陳小凡, 王路路, 肖騰飛, 朱葆華, 李 赟, 潘克厚,2??

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003; 2. 嶗山實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室, 山東 青島 266237)

海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)屬于真眼點藻綱(Eustigmatophyceae)微擬球藻藻屬(Nannochloropsis)[1],是一種海洋單細胞微藻,具有生長速度快,油脂含量高等優(yōu)點[2]。微藻體內油脂主要由中性脂與極性脂組成,中性脂是微藻碳和能量的儲存形式,被認為是生物柴油的理想來源[3]。微擬球藻脂質含量占干質量的39.4%～44.9%[4]是微藻生物柴油生產的模式藻株。

在對已有的微擬球藻藻株進行比較基礎上,開展誘變選育是獲得高油脂產率藻株的重要途徑。目前優(yōu)良微藻藻株的育種方法包括誘變育種和轉基因育種。微藻的誘變育種包括物理法(如紫外線、射線、等離子體和重離子束等)和化學法(如甲烷磺酸乙酯(EMS)亞硝基胍(NTG)等)[5-6]。轉基因技術則是將油脂合成的功能基因轉入微藻體內以定向改變油脂的積累能力。誘變是不定向的,轉基因也需要考慮轉基因藻株的最終生物學功能,故在誘變和轉基因后,都需要對獲得的藻株進行快速篩選。尼羅紅染色熒光強度與中性脂質密切相關[7],利用尼羅紅染色結合流式細胞儀分析是目前快速篩選高油脂含量微藻的有效方法,這一方法已廣泛用于硅藻、金藻、褐藻和綠藻等微藻油脂含量的分析[8]。

微藻的油脂產率由微藻的生長速率和微藻的中性脂含量共同決定,因此篩選優(yōu)良的藻株時需要同時考慮這兩個因素。利用轉基因方法、化學和物理誘變方法,本實驗室獲得了75株微擬球藻變異藻株。為評價這些變異藻株的油脂生產潛力,使用尼羅紅染色結合流式細胞儀分析藻株的中性脂含量,同時考慮藻株的生物量,綜合比較了藻株的油脂生產性能,以期為這些藻株的生產應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養(yǎng)方法

本實驗所用微擬球藻誘變藻株均來自野生藻株085,其中基因過表達藻株12株[9],分別為Δ6去飽和酶基因(NoD6)3株、Δ12去飽和酶基因(NoD12)3株,以及2條來自三角褐指藻1條來自擬南芥的二酰甘油酰基轉移酶DGAT基因,命名為PtDGAT1(2株)、PtDGAT2(3株)和AtDGAT(1株)。28株物理誘變藻株均為常壓室溫等離子(ARTP)誘變[10]。33株化學誘變藻株分別為博來霉素誘變5株[11],甲基磺酸乙酯(EMS)誘變7株[12],亞硝基胍(NTG)誘變18株[13-14]。另外還有Sandoz9785抗性篩選藻株3株[15]和煙氣馴化實驗1株。所有藻種均保存在中國海洋大學應用微藻生物學實驗室微藻種質庫,保存條件為 (17±1) ℃,光照強度35～45 μmol·m-2·s-1,光暗周期10 h∶14 h,每6個月轉接1次。

為活化保存藻株用于實驗,對藻種進行預培養(yǎng),培養(yǎng)基為f/2海水培養(yǎng)基,鹽度30±2,光照強度為50～60 μmol·m-2·s-1,溫度為(25±3) ℃,每天定時搖瓶3次,培養(yǎng)至指數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

1.2 藻株中性脂含量的檢測

尼羅紅是一種脂溶性熒光染料,其在特定波長下熒光強度與油脂含量呈顯著的線性關系[16],可用于表征微藻的中性脂含量,其相關系數(shù)達0.998[17]。

本實驗所用的流式細胞儀型號為Beckman Coulter FC500,氬離子激光器激發(fā)波長為488 nm,尼羅紅發(fā)射波長為617 nm。分析軟件為CXP Analysis,選擇使用FL3通道。因微藻體內自有色素干擾實驗結果,故在測定時先測定無染色藻株的自發(fā)熒光作為背底,后測量染色細胞熒光數(shù)值,去背底得到最終結果。每次測量時3個平行樣品均取1萬個細胞,共同計算表征樣品熒光強度。

