汪雅琴 黃 晨 耿 超 繆艷陽(yáng) 陸銀月 顧 偉 王 文 孟慶國(guó)

(南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 江蘇省水生甲殼動(dòng)物病害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210023)

水體溶解氧(Dissolved oxygen, DO)來(lái)源于大氣中的氧氣與水面接觸和水生生物的光合作用, 由于來(lái)源不穩(wěn)定, 水體中溶解氧的含量并不高, 且易受外界影響而擴(kuò)散慢[1]。正常情況下, 認(rèn)為發(fā)生低氧時(shí)水體溶氧量小于2 mg/L[2]。人為因素和自然因素是導(dǎo)致水低氧的重要原因。自然因素包括溫度的驟變、晝夜交替、季節(jié)和水流速度的變化等。但人為影響是造成低氧的更重要原因, 隨著人口的增加, 大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被排入水體, 水體富營(yíng)養(yǎng)化, 水中藻類(lèi)大量繁殖, 加劇了溶解氧的消耗。此外, 養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展, 但人工管理尚不完善, 未將殘留飼料和排泄物及時(shí)處理, 這類(lèi)物質(zhì)在高溫時(shí)節(jié)的腐敗分解使得水體處于缺氧狀態(tài)[3]。陳付菊等[4]研究發(fā)現(xiàn)重度低氧脅迫會(huì)使青海湖裸鯉肝血竇擴(kuò)張, 血竇內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量增多, 肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化, 并且空泡化程度隨著低氧時(shí)間的增長(zhǎng)而加深。蔡超等[5]研究表明, 低氧脅迫能使鯽血紅蛋白和血糖濃度升高,還會(huì)影響鰓、血液、肝臟、心臟和腦中與能量代謝和轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶的活力。吳煜國(guó)等[6]發(fā)現(xiàn), 長(zhǎng)期低氧脅迫會(huì)影響斑馬魚(yú)的卵巢發(fā)育, 進(jìn)一步影響卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟。由以上相關(guān)實(shí)驗(yàn)可以看出, 低氧脅迫在水生生物的生活與生存中有著重要影響。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又被稱(chēng)為河蟹,是我國(guó)傳統(tǒng)的水產(chǎn)珍品, 螺原體所引起的“顫抖病”對(duì)河蟹產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重危害。而關(guān)于低氧是否會(huì)對(duì)螺原體感染河蟹產(chǎn)生影響, 這一問(wèn)題亟待研究,因?yàn)楹有仿菰w的靶細(xì)胞為血淋巴細(xì)胞, 所以本文將低氧脅迫與螺原體共同作用于河蟹, 探究它們的協(xié)同作用, 將河蟹的血淋巴細(xì)胞分離出來(lái)進(jìn)行研究,觀察其在低氧狀態(tài)下的免疫力和生理指標(biāo)變化, 為河蟹養(yǎng)殖低氧耐受提供新的思路和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)菌

實(shí)驗(yàn)所用河蟹來(lái)自江蘇省揚(yáng)州市, 每只河蟹重(25±5) g, 將其在28℃, 溶氧量(6.0±0.5) mg/L的養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng), 檢測(cè)河蟹螺原體為陰性, 以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將實(shí)驗(yàn)所用螺原體用R2培養(yǎng)基在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 實(shí)驗(yàn)所用均為生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的螺原體。

1.2 螺原體與低氧刺激后河蟹螺原體拷貝數(shù)和死亡率計(jì)算

為了探究低氧脅迫對(duì)螺原體致死率的影響,(1) 設(shè)置不同部分組別: PBS+常氧組(N PBS), PBS+低氧脅迫組(H PBS), 螺原體+常氧組(N SE), 螺原體+低氧脅迫組(H SE), 每組設(shè)置兩個(gè)重復(fù)水槽, 每個(gè)水槽20只螃蟹。常氧組溶氧量為[(6.0±0.5) mg/L],低氧脅迫組溶氧量為(1.5±0.5) mg/mL, 使用溶氧儀(Bante821, China)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各組水體含氧量。(2) 將對(duì)數(shù)期的螺原體12000 r/min離心10min, 去掉上清,收集備用。(3) 將螺原體用適量PBS緩沖液重懸, 在實(shí)驗(yàn)組的河蟹第五附肢處注射200 μL螺原體, 對(duì)照組的河蟹注射200 μL PBS。(4) 每日記錄河蟹死亡情況。

