吳雪陽(yáng) 郭紅會(huì) 況 宇 張 策 楊 慧 湯 蓉, 張 曦, 李大鵬, 李 莉,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2. 長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心, 武漢 430070;3. 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070; 4. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070)

近年來(lái), 我國(guó)極為重視水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境污染和發(fā)展之間關(guān)系, 并以綠色發(fā)展為理念, 積極通過(guò)實(shí)施“五大行動(dòng)”推進(jìn)水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖。氨氮是魚(yú)類蛋白質(zhì)分解代謝的最終產(chǎn)物, 主要通過(guò)鰓排泄到周圍環(huán)境中[1—3]。水體中氨氮以離子氨(NH4＋)和非離子氨(NH3)兩種形式存在, 其中, NH3具有很好的脂溶性, 能夠自由地穿過(guò)生物膜, 對(duì)魚(yú)類毒性較大; 而NH4

＋只能通過(guò)離子交換進(jìn)入生物體內(nèi), 對(duì)魚(yú)類的毒性相對(duì)較小[4]。隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展, 大量殘餌及糞便在水體中積累并轉(zhuǎn)化為氨氮, 使得養(yǎng)殖環(huán)境中氨氮含量迅速升高。高濃度的氨氮對(duì)魚(yú)類的發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖造成嚴(yán)重威脅, 特別是在魚(yú)類的早期生長(zhǎng)階段[5—7]。為解決氨氮對(duì)水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖發(fā)展的制約, 氨氮脅迫對(duì)魚(yú)類應(yīng)激和健康的影響越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

氨氮最先通過(guò)鰓上皮細(xì)胞進(jìn)入鰓組織, 使鰓組織嚴(yán)重病變, 導(dǎo)致鰓組織出現(xiàn)壞死、溶血、血紅蛋白缺乏、耗氧量減少和呼吸障礙[8,9]。進(jìn)入體內(nèi)的氨氮可以直接影響生物體內(nèi)物質(zhì)代謝以及損傷神經(jīng)系統(tǒng), 從而引起應(yīng)激反應(yīng)影響機(jī)體的健康[3,10,11]。氨氮也可影響細(xì)胞內(nèi)的NO和Ca2+濃度, 導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生, 進(jìn)而使得DNA和類固醇組件損傷、酶失活和脂質(zhì)過(guò)氧化等, 最終造成生物體各種生理病變[12—16]。近年來(lái)研究表明, 氨氮對(duì)魚(yú)類抗氧化系統(tǒng)的影響根據(jù)魚(yú)種類和氨暴露濃度不同而有所差異: 氨氮暴露會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性激活, 抵抗氨氮氧化脅迫[17—20]; 氨氮暴露也可抑制魚(yú)體抗氧化系統(tǒng), 使得SOD和CAT活力隨著氨氮濃度的升高而下降[21]。此外, 當(dāng)魚(yú)類處于應(yīng)激狀態(tài), 其特異性和非特異性免疫防御體系的功能也會(huì)受到不同程度的影響, 導(dǎo)致機(jī)體對(duì)各類病原敏感性的升高[22—25]。大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚(yú)在氨氮暴露后,腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細(xì)胞介素1β(IL1β)基因表達(dá)水平均顯著性上調(diào), 溶菌酶(LYZ)表達(dá)水平顯著性下調(diào), 干擾先天性免疫反應(yīng)[26]。相似地, 氨氮暴露可誘導(dǎo)河豚(Takifugu obscurus)肝臟中B細(xì)胞因子、tnfα、il-6和il-12的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平升高[27]。氨氮暴露也可以提高魚(yú)體內(nèi)LYZ活力和補(bǔ)體(C3, C4)含量以及免疫球蛋白水平, 促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答[28,29]。綜上所述, 氨氮作為重要的水環(huán)境因子, 其對(duì)魚(yú)類抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的危害不可忽視。魚(yú)類早期的生命階段比成魚(yú)對(duì)外界環(huán)境因子的影響更加敏感, 特別是其抗氧化和免疫系統(tǒng)還處于較低水平[30]。然而, 目前關(guān)于氨氮對(duì)魚(yú)類的抗氧化和免疫的影響主要集中在幼魚(yú)和成魚(yú)階段, 關(guān)于剛孵化出膜的仔魚(yú)對(duì)氨氮脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究還非常缺乏, 特別是不同種類的仔魚(yú)暴露在氨氮環(huán)境中響應(yīng)差異的研究。

鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)和黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)都是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類, 它們因其肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)速度快、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高而受到人民的青睞, 其人工繁殖對(duì)滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖需求至關(guān)重要[31]。其中, 鰱為濾食雜食性, 產(chǎn)漂流性卵; 草魚(yú)和團(tuán)頭魴均為草食性,但草魚(yú)產(chǎn)漂流性卵, 團(tuán)頭魴產(chǎn)黏性卵; 黃顙魚(yú)為肉食性, 產(chǎn)沉性卵。由于它們的食性不同, 使得它們成為開(kāi)展本研究絕佳的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本研究從免疫與抗氧化的角度, 探討氨氮對(duì)鰱、草魚(yú)、團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú)仔魚(yú)氧化應(yīng)激和免疫的影響及其分子機(jī)制的差異, 以期探究魚(yú)類早期發(fā)育過(guò)程中的氧化應(yīng)激和免疫系統(tǒng)在魚(yú)類抵抗外源環(huán)境因子影響中的響應(yīng)模式, 為全面評(píng)估和解析氨氮對(duì)魚(yú)類的危害以及苗種培育技術(shù)提升提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鰱、草魚(yú)、團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú)仔魚(yú)(出膜后24h)由湖南省田家湖漁業(yè)科技有限責(zé)任公司提供;實(shí)驗(yàn)所用的塑料魚(yú)缸(32 cm×22 cm×17 cm)和培養(yǎng)皿(直徑10 cm)購(gòu)自武漢迪躍生物; 游標(biāo)卡尺(0—150 mm, 上海恒量量具有限公司); HQ40D水質(zhì)分析儀(哈希, 美國(guó)); 總蛋白濃度, 補(bǔ)體C3、溶菌酶(LYZ)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)的含量及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活力所用檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所; TRIzol試劑購(gòu)自TaKaRa(中國(guó)大連); Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digeater plus)和HifairTMqPCR SYB?Green Mater Mix (No Rox)的試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。氯化銨(NH4Cl, 國(guó)藥, 99.5%), MS-222購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó)), 其他所用試劑均為分析純。

1.2 半致死濃度測(cè)定

半致死濃度(LC50)測(cè)定實(shí)驗(yàn)在湖南省華容縣田家湖漁業(yè)科技有限責(zé)任公司進(jìn)行。選用基地馴化多年的成魚(yú)親本(鰱、草魚(yú)、團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú))分別進(jìn)行人工催產(chǎn)受精, 采集同一批健康孵化出膜的仔魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。制備1 g/L的氨標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(氯化銨配制), 分別稀釋成1、2、4、6、8 和10 mg/L共6個(gè)濃度組的氨氮溶液(以總氨氮計(jì)), 對(duì)照組為24h曝氣自來(lái)水。半致死濃度測(cè)定選用直徑100 mm培養(yǎng)皿, 每個(gè)培養(yǎng)皿放入100條仔魚(yú), 每個(gè)濃度5個(gè)平行, 分別在暴露前(0)和暴露后3h、6h、12h、24h、48h、72h和96h記錄各個(gè)濃度組的死亡數(shù)量,最后利用SPSS 22.0計(jì)算半致死濃度。

1.3 氨氮暴露實(shí)驗(yàn)

根據(jù)半致死濃度結(jié)果, 設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)暴露組, 氨氮濃度分別為0 (24h 曝氣自來(lái)水), 1 mg/L(25%LC50), 2 mg/L (50%LC50), 3 mg/L (75%LC50),每個(gè)濃度組3個(gè)平行培養(yǎng)缸。每個(gè)缸放入1500條魚(yú)苗, 暴露96h后進(jìn)行樣品的采集, 實(shí)驗(yàn)期間每24h更換相同濃度的NH4Cl溶液, 使?jié)舛缺３衷谠O(shè)置濃度的±20%以內(nèi), 并每隔3h查看, 及時(shí)利用膠頭滴管吸出死亡的魚(yú)苗, 防止污染實(shí)驗(yàn)缸水環(huán)境。實(shí)驗(yàn)期間鰱和草魚(yú)水溫為(24±0.2)℃, 團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú)水溫為(25.1±0.2)℃左右, 溶解氧均>5 mg/L, pH為8.8±0.2, 根據(jù)Emerson等[32]描述的方法計(jì)算實(shí)際水體中非離子氨(NH3)濃度:

非離子氨(NH3)=總氨氮/[1+10(pKa-pH)]

