周宇駿，杜雅萍，陳宇明，胡鵬輝，袁 智，龍明英，譚鏡明

(1.湖南中科基因技術(shù)有限公司，湖南 長沙 410128 ； 2. 長沙市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法局，湖南 長沙 410128)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)屬尼多病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬成員，是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要病原之一[1]。仔豬感染PEDV后可引起急性腹瀉、嘔吐和脫水等臨床癥狀，且發(fā)病哺乳仔豬會出現(xiàn)極高的死亡率[1-2]。PEDV于1971年首次在英國報道，目前該病原已在全世界各地廣泛流行，如歐洲、亞洲和北美洲等，給全世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。

PEDV屬于有囊膜、單股正鏈RNA病毒，其基因組大小約28 kb，可編碼多個結(jié)構(gòu)蛋白，其中包括纖突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、小包膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N)，其中M蛋白參與病毒粒子組裝和出芽等過程，同時可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體[3]。當(dāng)前全世界流行的PEDV毒株可分為2種基因型(G1和G2)，但不同基因型PEDV毒株之間M基因相對保守，研究人員可以使用該基因分析田間毒株的遺傳多樣性，以此為疫苗的選擇與進一步防控提供依據(jù)[2,4]。

近年來，湖南省生豬養(yǎng)殖水平逐漸提高，但PEDV在該地區(qū)豬場仍廣泛流行。本試驗于2021年1—12月在湖南省部分地區(qū)213個發(fā)生嚴重腹瀉豬場采集樣品1 406份，以實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)方法檢測PEDV流行情況 ； 并對22份陽性樣品M基因進行測序與分析，旨在了解當(dāng)前湖南省PEDV感染情況和流行的基因型，為制定有效的防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2021年1—12月，從湖南省衡陽、邵陽、永州、益陽、郴州、長沙等14個州市213個腹瀉豬場采集豬腹瀉樣品共1 406份，其中棉拭子、糞便和腸組織或內(nèi)容物樣品數(shù)量分別為507、443份和456份。無菌采集樣品，低溫送至湖南省中科基因有限公司，保存于-80 ℃，待檢。

1.2 主要試劑 FineMag快速磁珠法病毒DNA/RNA基因組提取試劑盒，購自濟凡生物科技(常州)有限公司；2× T5 Super PCR Mix、DL2 000 DNA Marker和瓊脂糖粉末等，均購自湖南擎科生物有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)核酸檢測試劑盒，購自廣州維伯鑫生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank收錄的PEDV毒株M基因序列，使用NCBI網(wǎng)站中Primer BLAST軟件在線設(shè)計擴增M基因片段的特異性引物，引物序列為：M-F：5′-TCCCGTTGATGAGGTGATTGAA-3′，M-R：5′-GTCCATAGACAATTGTTGTAG-3′，引物委托長沙擎科生物有限公司合成。

1.4 病原檢測及PEDVM基因擴增 將滅菌研磨棒和研缽置于冰上冷卻，取適量樣品(如組織、糞便或拭子)置于研缽內(nèi)，加入2 mL滅菌生理鹽水，充分研磨；將混合液倒入2 mL離心管中，在4 ℃條件下高速(10 000 r/min)離心2 min，取200 μL上清用于病毒RNA基因組提取，其操作步驟按照試劑盒說明書進行。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20 ℃。以cDNA基因組為模板，使用PEDV核酸檢測試劑盒對病原進行檢測。

以部分PEDV陽性樣品cDNA基因組為模板，以反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法對其M基因序列進行擴增，反應(yīng)體系(50 μL)：2×PCR預(yù)混液25 μL，上、下游引物各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL和無RNA酶水18.0 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5.0 μL擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性產(chǎn)物送至長沙擎科生物有限公司進行測序。