為了探究低氧脅迫對(duì)河蟹體內(nèi)螺原體拷貝數(shù)的影響, (1) 設(shè)置與上步實(shí)驗(yàn)相同的組別。(2) 在螺原體感染河蟹后的2d、4d、6d和8d取500 μL血細(xì)胞與抗凝劑等比例混合, 每個(gè)樣品取3—5只河蟹,提取DNA并檢測(cè)濃度, 將所得DNA的濃度均稀釋至10 ng/μL。 (3) 進(jìn)行RT-qPCR, 具體反應(yīng)體系及程序參考陸銀月等[7]的文獻(xiàn)。所用上游引物(10 μmol/L): Q-SE-F: 5′-CGCAGACGGTTTAGCA AGTTTGGG-3′; 下游引物(10 μmol/L): Q-SE-R: 5′-AGCACCGAACTTAGTCCGACAC-3′。使用以下公式計(jì)算螺原體拷貝數(shù):

式中,y為實(shí)驗(yàn)所得Ct值,x為lgcopy number。

1.3 血淋巴細(xì)胞PI染色

(1) 用PBS緩沖液將PI溶液稀釋, 使終濃度為10 μmol/L。(2) 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的2d、4d、6d和8d, 分別隨機(jī)挑選3只河蟹, 取血細(xì)胞與500 μL抗凝劑等比例混合, 離心收集血細(xì)胞。(3) 用PBS緩沖液重懸細(xì)胞。(4) 加入10 μL PI溶液重懸細(xì)胞, 在37℃避光孵育20min。(5) 孵育結(jié)束后, 用PBS重懸細(xì)胞, 洗去殘留的PI溶液, 使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況[7]。

1.4 血淋巴細(xì)胞FITC/PI檢測(cè)

磷脂結(jié)合蛋白可與外翻的復(fù)合神經(jīng)酸(Phosphatidylserine, PS)結(jié)合, 通過(guò)與PI共染色, 區(qū)分凋亡細(xì)胞(綠色熒光)與壞死細(xì)胞(紅色熒光)[7]以檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡。

(1) 在實(shí)驗(yàn)后的2d、4d、6d和8d隨機(jī)挑選3只河蟹, 取血細(xì)胞與500 μL抗凝劑等比例混合, 離心收集血細(xì)胞。(2) 用PBS緩沖液重懸細(xì)胞。(3) 用100 μL 1×Binding Buffer將細(xì)胞吹打混勻。(4) 加入5 μL PI Staining Solution和5 μL Annexin V-FITC,混勻后在室溫下孵育10min, 再用400 μL 1×Binding Buffer將細(xì)胞吹打混勻, 置于顯微鏡下觀察。

1.5 血淋巴細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)

線(xiàn)粒體膜電位的變化可以判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡, Rhodamine123進(jìn)入線(xiàn)粒體基質(zhì)是以穿過(guò)細(xì)胞膜的方式, 線(xiàn)粒體膜的完整性會(huì)在血淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)遭到破壞, 從而使線(xiàn)粒體跨膜電位發(fā)生紊亂,可以觀察到Rhodamina 123發(fā)出黃綠色熒光[7]。

(1)用DMSO配制5 mmol/L的Rhodamina 123試劑。(2) 在實(shí)驗(yàn)后的2d、4d、6d和8d抽取河蟹血細(xì)胞與500 μL抗凝劑等比例混合, 使用緩沖液吹洗細(xì)胞一到兩次并收集細(xì)胞。(3)用100 μL Rhodamina 123對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸, 在37℃避光孵育30min。(4) 再次用緩沖液重懸細(xì)胞1—2次, 置于顯微鏡下觀察。

1.6 HE染色

在低氧脅迫處理后第8天, 從未注射螺原體的低氧脅迫組和常氧組中各隨機(jī)挑選3只河蟹, 在無(wú)菌環(huán)境下提取其肝胰腺組織和鰓組織, 并用適量4%動(dòng)物組織固定液將其固定, 然后送至生物公司制備組織切片[7]。

