2.0[29]和GeneMarkS 4.28[30]分別進(jìn)行重復(fù)序列、非編碼RNA、tRNA和編碼基因的預(yù)測;后將編碼基因與COG數(shù)據(jù)庫[31]、SwissProt蛋白庫[32]、GO數(shù)據(jù)庫[33]和KEGG數(shù)據(jù)庫[34]進(jìn)行比對(duì), 使用Circos 0.69軟件[35]繪制全基因組圖譜。

1.5 親緣關(guān)系分析

我們挑選了24株來自不同產(chǎn)地及不同產(chǎn)毒特性擬柱孢藻全基因組單拷貝基因進(jìn)行親緣關(guān)系分析, 手動(dòng)將同一株藻的全基因組單拷貝基因序列進(jìn)行排序和串聯(lián), 采用MEGA 6.0[36]對(duì)25株藻的全基因組單拷貝基因進(jìn)行序列比對(duì), 以串聯(lián)序列為材料利用iqtree軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 程序中的ModelFinder模塊自動(dòng)計(jì)算出最大似然法(ML)的最佳擬合進(jìn)化模型為GTR+F+G4模型, 系統(tǒng)樹各分支的置信度由重復(fù)抽樣法(Bootstrap)1000次重復(fù)檢測,同時(shí)使用MEGA 6.0構(gòu)建最大似然(ML)進(jìn)化樹, 以確定進(jìn)化樹的可靠性, 進(jìn)化樹的編輯器使用iTOL的在線版本(https://itol.embl.de)。

1.6 產(chǎn)毒潛力分析

通過antiSMASH 6.0軟件(微生物次生代謝物合成基因簇?cái)?shù)據(jù)庫)[37], 結(jié)合注釋信息搜索對(duì)應(yīng)于次生代謝物非核糖體肽合成酶(NRPS)、聚酮化合物合酶(PKS)產(chǎn)生的CYN合成酶基因簇和STX合成酶基因簇。

1.7 磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因分析

根據(jù)KEGG代謝通路注釋結(jié)果結(jié)合基因的序列相似性和位置相關(guān)性, 找到對(duì)應(yīng)的核苷酸/蛋白質(zhì)序列, 放到NCBI上的Nucleotice/Protein Blast上比對(duì), 從而確定基因組中磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因, 包括雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng), 低親和力、高親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),有機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體, C-P裂解酶和堿性磷酸酶基因, 繪制基因簇排列圖。

經(jīng)過我們的分析, 挑選出8株擬柱孢藻進(jìn)行磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因分析, 8株藻株分別代表了三大地區(qū)(歐亞地區(qū)、南美地區(qū)和澳大利亞地區(qū))和不同產(chǎn)毒特性(產(chǎn)CYN、STX和非產(chǎn)毒)的擬柱孢藻。

2 結(jié)果

2.1 擬柱孢藻N8基因組的基本信息

擬柱孢藻N8的基因組覆蓋率為121, 平均測序質(zhì)量為0.85, Contig N50值為3865242 bp, 基因組大小為3857174 bp, 呈現(xiàn)一條環(huán)狀的染色體, GC含量為40.13%, 注釋得到的基因總數(shù)為3598, 結(jié)構(gòu)RNA基因?yàn)?1個(gè), 其中tRNA基因42個(gè), 5S-16S-23S rRNA基因各3個(gè)(圖 1)。該藻株的全基因組序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫, 索引編號(hào)為GCA_018139025.1。

圖1 擬柱孢藻N8的全基因組圖譜Fig. 1 The whole genome map of C. raciborskii N8

2.2 擬柱孢藻N8的數(shù)據(jù)庫注釋

COG注釋(圖 2a): 在擬柱孢藻N8功能分布的基因數(shù)目中, 細(xì)胞壁/膜/包膜合成相關(guān)基因(M)有210個(gè), 所占比例最高, 為5.92%; 而染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)相關(guān)基因(B)只有1個(gè), 所占比例最低, 為0.03%。

KEGG注釋(圖 2b): KEGG中PATHWAY數(shù)據(jù)庫注釋到擬柱孢藻N8涉及的基因通路有142條, 其中完整的或者有關(guān)鍵酶可以完成代謝的通路有102條, 新陳代謝系統(tǒng)部分存在的完整通路最多, 有76條。