式中, pKa=0.09018+2729.92/T(T=273+t℃)。

采集樣品前用濃度為200 mg/L的MS-222麻醉實(shí)驗(yàn)仔魚(yú), 每個(gè)濃度組隨機(jī)取40尾仔魚(yú)利用游標(biāo)卡尺測(cè)量體長(zhǎng)。對(duì)每個(gè)濃度組, 隨機(jī)選取200條仔魚(yú)混合在一起作為1個(gè)平行樣, 液氮速凍后保存于–80℃用作酶活性和蛋白含量檢測(cè), 共6個(gè)平行; 隨機(jī)選取20條仔魚(yú)混在一起作為1個(gè)平行樣, 放入液氮速凍后保存于–80℃冰箱中保存, 用于RNA提取和基因表達(dá)測(cè)定, 共6個(gè)平行。

1.4 抗氧化和免疫指標(biāo)測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所生化試劑盒測(cè)定勻漿中補(bǔ)體C3、LYZ、T-AOC、MDA的含量及GPx、SOD和CAT的活力。

1.5 基因表達(dá)水平測(cè)定

采用RNAiso Plus試劑(TaKaRa, 大連)提取總RNA, 利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, 大連)反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。qPCR的引物序列運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)和參考相關(guān)文獻(xiàn)(表 1)。根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明, 利用SYBR Premix ExTaqⅡ(TaKaRa, 大連)進(jìn)行qPCR反應(yīng), 擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min, 然后變性95℃ 10s, 退火58℃ 20s,延伸72℃ 20s, 共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)采用β-actin作為內(nèi)參基因, 2–??Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量(R)[33]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences for qPCR

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用使用SPSS 22.0(Chicago, USA)對(duì)體長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA),隨后采用Duncan進(jìn)行多重比較。采用雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)中其他數(shù)據(jù)(T-AOC、MDA、SOD、CAT、GPx、LYZ、C3及相關(guān)的基因)進(jìn)行分析, 隨后采用Duncan進(jìn)行多重比較, 差異顯著水平均設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 四種仔魚(yú)氨氮的半致死濃度

經(jīng)SPSS分析, 鰱仔魚(yú)96h總氨暴露的LC50為4.089 mg/L (NH3為0.697 mg/L), 草魚(yú)仔魚(yú)為4.276 mg/L(NH3為0.801 mg/L), 團(tuán)頭魴仔魚(yú)為3.718 mg/L(NH3為1.142 mg/L), 黃顙魚(yú)仔魚(yú)為3.699 mg/L(NH3為1.136 mg/L)。

2.2 氨氮暴露對(duì)4種仔魚(yú)的體長(zhǎng)的影響

在氨氮暴露后, 4種不同魚(yú)類仔魚(yú)的體長(zhǎng)隨著氨氮暴露濃度增加而降低(圖 1)。與對(duì)照組相比,所有氨氮暴露組中鰱、草魚(yú)和黃顙魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)均顯著降低(P<0.05), 其最高降幅依次為7.31%、18.71%和10.32%; 而團(tuán)頭魴仔魚(yú)體長(zhǎng)顯著降低僅出現(xiàn)在2和3 mg/L氨氮處理組(P<0.05), 最高下降了5.22%。

圖1 氨氮暴露對(duì)4種仔魚(yú)體長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of total ammonia nitrogen on body length of four species of fish larvae

2.3 氨氮對(duì)4種仔魚(yú)氧化和抗氧化指標(biāo)的影響

氨氮暴露導(dǎo)致4種不同魚(yú)類仔魚(yú)的T-AOC活力降低(圖 2A)。與對(duì)照組相比, 2和3 mg/L氨氮脅迫導(dǎo)致鰱仔魚(yú)、草魚(yú)仔魚(yú)和團(tuán)頭魴仔魚(yú)的T-AOC顯著降低(P<0.05), 其最高降幅分別為9.02%、17.36%和22.62%; 所有氨氮處理組中黃顙魚(yú)仔魚(yú)T-AOC均顯著降低(P<0.05), 最高下降了19.43%。相對(duì)地, 氨氮暴露僅導(dǎo)致團(tuán)頭魴仔魚(yú)體內(nèi)MDA含量顯著性升高(P<0.05; 圖 2B)。

圖2 氨氮暴露對(duì)4種仔魚(yú)總抗氧化能力(A)和丙二醛(B)的影響Fig. 2 Effects of total ammonia nitrogen on total antioxidant capacity (A) and malondialdehyde (B) of four species of fish larvae (n=6)