2 結(jié)果

2.1 低氧脅迫對(duì)河蟹鰓組織和肝胰腺組織的影響

在低氧處理后第8天, 對(duì)河蟹的肝胰腺組織和鰓組織進(jìn)行HE染色并觀察其結(jié)構(gòu)變化。觀察相應(yīng)結(jié)果顯示, 肝胰腺對(duì)照組(圖 1A)中, 肝細(xì)胞均勻分布, 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 形態(tài)正常, 基底膜與上皮細(xì)胞緊密相連且厚度均勻; 而在肝胰腺實(shí)驗(yàn)組(圖 1B)中, 肝胰腺呈彌散狀, 管腔外圍出現(xiàn)致密小空泡, 基底膜厚度增加并脫離上皮細(xì)胞。在鰓組織中, 常氧組(圖 1C)的鰓葉分布均勻, 排列整齊, 鰓軸結(jié)構(gòu)完整, 形態(tài)穩(wěn)定; 而在低氧組(圖 1D)中, 鰓軸結(jié)構(gòu)遭到破壞, 但鰓葉損傷較小, 說(shuō)明低氧處理主要影響鰓軸, 而對(duì)鰓葉影響較小。

圖1 低氧脅迫8d后對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺和鰓組織結(jié)構(gòu)HE染色(50 μm)Fig. 1 HE staining of hepatopancreas and gills of E. sinensis after 8d of hypoxia stress (50 μm)

2.2 低氧和螺原體刺激對(duì)中華絨螯蟹死亡率的影響

圖2顯示, 低氧脅迫和螺原體共同作用的實(shí)驗(yàn)組死亡率增加, 在第10天時(shí), 河蟹全部死亡; 在僅有螺原體刺激的組中, 河蟹于第6天開(kāi)始死亡, 并在第9天死亡加劇, 死亡率在第10和第12天分別達(dá)到50%和70%; 在僅低氧處理的組中, 河蟹的死亡率在第5天后也逐日增加, 但增加的速度低于僅有螺原體處理的組; 而在對(duì)照組中, 相較于其他組, 河蟹死亡率較為低緩。以上結(jié)果表明, 被螺原體感染的河蟹死亡速度受低氧脅迫的影響加快, 死亡率升高。

圖2 低氧脅迫及螺原體侵染對(duì)中華絨螯蟹死亡率的影響Fig. 2 The mortality rate of crabs after hypoxia and S. eriocheiris infection

2.3 低氧脅迫對(duì)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中螺原體拷貝數(shù)的影響

為了研究低氧脅迫是否對(duì)螺原體的生長(zhǎng)繁殖有影響, 使用RT-qPCR檢測(cè)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中的螺原體拷貝數(shù)變化。如圖 3所示, 在螺原體感染后, 相比于常氧組, 低氧組河蟹血淋巴細(xì)胞中的螺原體拷貝數(shù)明顯較高, 綜上所述, 河蟹受低氧脅迫后更容易被螺原體感染。

圖3 低氧脅迫對(duì)血淋巴細(xì)胞中螺原體拷貝數(shù)的影響Fig. 3 S. eriocheiris copy number in hemocytes after hypoxia

2.4 河蟹血淋巴細(xì)胞壞死(PI)受低氧及螺原體侵染的影響

利用PI染色技術(shù)來(lái)研究在低氧脅迫狀態(tài)下, 螺原體感染對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞壞死是否會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)受低氧脅迫和螺原體刺激后的河蟹于2d、4d、6d和8d分別取樣, 進(jìn)行PI染色, 結(jié)果如圖 4所示, 隨著螺原體感染時(shí)間的推移, 帶紅色熒光細(xì)胞的數(shù)目逐漸增多。同時(shí)將帶紅色熒光細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 結(jié)果見(jiàn)圖 5, 發(fā)現(xiàn)低氧脅迫和螺原體共同作用的實(shí)驗(yàn)組第4天的血淋巴細(xì)胞壞死顯著高于對(duì)照組, 僅有螺原體刺激的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞壞死狀況則無(wú)顯著變化, 綜上所述, 河蟹血淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能受低氧破壞, 從而導(dǎo)致血淋巴細(xì)胞壞死發(fā)生。

圖4 低氧脅迫及螺原體刺激對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞壞死(PI)的熒光檢測(cè)Fig. 4 Fluorescence detection of necrosis (PI) in hemocytes of E.sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

圖5 低氧脅迫及螺原體刺激對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞壞死(PI)的紅色熒光占比Fig. 5 Red fluorescence percentage of necrosis (PI) in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