GO注釋(圖 2c): 擬柱孢藻N8在分子功能類注釋到了2814個(gè)相關(guān)基因, 其中所占比例較大的有黏合物相關(guān)基因1135個(gè)、催化活性相關(guān)基因1267個(gè)及運(yùn)輸活性相關(guān)基因137個(gè), 占該組分基因的90.23%; 在細(xì)胞學(xué)組件分類部分注釋到了2190個(gè)相關(guān)基因, 其中所占比例較大的有細(xì)胞器相關(guān)基因177個(gè)、高分子復(fù)合物相關(guān)基因236個(gè)、復(fù)雜大分子及細(xì)胞和細(xì)胞元件相關(guān)基因各783個(gè), 占該組分注釋基因的90.37%; 在生物學(xué)途徑類注釋到了4869個(gè)相關(guān)基因, 其中占比較大的有代謝過程相關(guān)基因1417個(gè); 細(xì)胞過程相關(guān)基因1332個(gè)、定位相關(guān)基因365個(gè)、形成定位相關(guān)基因358個(gè)、生物調(diào)節(jié)相關(guān)基因329個(gè)、生物過程監(jiān)管相關(guān)基因、應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因220個(gè)和細(xì)胞成分組織或生物起源相關(guān)基因122個(gè), 占該組分注釋基因的85.01%。

圖2 擬柱孢藻N8的COG (a)、KEGG (b)和GO (c)數(shù)據(jù)庫注釋圖Fig. 2 COG (a), KEGG (b) and GO (c) database notes of C. raciborskii N8

2.3 擬柱孢藻基因組基本信息的比較

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜尋了27株擬柱孢藻的全基因組序列(其中CS-505和CS505為同一藻株, 采用了不同測序方法, 部分藻株數(shù)據(jù)未完善故未采納), 表 1顯示了27株擬柱孢藻的基因組基本信息。由表 1可知, 當(dāng)前數(shù)據(jù)庫中完成測序的藻株主要來自澳大利亞和巴西, 分別有13株和6株, 烏拉圭和美國各有2株, 新加坡、韓國、荷蘭各有1株。不同來源的擬柱孢藻基因組的GC含量穩(wěn)定, 維持在40.1 %左右,大小在2.74—4.16 Mb, 其中美國藻株LB2897的基因組最小, 約為2.749 Mb, 澳大利亞藻株CS505基因組最大, 約為4.159 Mb。在這些藻株中(除KL1藻株產(chǎn)毒未知外), 僅8株藻株不產(chǎn)毒, 18株藻株為產(chǎn)毒株, 其中來自南美的巴西和烏拉圭的擬柱孢藻產(chǎn)毒素STX, 來自澳大利亞(11株)和新加坡(1株)的擬柱孢藻產(chǎn)毒素CYN及其異構(gòu)體。采用的測序技術(shù)以第二代測序技術(shù)為主, 分為Roche 454技術(shù)、Illumina Solexa技術(shù)和ABI SOLID技術(shù), 擬柱孢藻N8、CS505和GIHE 2018采用第三代測序技術(shù)—SMRT技術(shù)。

表1 NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的擬柱孢藻藻株基因組基本信息Tab. 1 Basic information on the genome of C. raciborskii strains downloaded from NCBI

2.4 親緣關(guān)系分析

基于擬柱孢藻的全基因組單拷貝基因構(gòu)建了擬柱孢藻N8的親緣關(guān)系樹, 采用最大似然法(ML)。由圖 3可知24株擬柱孢藻有3大分支, 來自南美地區(qū)的擬柱孢藻屬第Ⅰ分支, 來自亞歐地區(qū)的擬柱孢藻屬第Ⅱ分支, 來自澳大利亞地區(qū)的擬柱孢藻屬第Ⅲ分支。

圖3 基于全基因組單拷貝基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(ML)Fig. 3 Phylogenetic tree based on whole genome single copy gene construction (ML)