鰱仔魚(yú)SOD活力在氨氮暴露后升高, 但沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性變化(P>0.05), 但2和3 mg/L氨氮脅迫顯著降低了草魚(yú)仔魚(yú)、團(tuán)頭魴仔魚(yú)和黃顙魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)SOD活性, 其最高降幅分別為17.81%、14.79%和23.98% (P<0.05; 圖 3A)。在基因水平上, 2和3 mg/L氨氮處理導(dǎo)致鰱仔魚(yú)cuznsod表達(dá)水平的顯著性下調(diào)(P<0.05; 圖 3B)。

如圖 3C所示, 氨氮脅迫導(dǎo)致4種仔魚(yú)的CAT活力降低。與對(duì)照組相比, 3 mg/L氨氮處理組中鰱仔魚(yú)和黃顙魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)CAT活性分別降低了41.14%和64.12% (P<0.05), 而草魚(yú)仔魚(yú)和團(tuán)頭魴仔魚(yú)CAT活性在2和3 mg/L氨氮組均顯著下降, 最高降幅分別為45.01%和47.12% (P<0.05)。氨氮的脅迫并未造成4種仔魚(yú)cat轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著改變(P>0.05; 圖 3D)。

4種仔魚(yú)GPx的活性在氨氮脅迫后均降低(圖 3E)。與對(duì)照組相比, 1和2 mg/L氨氮處理導(dǎo)致鰱仔魚(yú)GPx活性顯著性降低了34.48%和23.21% (P<0.05);2和3 mg/L氨氮處理導(dǎo)致草魚(yú)仔魚(yú)GPx活性顯著降低了27.51%和43.12% (P<0.05); 而團(tuán)頭魴仔魚(yú)GPx活性僅在3 mg/L氨氮處理組顯著降低了55.73% (P<0.05); 僅黃顙魚(yú)仔魚(yú)GPx活性在3個(gè)處理組中均顯著性降低, 最高降幅為56.04% (P<0.05)。與對(duì)照相比,僅黃顙魚(yú)基因gpx轉(zhuǎn)錄水平在3個(gè)氨氮處理組均顯著性下調(diào)(P<0.05), 且降幅超過(guò)52.23% (圖 3F)。

圖3 氨氮暴露對(duì)4種仔魚(yú)抗氧化酶含量和基因表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of total ammonia nitrogen on antioxidant enzymatic activity and gene expression of four species of fish larvae (n=6)

2.4 氨氮對(duì)4種仔魚(yú)非特異性免疫指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比, 氨氮暴露導(dǎo)致草魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)LYZ含量顯著降低(P<0.05), 但未造成鰱仔魚(yú)和團(tuán)頭魴仔魚(yú)體內(nèi)LYZ含量出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)。然而, 2 mg/L處理組黃顙魚(yú)仔魚(yú)LYZ含量增加顯著(P<0.05; 圖 4A)。如圖 4B所示, 氨氮暴露對(duì)鰱、草魚(yú)、團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú)4種仔魚(yú)體內(nèi)補(bǔ)體C3含量均無(wú)顯著性影響(P>0.05)。

圖4 氨氮暴露對(duì)4種仔魚(yú)溶菌酶和補(bǔ)體C3含量的影響Fig. 4 Effects of total ammonia nitrogen on the contents of lysozyme (A) and complement C3 (B) of four species of fish larvae (n=6)

在氨氮暴露后, 除了鰱仔魚(yú)il1β基因表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 4種魚(yú)仔魚(yú)所有檢測(cè)基因(il1β、tnfα和c3)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖 5)。與對(duì)照組相比, 3 mg/L氨氮暴露導(dǎo)致tnfα基因表達(dá)在鰱、草魚(yú)、團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)分別顯著升高了206.12%、79.67%、416.44%和267.18%(P<0.05)。同時(shí), 3 mg/L氨氮暴露導(dǎo)致草魚(yú)和團(tuán)頭魴仔魚(yú)體內(nèi)il1β基因表達(dá)顯著上升55.41%和2701.84%; 鰱體內(nèi)顯著下降51.17%(P<0.05);而黃顙魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)il1β基因表達(dá)在2和3 mg/L暴露下顯著增加205%和773.68% (P<0.05)。3 mg/L氨氮誘導(dǎo)黃顙魚(yú)仔魚(yú)c3基因表達(dá)顯著上升275.43%, 而2和3 mg/L氨氮均在鰱、團(tuán)頭魴和草魚(yú)仔魚(yú)中誘導(dǎo)c3表達(dá)顯著升高(P<0.05), 其最高漲幅分別為177.04%、374.61%和112.99%。