具體操作為取培養(yǎng)至平臺期的微擬球藻藻液2 mL于離心管中,6 000 r/min離心5 min,去上清,加入過濾后的海水進行吹打清洗后再次離心,重復2次,棄上清,保留藻細胞。加入用海水稀釋過的體積分數(shù)為25%的DMSO溶液0.5 mL,充分震蕩后室溫避光靜置10 min[8]。為確定尼羅紅濃度和染色時間,保持其他條件不變,設定不同濃度的尼羅紅染料對微擬球藻進行染色處理:0,0.1, 0.3,0.5,1和5 mg/mL。在不同染色濃度的基礎上設定了兩組染色時間為10與30 min。每組實驗重復3次,取平均值用于分析。

1.3 藻株培養(yǎng)過程中中性脂含量分析

為確定微藻中性脂含量測定的時間,選取野生藻株與ARTP誘變藻株194進行比較實驗。

兩株藻接種后藻液(75 mL)光密度值(OD)均為0.1,在100 mL的錐形瓶中進行培養(yǎng),培養(yǎng)條件同預培養(yǎng),每株藻均做3個重復。培養(yǎng)過程中,每天定時取2 mL藻液通過分光光度計(Hitachi U-3310)測定其在680 nm波長下的OD值[18],以1 mL蒸餾水進行調零。培養(yǎng)周期為12 d。

分別取培養(yǎng)第1,3,5,7,9,11,13天的藻液2 mL,如1.2所述步驟進行洗滌染色,采用優(yōu)化后的染色條件,尼羅紅濃度為1 mg/mL,染色時間為10 min,利用流式細胞儀測定中性脂的相對含量。

1.4 藻株生物量和中性脂產率的測定

取10 mL藻液于離心管中,用烘干至恒重的GF/C玻璃纖維素膜(直徑47 mm,孔徑0.45 μm)抽濾藻液,濾膜放入恒溫箱中60 ℃烘干至恒重后,稱量過濾后生物膜的質量,減去生物膜的質量,計算生物量。

以原始藻株作為標準,將變異藻株與原始藻株的生物量之比作為生物量提升的指標,同理將變異藻株與原始藻株的熒光強度之比作為中性脂提升的指標,二者乘積為變異藻株的相對中性脂產率,用于表征其產油能力的水平[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本文所涉及實驗均設置3個平行,數(shù)據(jù)采用軟件SPSS25.0進行單因素方差分析,事后分析為圖基(HSD)檢驗,顯著性水平P<0.05,采用Origin Pro 2018繪圖。

2 結果分析

2.1 微擬球藻尼羅紅染色方法優(yōu)化

尼羅紅染色后通過流式細胞儀進行熒光強度測定。結果顯示(見圖1),微藻熒光強度受染尼羅紅染色時間和濃度共同影響,尼羅紅濃度較染色時間對熒光強度影響更顯著。染色10 min處理組中,熒光強度與染色細胞百分數(shù)均有所上升,染色細胞百分數(shù)1 mg/mL處理組與5 mg/mL處理組差別不顯著。此外,染色30 min處理組中,當濃度為0.1～1 mg/mL時,隨著尼羅紅濃度的增加,熒光強度與染色細胞百分數(shù)均有所上升,但高濃度長時間處理會影響細胞活性,導致5 mg/mL處理組熒光強度與染色細胞數(shù)均下降。綜合兩方面的結果,濃度1 mg/mL的尼羅紅染色10 min比較理想。

(a,b表示方差分析差異程度,同一圖中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0. 05)。 a、b represents the analysis of variance difference. Values in the same picture with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).)