1.5 PEDV毒株M基因序列分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載具有代表性的PEDV毒株M基因序列，應(yīng)用DNASTAR 7.0軟件對獲得序列進行核苷酸和對應(yīng)氨基酸同源性分析；此外，使用MEGA 7.0軟件中鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以分析不同毒株所屬基因型。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉仔豬臨床觀察及病理剖檢 本試驗采集的腹瀉樣品大部分來自于仔豬或保育豬，其中仔豬腹瀉臨床癥狀及病理變化如圖1所示，腹瀉仔豬體型消瘦，皮膚多處被糞污污染(圖1A)；糞便為灰黃色，因持續(xù)腹瀉導(dǎo)致肛門肌肉松弛；進一步剖檢可發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬小腸腫脹擴張，腸壁變薄且無彈性，腸道內(nèi)充滿黃色液體(圖1B)。

圖1 仔豬腹瀉臨床癥狀及剖檢癥狀

2.2 PEDV流行病學(xué)調(diào)查 2021年1—12月，本試驗從湖南省不同地區(qū)共213個豬場采集疑似感染PEDV樣品共1 406份，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)85個豬場中存在PEDV陽性豬群，場陽性率為39.91%；303份樣品為PEDV核酸陽性，平均檢出率為21.55%。不同類型樣品檢出率差異較大，其中棉拭子樣品檢出率最低，為14.40%；腸組織或內(nèi)容物檢出率最高，為29.39%；而腹瀉糞便檢出率為21.67%(表1)。不同發(fā)育階段腹瀉豬群樣品檢出率中以仔豬和保育豬最高，分別為25.95%和20.26%，而育肥豬和繁殖母豬檢出率分別為11.56%和9.30%(表2)。進一步分析不同季節(jié)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，春季和冬季來源樣品PEDV檢出率較夏季和秋季高，分別為25.05%、24.21%和15.91%、12.71%(表3)。

表1 不同類型樣品PEDV病原檢測

表2 不同發(fā)育階段腹瀉豬群PEDV病原檢測

表3 不同季節(jié)PEDV病原檢測

2.3 部分PEDV陽性樣品M基因RT-PCR擴增 采用RT-PCR方法對22份PEDV陽性樣品M基因進行擴增，均得到與預(yù)期片段大小一致的目的片段。部分凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，15個陽性樣品均擴增出約520 bp的條帶，與預(yù)期大小一致，且陽性對照和陰性對照均成立。

圖2 部分PEDV陽性樣品M基因序列擴增

2.4 PEDV毒株M基因序列遺傳進化分析 將22份PEDV陽性樣品M基因擴增產(chǎn)物進行雙向測序，其后對測序結(jié)果進行拼接。結(jié)果顯示，22個毒株M基因擴增序列大小一致，均為525 bp。根據(jù)樣品來源將22個毒株M基因序列分別命名：CH/HNLY1-2(湖南瀏陽)、CH/HNCS(湖南長沙)、CH/HNZZ1-2(湖南株洲)、CH/HNHH(湖南懷化)、CH/HNCZ(湖南郴州)、CH/HNSY1-3(湖南邵陽)、CH/HNCD(湖南常德)、CH/HNYY1-2(湖南岳陽)、CH/HNYiY1-2(湖南益陽)、CH/HNYZ(湖南永州)、CH/HNHY(湖南衡陽)、CH/HNXT1-2(湖南湘潭)、CH/HNLD(湖南婁底)、CH/HNXX(湖南湘西)和CH/HNZJJ(湖南張家界)。

將獲得的22個毒株與GenBank數(shù)據(jù)庫下載的PEDV毒株M基因序列共同構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果顯示，所有PEDV毒株在進化樹上可分為2個大分支，分別為Genotype I(傳統(tǒng)株)和Genotype II(變異株)；本試驗獲得的22個PEDV毒株中有19個毒株屬于變異株，與國內(nèi)流行的變異株AJ1102和GDA等毒株相距較近，剩余3個毒株屬于傳統(tǒng)株，與PEDV CV777疫苗株和國內(nèi)早期分離毒株(如CHS)相距較近。以上結(jié)果表明，湖南省流行的PEDV毒株基因型相對復(fù)雜，同時存在變異株和傳統(tǒng)株，但變異株仍然是優(yōu)勢毒株。