圖5 氨氮暴露對(duì)4種仔魚(yú)相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 5 Effects of ammonia nitrogen on relative mRNA expression of four species of fish larvae (n=6)

2.5 氨氮和魚(yú)的種類雙因素對(duì)仔魚(yú)抗氧化酶和先天性免疫指標(biāo)的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示, 氨氮對(duì)所有抗氧化酶活性、免疫指標(biāo)以及免疫相關(guān)基因均有顯著影響(P<0.05), 不同種類仔魚(yú)(鰱、草魚(yú)、團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú))的T-AOC、CAT、GPx、C3和基因sod、gpx、il1β、c3之間差異顯著(P<0.05), 而魚(yú)種和氨氮互作效應(yīng)僅對(duì)C3和基因gpx、tnfα、il1β、c3影響顯著(P<0.05; 表 2)。對(duì)于交互作用顯著的指標(biāo), 我們通過(guò)單因素方差分析進(jìn)一步解析了同一氨暴露下魚(yú)種之間的差異 (表 3), 結(jié)果顯示: 在無(wú)氨氮的對(duì)照組, 鰱和草魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)C3含量顯著高于黃顙魚(yú)和團(tuán)頭魴仔魚(yú)(P<0.05), 而基因gpx、tnfα、il1β和c3mRNA表達(dá)水平在4種仔魚(yú)間沒(méi)有顯著差異; 在低濃度氨氮(1 mg/L)處理?xiàng)l件下, 黃顙魚(yú)仔魚(yú)c3和tnfα轉(zhuǎn)錄水平顯著低于鰱和草魚(yú)仔魚(yú), 其il1β基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于鰱和團(tuán)頭魴仔魚(yú)(P<0.05), 而在高濃度氨氮(3 mg/L)處理下, 黃顙魚(yú)仔魚(yú)c3轉(zhuǎn)錄水平顯著高于鰱和團(tuán)頭魴仔魚(yú),il1β轉(zhuǎn)錄水平顯著高于鰱和草魚(yú)仔魚(yú),tnfα基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于草魚(yú)仔魚(yú)(P<0.05; 表 3)。

表2 氨氮和魚(yú)的種類雙因素對(duì)仔魚(yú)抗氧化酶和先天性免疫指標(biāo)的影響Tab. 2 Effects of ammonia and species on antioxidant enzyme of different feeding habits fish larvae

表3 氨氮暴露下4種仔魚(yú)之間C3含量及基因c3、gpx、il1β和tnfα轉(zhuǎn)錄水平變化Tab. 3 The changes of C3 levels and c3, il1β, tnfα translation among four species of fish larvae after ammonia exposure

3 討論

3.1 氨氮脅迫對(duì)仔魚(yú)生長(zhǎng)的影響

苗種培育是制約養(yǎng)殖后期發(fā)展的重要階段, 在保障人工繁殖魚(yú)苗孵化率的同時(shí), 需要特別重視出膜后仔魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育。其中, 仔魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育是評(píng)價(jià)人工繁殖是否成功以及優(yōu)良品種選育的重要時(shí)期, 因?yàn)樽恤~(yú)往往對(duì)外界環(huán)境較為敏感, 易受到環(huán)境因素(氨氮、亞硝酸鹽和溫度)的影響, 例如氨氮進(jìn)入魚(yú)體后能破壞腦中樞神經(jīng)系統(tǒng), 影響魚(yú)的攝食和食物吸收, 進(jìn)而抑制魚(yú)的生長(zhǎng)[15,21,35,36]。Foss等[35]發(fā)現(xiàn), 長(zhǎng)期氨氮脅迫導(dǎo)致大菱鲆幼魚(yú)特定生長(zhǎng)率和增重率降低。Li 等[15]研究指出, 高濃度氨氮(26.88 mg/L)暴露明顯抑制了黃顙魚(yú)的攝食、生長(zhǎng)及飼料轉(zhuǎn)化效率。在本實(shí)驗(yàn)中, 氨氮暴露使4種仔魚(yú)體長(zhǎng)生長(zhǎng)顯著減緩, 且隨著氨氮濃度升高體長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量依賴性下降, 表明氨氮脅迫對(duì)魚(yú)類早期生長(zhǎng)發(fā)育造成一定的負(fù)面影響, 其中氨氮暴露對(duì)生長(zhǎng)影響最顯著的是草魚(yú)和黃顙魚(yú)。相似地, 尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)受精卵暴露于0.05—0.6 mg/L的氨氮20d和60d后, 死亡率與對(duì)照組相比顯著性上升, 且高濃度氨氮暴露時(shí), 仔魚(yú)表現(xiàn)出各種生理反應(yīng), 其中包括體長(zhǎng)生長(zhǎng)減緩, 脊柱彎曲、卵黃囊縮小等[36]。Segner和Verreth[37]研究也指出, 魚(yú)卵較大的魚(yú)類(例如鮭)可以維持較長(zhǎng)時(shí)間的卵黃囊期, 可以支持其生長(zhǎng)至較大的仔魚(yú)。相比之下, 卵和仔魚(yú)較小的海魚(yú)品種, 在外源喂養(yǎng)開(kāi)始時(shí)器官發(fā)育不完全[38,39]。