2.2 藻株生長及中性脂含量測定時間的確定

用OD值表征微藻的生長情況,結果顯示(見圖2(A)),兩株微擬球藻的生長周期無顯著差異。在經過2 d的適應后,藻株進入指數(shù)生長期,藻細胞密度快速增長。在第6天進入平臺期,生長放緩,生物量趨于穩(wěn)定緩慢上升。隨著微藻生長,藻細胞脂質含量經過一個先升高后降低并逐漸穩(wěn)定的過程(見圖2(B))。藻株085中性脂在第3天達到最高,第7天后趨于穩(wěn)定。藻株194總體中性脂含量高于085,其脂質含量在第1天達到頂峰后產生波動,在第7天趨于穩(wěn)定。由于第1天和第3天微藻處于指數(shù)生長期,生物量較低,第9天其生物量與油脂含量較高且處于穩(wěn)定狀態(tài),同時考慮微藻生長與油脂積累,選擇微藻培養(yǎng)至第9天為測量藻株油脂積累量的時間。

圖2 原始藻株085與誘變藻株194培養(yǎng)過程中細胞密度(A)和熒光強度(B)的變化

2.3 微擬球藻藻株的篩選比較

2.3.1 變異微藻的油脂產率分析 以原始藻株085作為對照,分析實驗藻株中性脂含量和生物量的增長情況,結果顯示(見表1),除藻株104和198之外,其余實驗藻株生物量均大于原始藻株,藻株183生物量提升幅度最大,為原始藻株的57.5%。除藻株229和191外,其余實驗藻株中性脂含量均大于原始藻株,藻株183中性脂提升幅度最大,為原始藻株的154.9%。綜合比較藻株中性脂的產率,結果顯示,所有實驗藻株的相對產率均大于原始藻株,其中藻株231相對產率提升幅度最大,為原始藻株的223.8%。

表1 75株微擬球藻生物量與中性脂相對含量

進一步分析發(fā)現(xiàn),藻株192的生物量明顯高于原始藻株(原始藻株的154.6%),但脂質含量未見顯著提升(僅為原始藻株的119.80%),其油脂相對產率并不優(yōu)異(僅為原始藻株的185.2%)。而藻株232脂質含量高于原始藻株(為原始藻株的146.50%),但生物量未見顯著提升(為原始藻株117.4%),其相對產率也不突出(僅為原始藻株的172.0%)。這說明,微藻的脂質產率受到兩方面的影響,一是生物量,二是油脂含量,在高油脂微藻藻株篩選過程中不僅要考慮藻株的脂質含量,也要考慮藻株的生物量生產能力。

2.3.2 不同育種技術提高油脂產率的效果分析 以油脂相對產率提升到210%做為優(yōu)良藻株的篩選指標,轉基因誘變藻株中,5株轉基因藻株中性脂相對產率均高于210%,其中088號藻株相對產率最高,為252.2%。ARTP誘變藻株中,有6株相對產率高于210%,其中182號藻株相對產率最高,為244.6%。EMS誘變藻株中,有3株相對產率高于210%,其中101號藻株相對產率最高,為259.0%。博萊霉素誘變藻株,僅212號藻株相對產率高于210%,為247.8%。NTG誘變藻株中,有4株相對產率高于210%,231號藻株相對產率最高,為323.8%。另外,除草劑Sandoz9785篩選的3株藻株中,252號藻株相對產率最高,為196.8%,煙氣馴化藻株相對產率較低,僅為126.5%。上述結果表明,不同育種技術用于微擬球藻高油脂產率的培育存在明顯不同,其中231號、088號和101號藻株表現(xiàn)格外突出,其油脂相對產率均高于250%,有望應用于工業(yè)生產。

3 討論

微藻中性脂傳統(tǒng)的測定步驟包括溶劑萃取、薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)等,其操作繁瑣,費時費力,難以實現(xiàn)對誘變藻株的快速篩選[17]。尼羅紅(NR-9-二乙氨基-5-苯并[α]苯并惡嗪酮)是一種脂溶性熒光染料,Cooksey等在1987年發(fā)現(xiàn),尼羅紅可與細胞內的中性脂結合,產生黃金色熒光,熒光強度與細胞內結合中性脂的量密切相關,可作為微藻中性脂含量檢測的方法[20]。2010年Doan等[21]將改良的尼羅紅染色法運用到微擬球藻中性脂含量的分析之中并取得良好效果。2016年Alemán-Nava等[8]在前人的研究基礎上制定了不同微藻尼羅紅脂質測定的規(guī)范方法,該方法涉及脂質測定所必須遵循的五個步驟,本實驗基于該方法開展了實驗藻株中性脂含量的分析。