2.5 低氧脅迫及螺原體刺激下河蟹血淋巴細(xì)胞凋亡(FITC/PI)情況

根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色, 觀察在低氧脅迫和螺原體刺激下, 血淋巴細(xì)胞凋亡情況。對(duì)被低氧和螺原體刺激后的河蟹于2d、4d、6d和8d取樣, 進(jìn)行熒光拍照與并統(tǒng)計(jì)熒光比例, 如圖 6所示, 螺原體感染前期, 細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡, 并且隨著感染時(shí)間的推移, 綠色熒光細(xì)胞和紅色熒光細(xì)胞數(shù)量均出現(xiàn)增多。如圖 7所示, 同對(duì)照組相比, 在低氧脅迫和螺原體刺激的共同作用下,實(shí)驗(yàn)組在螺原體侵染前期凋亡現(xiàn)象并不明顯, 但在感染后第8天, 與對(duì)照組相比, 河蟹細(xì)胞凋亡率明顯升高, 這說(shuō)明在低氧脅迫和螺原體刺激的共同作用下, 河蟹血淋巴細(xì)胞主動(dòng)發(fā)生凋亡以適應(yīng)環(huán)境變化。

圖6 低氧脅迫及螺原體刺激對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞凋亡(FITC/PI)的熒光檢測(cè)Fig. 6 Fluorescence Detection of Apoptosis (FITC/PI) in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

圖7 低氧脅迫及螺原體刺激對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞凋亡(FITC/PI)的綠色熒光占比Fig. 7 Green fluorescence percentage of apoptosis (FITC/PI) in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

2.6 低氧脅迫及螺原體侵染對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位(Rhodamine123)的影響

為研究低氧脅迫及螺原體刺激對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位是否有影響, 使用Rhodamine 123檢測(cè)河蟹血淋巴細(xì)胞的凋亡情況。如圖 8所示,在第 2天, 兩組帶綠色熒光的細(xì)胞均較少, 且與對(duì)照組相比, 隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間推移, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的熒光量都在逐漸增加。在圖 9中, 發(fā)現(xiàn)低氧脅迫和螺原體共同作用的組在第4、第6和第8天的熒光比例均高于對(duì)照組, 并且隨著感染時(shí)間的增加, 熒光比例呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 僅有螺原體刺激的組中, 熒光比也隨著感染時(shí)間的增長(zhǎng)而增加, 且在第8天的時(shí)候, 顯著高于對(duì)照組, 相對(duì)于對(duì)照組, 僅受低氧刺激的實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯差異。綜上所述, 河蟹受低氧和螺原體刺激后, 會(huì)為了適應(yīng)環(huán)境變化而改變生存策略。

圖8 低氧脅迫及螺原體刺激對(duì)河蟹血淋巴線(xiàn)粒體膜電位的熒光檢測(cè)Fig. 8 Fluorescence detection of mitochondrial membrane potential (Rhodamine 123) in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

圖9 低氧脅迫及螺原體刺激對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的綠色熒光占比Fig. 9 Green fluorescence percentage of mitochondrial membrane potential in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S.eriocheiris stimulation

3 討論

一般認(rèn)為, 溶氧量為4 mg/L左右的水體是適宜中華絨螯蟹生長(zhǎng)的環(huán)境, 低于2 mg/L溶氧量的水體環(huán)境會(huì)抑制河蟹的生長(zhǎng)蛻殼和變態(tài)[8]。本研究發(fā)現(xiàn), 河蟹在長(zhǎng)期低氧脅迫狀態(tài)下, 死亡率和血淋巴細(xì)胞內(nèi)螺原體拷貝數(shù)均顯著上升。與之相同的是,藍(lán)蟹(C. sapidus)幼體在低溶氧量狀態(tài)下的死亡率也顯著高于對(duì)照組[9]。由此可見(jiàn), 低氧對(duì)水生生物的生存生活有著重要影響。