3.2 氨氮脅迫對(duì)仔魚(yú)氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響

魚(yú)類的生長(zhǎng)和魚(yú)體的健康密不可分, 而魚(yú)類抗氧化系統(tǒng)和氧化系統(tǒng)之間的平衡往往是評(píng)價(jià)魚(yú)類健康的重要指標(biāo), 因?yàn)槎喾N環(huán)境污染物的毒性機(jī)制之一是過(guò)量生成的活性氧(ROS)引起氧化應(yīng)激[40—42]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要標(biāo)志之一。此外，T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)功能強(qiáng)弱的綜合性指標(biāo)。MDA和T-AOC水平的動(dòng)態(tài)變化可以充分反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)[43,44]。急性氨氮暴露能導(dǎo)致羅非魚(yú)肌肉和肝臟ROS含量增加, 并造成相應(yīng)的氧化損傷[17], 且高濃度氨氮易導(dǎo)致魚(yú)體內(nèi)MDA的積累[18,45]。在本研究中, 隨著氨氮濃度升高, 4種魚(yú)體內(nèi)T-AOC含量顯著降低, 而MDA含量都有一定的上升, 表明氨氮的暴露導(dǎo)致魚(yú)體抗氧化能力的減弱, 造成了氧化應(yīng)激損傷?？寡趸芰υ诓煌N類的魚(yú)之間會(huì)有很大的差異, 這可能與它們對(duì)引起氧化損傷的外源污染物的抵抗力不同有關(guān)[46,47]。通過(guò)顯著性分析和雙因素方差分析發(fā)現(xiàn), 不同仔魚(yú)之間T-AOC含量差異顯著, 并且氨氮對(duì)于不同仔魚(yú)T-AOC含量均具有顯著抑制作用, 其中對(duì)黃顙魚(yú)仔魚(yú)T-AOC削弱程度最大, 其次是團(tuán)頭魴仔魚(yú), 初步表明鰱和草魚(yú)仔魚(yú)的氨耐受性較強(qiáng)。