擬柱孢藻N8屬第Ⅱ分支, 與來自韓國的擬柱孢藻GIHE 2018的親緣關(guān)系最近。

2.5 擬柱孢藻N8的毒素合成酶基因簇分析

在擬柱孢藻N8的基因組中未發(fā)現(xiàn)CYN合成酶基因簇和STX合成酶基因簇, 推斷擬柱孢藻N8不能產(chǎn)生毒素CYN和STX。

2.6 八株擬柱孢藻的磷代謝基因組成分析

對(duì)N8和其他7株來自不同地區(qū)的擬柱孢藻進(jìn)行比較分析[Cr2010(荷蘭), GIHE 2018(韓國), CS505、CO3和SO1(澳大利亞), CENA302和MVCC19(南美洲)], 結(jié)果表明不同地區(qū)的擬柱孢藻, 其磷代謝基因拷貝數(shù)目不同, 磷調(diào)控多樣化。研究的8株擬柱孢藻基因組中都存在雙組分調(diào)控系統(tǒng)phoB和phoR, 低親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。多數(shù)藻株有2個(gè)有機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)phnD-C-E, 來自巴西的擬柱孢藻CENA302只有1個(gè)phnD, 擬柱孢藻N8比其他藻株多1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白-phnF和1個(gè)有機(jī)磷酸鹽代謝蛋白(金屬依賴性)-phnM。8株藻中大多有2個(gè)或2個(gè)以上phoA堿性磷酸酶基因, 來自荷蘭的擬柱孢藻Cr2010僅有1個(gè)phoA基因拷貝（表 2）。

表2 八株擬柱孢藻磷吸收、調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝基因及拷貝數(shù)Tab. 2 Phosphorus absorption, regulation, transport, metabolism genes and copies of eight C. raciborskii strains

如圖 4和圖 5所示, 8株擬柱孢藻的高親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)按照pstS-C-A-B順序排列的,sphX在擬柱孢藻的位置不定, 可位于pstS-C-A-B的上游或下游, 擬柱孢藻的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)phoB-phoR形成簇, 擬柱孢藻的2個(gè)有機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子phnC-DE, 兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子的方向可同可不同, C-P 裂解酶基因按phnFHGIJKLM排列, 除擬柱孢藻N8和擬柱孢藻GIHE 2018外, 其余藻株的phnFH與phn-GIJKLM簇距離較遠(yuǎn)。

圖4 8株擬柱孢藻的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)和高親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Fig. 4 Two-component regulatory system and high affinity inorganic phosphorus transport system of eight strains of C. raciborskii

圖5 8株擬柱孢藻的有機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體和C-P裂解酶基因Fig. 5 Organic phosphonate transport complex and C-P lyase gene of eight strains of C. raciborskii

3 討論

3.1 擬柱孢藻的基因組特征

自Stucken等[14]發(fā)布第一個(gè)擬柱孢藻全基因組信息后, 近10年來陸續(xù)有不同來源的擬柱孢藻完成測序。已公布全基因組序列的擬柱孢藻主要來自澳洲和南美洲, 2019年, 2020年發(fā)表了荷蘭藻株Cr2010[43]、韓國藻株GIHE2018[42]、美國藻株LB2897與KL1[45,47], 目前NCBI數(shù)據(jù)庫上還沒有中國地區(qū)擬柱孢藻的全基因組信息, 本研究測序的擬柱孢藻N8將成為中國地區(qū)首株具有全基因組信息的藻株。

擬柱孢藻N8與NCBI上已公布的其他國家的藻株在基因組大小、GC含量和基因數(shù)量等基本特征較為一致, NBCI上已發(fā)布的擬柱孢藻大都采用第二代測序法進(jìn)行測序, 僅CS505、GIHE 2018藻株采用了三代測序技術(shù)。二代測序技術(shù)具有高效率、高通量和高精度的特點(diǎn), 應(yīng)用廣泛, 但拼接的基因組受序列讀長的限制, 其結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于較高的測序覆蓋度和準(zhǔn)確的序列拼接技術(shù)[48]。擬柱孢藻N8采用第三代測序技術(shù), 該技術(shù)改進(jìn)了序列組裝, 序列讀長長, 精度高, 在測序的同時(shí)能夠獲取全基因組甲基化修飾信息, 其測序結(jié)果也相對(duì)完善[8]。N8的contig N50值為3865242 bp, 這在通過Pac-Bio平臺(tái)測序的已公布的擬柱孢藻基因組中, 擬柱孢藻N8的N50值僅次于CS505的4011384 bp, 測序得到N8的基因組大小為3.857 Mb, 與澳大利亞藻株S01、S14等基因組大小相近, 其GC含量穩(wěn)定, 維持在40.1 %左右。擬柱孢藻N8的編碼基因有3598個(gè),這可能與擬柱孢藻N8的重疊基因較多, 除核心基因組外, 本身也需更多特異的編碼蛋白維持機(jī)體功能相關(guān)[14—17]。但也可能是本研究采用了精度更高的測序技術(shù), 且隨著數(shù)據(jù)庫的不斷完善, 從而有更多編碼蛋白被檢測到。