誘變和基因工程是促進微藻脂質合成的兩種策略。基因工程可以按照設計者意愿直接改變油脂合成路徑中的關鍵酶基因[22]。二酰甘油?；D移酶(DGAT)作用于TAG生物合成路徑中的最后一步,催化二酰甘油和游離?；o酶A縮合反應生成三酰甘油即TAG,此外Δ6去飽和酶與Δ12去飽和酶位于PUFA合成路徑中,與油脂合成相關。結果顯示,改變以上基因均有效地提高了微擬球藻的中性脂含量,因未改變生長過程相關基因,故其生物量并未出現(xiàn)顯著變化。5株轉基因藻株中性脂產率均高于210%,說明轉入目標功能基因可大幅度提高微藻產油能力,但同時也可看到,本實驗轉基因藻株中性脂產率并不是最高的,說明進一步篩選油脂合成基因以及促進生長基因對于提高微擬球藻的油脂產率還是很有必要的。目前微擬球藻的全基因組測序工作已經全部完成[9],基因的注釋工作還在繼續(xù),這為獲得以上兩方面優(yōu)良基因提供了可能。

微藻常壓室溫等離子體誘變(ARTP)是一種基于射頻和大氣壓離子體射流的物理誘變技術。Cao等[23]于2017年利用ARTP誘變獲得了一株蛋白核小球藻的突變體,與對照組相比,其OD680增加了32.08%,干質量和產脂量分別增加了22.07%和16.85%。Sun等[24]利用ARTP誘變并定向篩選丙二酸(MA)抗性藻株,獲得了高脂產率柵藻誘變株,其總脂含量比對照組高114.99%。本文28株微擬球藻ARTP誘變藻株中,有15株中性脂相對含量有顯著提升,最高增加了105.8%,有5株生物量有顯著提升,最高提升了60.9%,這說明ARTP誘變不僅可以提升藻株油脂含量也可以提升藻株生長。

甲基磺酸乙酯(EMS)和亞硝基胍(NTG)均屬于烷化劑,其誘變機理為其活潑烷基與DNA分子中的氫原子發(fā)生烷化反應,引起堿基錯配從而導致微藻的相關基因發(fā)生改變。Anandarajah等[6]使用EMS處理微擬球藻,與野生型相比,誘變藻株的總脂生產能力提高了25.7%。本實驗的7株EMS誘變藻株,其中性脂相對含量均有顯著提升,但僅有1株生物量有明顯改變。Chou等[25]利用NTG誘變獲得了一批耐熱小球藻誘變株,其不僅可在40 ℃高溫下生長還顯示出比野生型更高的糖類和脂類含量。本實驗18株NTG誘變藻株中,其中11株藻的中性脂相對含量有明顯的改變,但所有誘變藻株生物量未發(fā)生顯著改變,如誘變藻株231,盡管其油脂產率為原始藻株的323.8%,是實驗藻株中油脂產率最高的,這主要是該藻株油脂積累能力比原始藻株高147.3%,而生物量僅提升了29.0%。這說明這類誘變劑可能更適用于微藻油脂含量的提升。

博萊霉素是一種來自放線菌的糖肽類抗腫瘤抗生素,其可與鐵的復合物嵌入 DNA 中,導致 DNA 單鏈和雙鏈斷裂。張琳等[26]選取了5種抗生素對微擬球藻的抗生素抗性進行了比較,結果顯示,微擬球藻對博萊霉素表現(xiàn)出高度敏感性。在固體培養(yǎng)中, 0.5 μg/mL的博來霉素即可完全抑制微擬球藻的生長。博萊霉素用于誘變微藻目前報道不多,本研究博來霉素誘變藻株中,藻株212號,生物量比原始藻株提高了49.8%,中性脂含量提高了65.5%,最終油脂產率提高了147.8%,說明博萊霉素不僅可以提高微擬球藻的油脂生產,也可以提高生物量的積累能力。

4 結語

本研究利用尼羅紅染色結合流式細胞儀對75株微擬球藻進行了高通量篩選,結果顯示該方法是一種方便快速的篩選方式?；谟椭a率是原始藻株250%這一選擇指標,本實驗75株藻株中,有3株表現(xiàn)突出,有望應用于生物柴油的生產。