細(xì)胞內(nèi)ROS水平由相互作用的抗氧化防御體系協(xié)同控制[17,48], 抗氧化酶活性的增加表明氧化應(yīng)激的發(fā)生和清除生成的ROS的適應(yīng)性反應(yīng), 而其活性的降低則暗示其抗氧化防御能力的破壞。在本實(shí)驗(yàn)中, 氨氮暴露導(dǎo)致4種仔魚(yú)的抗氧化酶SOD、CAT和GPx的活性和基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)不同程度的下降, 進(jìn)一步證實(shí)氨氮的暴露造成了氧化應(yīng)激損傷, 進(jìn)而削弱了其抗氧化能力。我們研究還發(fā)現(xiàn),氨氮暴露后4種仔魚(yú)中僅鰱仔魚(yú)體內(nèi)SOD含量未出現(xiàn)顯著性變化, 而CAT和GPx 活力顯著性降低, 表明鰱仔魚(yú)不依賴SOD作為抵抗氨介導(dǎo)的ROS。與我們結(jié)果相似的, 剛孵化鰱體內(nèi)SOD的活力在NH3(0.06—0.264 mg/L)暴露3d和7d后沒(méi)有受到顯著影響[31]。本實(shí)驗(yàn)中草魚(yú)、團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú)仔魚(yú)的SOD、CAT和GPx均顯著性下降, 且黃顙魚(yú)gpx基因的轉(zhuǎn)錄水平在氨氮暴露后也顯著下調(diào), 表明這3種魚(yú)的抗氧化酶SOD、CAT和GPx都參與氨氮脅迫下ROS的清除。Chen等[49]研究發(fā)現(xiàn), 氨氮(NH3:0.176—0.879 mg/L)暴露草魚(yú)卵至神經(jīng)胚和孵化, 可使其SOD水平顯著下降。Zhang等[50]研究結(jié)果揭示, 20 mg/L總氨氮長(zhǎng)期暴露導(dǎo)致團(tuán)頭魴幼魚(yú)(14.27±0.01) g肝臟中SOD、CAT和GPx活性顯著降低。同樣, 黃顙魚(yú)在氨氮暴露后其SOD、CAT和GPx活力也顯著性下降[15,21]。在正常情況下, 細(xì)胞內(nèi)ROS可被SOD分解為H2O2, CAT和GPx可催化H2O2形成水和分子態(tài)氧, 所以SOD在抗氧化防御過(guò)程中起到首要地位[51,52]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 氨氮處理后鰱仔魚(yú)體內(nèi)SOD活性顯著高于其他3種仔魚(yú), 這可能是鰱仔魚(yú)較其他3種仔魚(yú)耐氨氮性強(qiáng)的原因。雙因素方差分析進(jìn)一步顯示, 與對(duì)照組相比, 氨氮脅迫導(dǎo)致黃顙魚(yú)仔魚(yú)抗氧化酶降低的程度最大, 其次是草魚(yú)和團(tuán)頭魴仔魚(yú), 另一方面4種仔魚(yú)自身之間抗氧化酶CAT和GPx活性就有顯著差異, 而不同魚(yú)抗氧化應(yīng)激的響應(yīng)能力可能與它們食性相關(guān)[53,54]。姜丹莉[54]研究發(fā)現(xiàn), 草食性草魚(yú)和肉食性青魚(yú)捕撈后肝臟糖含量下降, 而雜食性銀鯽(Carassiusautatus gibelio)捕撈后肝糖原含量未發(fā)生顯著變化, 其血漿葡萄糖和乳酸濃度增幅較小, 表明銀鯽的捕撈應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度低于草魚(yú)和青魚(yú)。綜上所述, 在氨氮暴露下, 鰱仔魚(yú)抗氧化能力最高, 耐氨氮能力最強(qiáng); 黃顙魚(yú)仔魚(yú)抗氧化能力最低, 耐氨氮能力最低。

3.3 氨氮脅迫對(duì)仔魚(yú)免疫系統(tǒng)的影響

魚(yú)類生活的水環(huán)境病原體復(fù)雜多變, 病原體會(huì)增加宿主免疫系統(tǒng)功能障礙, 因此集約化養(yǎng)殖中氨氮對(duì)魚(yú)類免疫影響已成為熱點(diǎn)問(wèn)題[29,55], 而魚(yú)類先天性免疫被認(rèn)為是抵抗外界病原體的第一道防線[56,57]。溶菌酶在生物體中廣泛存在, 其轉(zhuǎn)錄水平或者活力是魚(yú)類先天免疫的重要指標(biāo)。章瓊[60]研究報(bào)道,72h氨氮(20 mg/L)急性脅迫導(dǎo)致團(tuán)頭魴成魚(yú)鰓組織中溶菌酶基因表達(dá)量顯著下降, 免疫系統(tǒng)功能減弱。相似地, 急性氨氮暴露也造成瓦氏黃顙魚(yú)成魚(yú)血清中溶菌酶含量顯著性降低, 導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能減弱[61]。同樣, 長(zhǎng)期氨氮(5.56—5.80 mg/L)暴露導(dǎo)致黃顙魚(yú)幼魚(yú)(1.94±0.05) g肝臟中溶菌酶活性顯著降低[62]。相反, 黃顙魚(yú)在氨氮(5.70 mg/L)3h短期急性暴露后, 肝臟中溶菌酶呈現(xiàn)顯著性上升[15]。在本研究中, 氨氮暴露后鰱和團(tuán)頭魴仔魚(yú)LYZ含量沒(méi)有顯著變化, 但草魚(yú)魴仔魚(yú)中顯著下降, 而黃顙魚(yú)中顯著升高, 可見(jiàn)氨氮脅迫導(dǎo)致4種仔魚(yú)呈現(xiàn)差異性免疫響應(yīng), 草魚(yú)表現(xiàn)為免疫反應(yīng)抑制, 黃顙魚(yú)表現(xiàn)為免疫反應(yīng)興奮, 而鰱和團(tuán)頭魴免疫反應(yīng)未受影響。本實(shí)驗(yàn)雙因素方差分析顯示, 氨氮對(duì)LYZ含量影響顯著, 但是4種仔魚(yú)體內(nèi)LYZ之間沒(méi)有顯著差異。魚(yú)類的補(bǔ)體可裂解外界細(xì)胞, 對(duì)外來(lái)生物產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用, 其中補(bǔ)體C3在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著核心作用[58,59]。在本研究中, 氨氮暴露未導(dǎo)致C3含量在4種仔魚(yú)中出現(xiàn)顯著變化, 但c3基因表達(dá)呈現(xiàn)顯著升高。相似地, 高濃度氨氮(10 mg/L)急性脅迫24h后, 團(tuán)頭魴成魚(yú)血清中C3和C4含量沒(méi)有顯著變化[63]。同樣, 在24h急性氨暴露后, 草魚(yú)成魚(yú)血清中C3含量無(wú)顯著變化[64]。綜合以上結(jié)果表明, 氨氮暴露下4種仔魚(yú)通過(guò)提高C3基因表達(dá)量維持體內(nèi)C3含量恒定。