擬柱孢藻N8數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果與其他擬柱孢藻的注釋結(jié)果有極大相似性[15,17], 具有注釋功能的基因主要涉及: 蛋白質(zhì)代謝、協(xié)同因子和維生素代謝、氨基酸及其衍生物、碳水化合物代謝。但不同產(chǎn)地、不同形狀、不同產(chǎn)毒特征的藻株注釋到的基因比例不同[15—17], 如來自南美藻株在生物學(xué)途徑分類部分中涉及刺激反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)的基因占比最多, 非南美藻株在細(xì)胞學(xué)組件分類部分的膜基因占比最多, 產(chǎn)STX藻株在細(xì)胞學(xué)組件分類部分的包膜基因占比最多, 產(chǎn)CYN藻株在細(xì)胞學(xué)組件分類部分的膜基因占比最多[17], 卷曲藻株基因組中存在直藻株所沒有的與卷曲形態(tài)相關(guān)的涉及碳水化合物代謝的蛋白質(zhì)[16], 擬柱孢藻N8在COG注釋中, 細(xì)胞壁/膜/包膜合成相關(guān)基因所占比例最多。在GO注釋中, 細(xì)胞學(xué)組件分類部分所占比例較大的是高分子復(fù)合物相關(guān)基因、復(fù)雜大分子及細(xì)胞和細(xì)胞元件相關(guān)基因; 生物學(xué)途徑類占比最多的是代謝過程相關(guān)基因。注釋基因比例的不同反映了擬柱孢藻間不同的生態(tài)適應(yīng)與生理可塑性能力[14]。

3.2 擬柱孢藻的親緣關(guān)系與產(chǎn)毒特征

目前擬柱孢藻的全基因組數(shù)據(jù)相對(duì)匱乏, 非洲藻株尚未有全基因組數(shù)據(jù)發(fā)表。在探討世界范圍內(nèi)擬柱孢藻的系統(tǒng)進(jìn)化和起源時(shí), 有研究認(rèn)為多個(gè)遺傳標(biāo)記的共建樹比單個(gè)遺傳標(biāo)記的區(qū)分能力更強(qiáng)大, 例如Haande等[53,54]發(fā)現(xiàn)pc-IGS、nifH、ITSL和rpoC1等單個(gè)基因建樹不能區(qū)分澳大利亞、非洲和歐洲的藻株, 但4個(gè)遺傳標(biāo)記共建樹能夠?qū)⒎侵蕖拇罄麃?、歐洲和美洲的藻株完全區(qū)分, 基于多個(gè)基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹會(huì)比單個(gè)基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果更加可靠, 我們通過全基因組單拷貝基因構(gòu)建擬柱孢藻N8的系統(tǒng)發(fā)育樹(ML), 發(fā)現(xiàn)來自廣東省的擬柱孢藻N8與亞歐地區(qū)的擬柱孢藻GIHE 2018、CR12和Cr2010的親緣關(guān)系相近, 可見同種不同株系的擬柱孢藻, 雖然地理距離隔得遠(yuǎn),但從枝長信息看, 親緣關(guān)系也很接近。

產(chǎn)毒與非產(chǎn)毒藻株的最大的區(qū)別是非產(chǎn)毒藻株中沒有毒素合成酶基因簇的存在[15], 擬柱孢藻N8基因組里沒有發(fā)現(xiàn)CYN合成酶基因簇和STX合成酶基因簇, 推斷N8不產(chǎn)毒素CYN和STX。在NCBI公布的全基因組數(shù)據(jù)里, CS-508、CS-509、CYLP、GIHE 2018和LB2897也均為非產(chǎn)毒藻株[15,38,41,42,45]。