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是程序性細(xì)胞死亡的嚴(yán)格調(diào)控形式, 可觸發(fā)細(xì)胞的自我毀滅而不受任何外部影響。細(xì)胞的凋亡和壞死有著本質(zhì)的區(qū)別, 細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)死亡以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的方式, 當(dāng)外界環(huán)境變化, 細(xì)胞受到刺激, 體積縮小, 染色體濃縮,膜上的復(fù)合神經(jīng)酸外翻, 形成能快速被巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬的凋亡小體, 并且不會(huì)影響周?chē)?xì)胞[10,11]。細(xì)胞壞死是外界環(huán)境劇烈變化, 強(qiáng)刺激下, 細(xì)胞會(huì)發(fā)生腫脹、破裂, 繼而引發(fā)周?chē)?xì)胞感染炎癥[12]。多數(shù)研究表明, 大部分病原菌感染都能引起細(xì)胞凋亡和壞死, 由于感染鉤端螺旋體(Leptospira), 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯, 繼而發(fā)生凋亡[13]; 紅細(xì)胞的滲透性會(huì)被創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素破壞溶解, 從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡[14]。中性粒細(xì)胞在小鼠被鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonella typhimurium)[11]感染后發(fā)生凋亡, 并且隨著時(shí)間推移, 細(xì)胞壞死率逐漸上升。

在河蟹等無(wú)脊椎動(dòng)物抵御細(xì)菌等外來(lái)病原體入侵的過(guò)程中, 先天免疫系統(tǒng)的作用至關(guān)重要, 血淋巴細(xì)胞更是其中的重要組成部分[15]。螺原體侵染河蟹的第一個(gè)靶細(xì)胞是血淋巴細(xì)胞, 螺原體在其中生長(zhǎng)繁殖后通過(guò)血液流動(dòng)到達(dá)河蟹的各個(gè)組織,引起河蟹附肢顫抖, 進(jìn)而引發(fā)河蟹死亡[16—18]。在此研究中, 發(fā)現(xiàn)河蟹血淋巴細(xì)胞壞死率在低氧條件下顯著高于對(duì)照組, 且低氧脅迫與螺原體共同刺激時(shí),血淋巴細(xì)胞在感染后期發(fā)生凋亡。與這類(lèi)似的是,羅氏沼蝦的血淋巴細(xì)胞受氨和亞硝酸鹽刺激時(shí)也會(huì)發(fā)生凋亡[19]。

線(xiàn)粒體是一種雙層膜包被的細(xì)胞器, 存在于真核細(xì)胞中。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中, 線(xiàn)粒體膜通透性的變化起著至關(guān)重要的作用。線(xiàn)粒體是細(xì)胞制造能量的結(jié)構(gòu), 其內(nèi)膜中儲(chǔ)存的電化學(xué)勢(shì)能可以引起內(nèi)膜兩側(cè)的離子濃度分布不對(duì)稱(chēng), 從而形成線(xiàn)粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential, MMP)[20],線(xiàn)粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性事件之一。在此實(shí)驗(yàn)中, 通過(guò)對(duì)河蟹血淋巴細(xì)胞進(jìn)行Rhodamine123染色發(fā)現(xiàn), 與常氧組相比, 低氧組的河蟹感染螺原體后的熒光比例顯著升高, 并且隨著感染時(shí)間的增加, 熒光比例呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 即細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。無(wú)脊椎動(dòng)物的線(xiàn)粒體的攝氧量相較于脊椎動(dòng)物要低得多, 受低氧刺激6h后, 對(duì)蝦的線(xiàn)粒體攝氧量及相關(guān)酶活性均呈明顯下降趨勢(shì), 這說(shuō)明對(duì)蝦通過(guò)減少攝氧量和降低蛋白的合成率以應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境[21]。此實(shí)驗(yàn)中, 根據(jù)組織切片結(jié)果, 相對(duì)于常氧組, 低氧組的肝胰腺結(jié)構(gòu)較為疏松, 管腔外圍出現(xiàn)小空泡, 鰓軸出現(xiàn)彌散, 河蟹的肝胰腺和鰓組織結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度的損傷。類(lèi)似的是, 在陶易凡等[22]的研究中, 克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)在低pH脅迫下, 肝胰腺組織中許多空泡, 鰓的上皮細(xì)胞剝落。日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)在低氧脅迫下, 鰓小片支柱細(xì)胞與上皮細(xì)胞排列雜亂, 肝組織中B淋巴細(xì)胞量減少, 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)囊泡的體積縮小[23]。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將低氧脅迫和螺原體共同作用于河蟹,最終得出結(jié)論: 在低氧狀態(tài)下, 河蟹的組織結(jié)構(gòu)被破壞, 死亡率升高, 血淋巴細(xì)胞的壞死率和凋亡率升高, 螺原體感染速度加快, 河蟹更容易被螺原體感染, 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究低氧脅迫加速河蟹顫抖病的分子機(jī)制指明了方向。