細(xì)胞因子家族中il1β和tnfα被視為重要的促炎細(xì)胞因子, 在受到外界損傷時(shí)作為幾種免疫反應(yīng)的中間因素參與炎癥反應(yīng)[65—68]。氨氮(10 mg/L)急性脅迫導(dǎo)致鯽(Carassius auratus)肝臟中tnfα和il1β表達(dá)升高[66], 表明機(jī)體發(fā)生了炎癥反應(yīng)。同樣, 急性氨氮暴露也可誘導(dǎo)河豚(Takifugu obscurus)和翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)肝臟中tnfα表達(dá)升高[70,71]。此外, 急性96h氨氮(0.14和0.28 mg/L)脅迫導(dǎo)致黃顙魚(yú)頭腎巨噬細(xì)胞il1和tnf基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降[72]。在本研究中, 3 mg/L氨氮處理導(dǎo)致4種仔魚(yú)體內(nèi)tnfα基因表達(dá)量均顯著升高, 且其在鰱和草魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)的漲幅低于團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú)仔魚(yú), 表明團(tuán)頭魴和黃顙魚(yú)仔魚(yú)可能較其他兩種仔魚(yú)對(duì)氨耐受性弱。與tnfα表達(dá)結(jié)果相似, 氨氮暴露導(dǎo)致草魚(yú)仔魚(yú)、團(tuán)頭魴仔魚(yú)和黃顙魚(yú)仔魚(yú)il1β表達(dá)顯著升高,且黃顙魚(yú)仔魚(yú)中il1β表達(dá)對(duì)氨脅迫表現(xiàn)更加敏感,但鰱仔魚(yú)體內(nèi)il1β表達(dá)顯著下降。雙因素方差分析表明, 同一氨氮濃度下4種仔魚(yú)之間tnfα和il1β表達(dá)存在顯著差異, 黃顙魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)免疫炎癥因子(tnfα和il1β)在低濃度氨氮(1 mg/L)下表達(dá)量較低, 但在高濃度氨氮(3 mg/L)條件下表達(dá)量較高, 而鰱和草魚(yú)仔魚(yú)卻表現(xiàn)出相反趨勢(shì)。由此可見(jiàn), 氨氮暴露干擾了4種仔魚(yú)免疫反應(yīng), 引發(fā)炎癥反應(yīng), 其中黃顙魚(yú)仔魚(yú)和團(tuán)頭魴仔魚(yú)較其他兩種仔魚(yú)對(duì)氨耐受性更弱。

4 結(jié)論

氨氮脅迫導(dǎo)致4種不同食性魚(yú)類仔魚(yú)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和免疫炎癥響應(yīng), 損害機(jī)體內(nèi)酶的平衡, 降低仔魚(yú)的抗氧化能力和先天性免疫功能, 影響基因的轉(zhuǎn)錄水平和酶的合成, 導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩甚至死亡。在抗氧化和免疫對(duì)氨氮耐受性方面, 鰱仔魚(yú)的抗性最強(qiáng), 其次是草魚(yú)和團(tuán)頭魴仔魚(yú), 而黃顙魚(yú)仔魚(yú)抵抗力較弱。鑒于此, 苗種培育階段應(yīng)該重視水體中氨氮濃度控制, 特別是在肉食性黃顙魚(yú)仔魚(yú)的培育過(guò)程。