3.3 擬柱孢藻的磷吸收代謝通路

擬柱孢藻N8分離自廣東省鎮(zhèn)海水庫, 該水庫中TN/TP比為37—243, 顯著高于浮游植物和大多數(shù)其他生物對(duì)氮、磷兩種元素的相對(duì)需求-Redfield比(N/P=16), 表明該水庫全年均處于磷限制性狀態(tài)[24],而擬柱孢藻在鎮(zhèn)海水庫中常年的優(yōu)勢度可達(dá)93.5%,表明該藻能適應(yīng)低磷環(huán)境。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn), N8藻株對(duì)磷的適應(yīng)范圍很寬, 在0.02—5.12 mg/L磷濃度下均能生長[23]。本研究進(jìn)一步證實(shí)擬柱孢藻N8的基因組擁有完整的磷吸收代謝通路, 可能是該藻能適應(yīng)低磷和磷波動(dòng)環(huán)境的分子基礎(chǔ)。

Bai等[55]比較了非產(chǎn)毒的擬柱孢藻Cylindrospermopsis raciborskiiFACHB 1096和銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa205在不同磷源的生長情況,在K2HPO4, β-甘油磷酸酯, (2-氨基乙基)-次膦酸、草甘膦和無磷的條件下, 擬柱孢藻FACHB 1096的比生長速率和內(nèi)源性堿性磷酸酶活性比銅綠微囊藻 205的更高, 這側(cè)面反映了擬柱孢藻比其他藻類擁有更有效的磷利用機(jī)制。擬柱孢藻擁有高親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng), 該系統(tǒng)在藍(lán)藻中保守存在, 排列方式為pstS-C-A-B[18], 受低磷環(huán)境的影響, 有些藍(lán)藻可擁有多個(gè)高親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[50], 在擬柱孢藻N8基因組中僅有一個(gè)完整的pstS-C-A-B基因簇, 額外存在pstS拷貝, 盡管存在多個(gè)pstS拷貝, 但一般只有一個(gè)pstS的基因表達(dá)能對(duì)磷變化做出有效性的響應(yīng)[51]; 在某些藻類基因組中, 高親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體還包括了1個(gè)磷酸鹽結(jié)合亞基sphX[18,52],sphX與pstS-C-A-B形成操縱子, 擬柱孢藻N8的sphX位于pstS-C-A-B上游, 擬柱孢藻N8具有較高的磷親和性, 在低磷環(huán)境下能維持生長[23],sphX的存在與否及位置差異在不同藍(lán)藻中情況不同[18], 是否對(duì)磷吸收親和力產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。低親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在藍(lán)藻中不是普遍存在的[20], 而擬柱孢藻N8與其他擬柱孢藻一樣擁有低親和力無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[25], 推斷該系統(tǒng)的存在有利于其在高磷環(huán)境下吸收無機(jī)磷, 更能適應(yīng)環(huán)境中磷濃度的變化[6,23,25]。擬柱孢藻N8的C-P裂解酶基因按phnFHGIJKLM排列, 有2個(gè)操縱子phnCDE, 用于有機(jī)膦的吸收和同化, 擬柱孢藻N8比其他7株藻株多一個(gè)phnF與phnM, 這可能導(dǎo)致藻株間有機(jī)磷轉(zhuǎn)化能力的差異[48,51]。擬柱孢藻N8中編碼堿性磷酸酶基因?yàn)閜hoA, 有2個(gè)拷貝, 與其他擬柱孢藻的堿性磷酸酶拷貝數(shù)不一致[50], 藍(lán)藻中的堿性磷酸酶活性可以隨磷濃度大小而變化的, 拷貝數(shù)目不同反映了藻株間不同的有機(jī)磷利用效率[22]。由以上討論可見,擬柱孢藻N8的磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)通路在基因拷貝數(shù)目與排列順序等與其他藻株存在差異, 今后可從比較基因組學(xué)結(jié)合生理實(shí)驗(yàn)入手, 進(jìn)一步探討不同擬柱孢藻間磷吸收調(diào)節(jié)機(jī)制, 從而解析擬柱孢藻在磷限制水體中占優(yōu)勢的原因。