圖3 基于PEDV M基因序列構(gòu)建遺傳進化樹

2.5 PEDV毒株M基因序列同源性分析 將本試驗獲得的22個毒株與參考毒株M基因核苷酸序列進行同源性分析。結(jié)果顯示，22個毒株之間同源性為97.8%～100.0%，與國內(nèi)外流行PEDV毒株對應(yīng)序列同源性為96.8%～100.0%；其中CH/HNCS、CH/HNSY-2和CH/HNYY-1毒株與國內(nèi)流行傳統(tǒng)株(CHS)和疫苗株(CV777)較其他19個毒株同源性更高，分別為99.1%～99.4%和99.4%～99.7%，與PEDV變異株(如AJ1102和GDA)同源性為98.1%～98.6%；其他19個毒株與PEDV變異株(如AJ1102和GDA)M基因序列同源性最高，為99.4%～100.0%。

3 討論

近年來，湖南省生豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，且養(yǎng)殖水平有較大的提高，但豬流行性腹瀉仍然是影響該地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一，且仔豬持續(xù)腹瀉給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[5]。根據(jù)PEDV基因組變異情況，當(dāng)前可將國內(nèi)外流行的毒株分為2個基因型，分別為Genotype I(傳統(tǒng)株)和Genotype II(變異株)，其中我國流行的大部分毒株為變異株，但部分地區(qū)同時存在變異株和傳統(tǒng)株的流行[2,6]。已有大量研究表明，基于PEDV CV777株研發(fā)的疫苗對當(dāng)前流行的變異株防控能力有限，因此了解豬場流行PEDV毒株基因型對疫苗選擇和疫病防控措施制定與實施十分重要[7]。

本試驗對湖南省不同地區(qū)213個豬場送檢的1 406份疑似感染PEDV臨床樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV場陽性率為39.91%(85/213)，樣品平均陽性率為21.55%(303/1 406)，這表明PEDV仍然廣泛流行于湖南省各地區(qū)，但其檢出率較Tan等于2017—2018年的調(diào)查結(jié)果低(48.76%,59/121)[8]，筆者猜測可能存在多種原因：(1)本試驗調(diào)查數(shù)據(jù)樣品種類更豐富，數(shù)量更多；(2)為有效防控非洲豬瘟疫情，各豬場提高了飼養(yǎng)管理和生物安全水平，這在一定程度上也有利于豬流行性腹瀉的防控；(3)有多種新發(fā)病原在湖南省不同地區(qū)流行，導(dǎo)致豬群腹瀉的病因較以前更為復(fù)雜，如豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)，這使得腹瀉樣品中PEDV檢出率相對較低。進一步分析結(jié)果顯示，腸組織或內(nèi)容物(29.39%)和腹瀉糞便(21.67%)樣品較棉拭子(14.40%)檢出率更高，這可能提示腸組織(或內(nèi)容物)和腹瀉糞便更加容易檢測腹瀉相關(guān)病原(如PEDV)，由于棉拭子蘸取糞便量有限，且在運輸過程中容易干燥或病毒滅活，這可能降低病原檢出率。有研究表明，PEDV感染可提高繁殖母豬的流產(chǎn)率和返情率等，并會降低分娩率和胎產(chǎn)總仔數(shù)等，且可以影響育肥豬的生長性能[9]，而本試驗也發(fā)現(xiàn)部分腹瀉繁殖母豬和育肥豬來源樣品中存在PEDV，說明PEDV可感染育肥豬和繁殖母豬，應(yīng)引起重視。

為進一步分析湖南省流行PEDV毒株的基因型和遺傳變異情況，本試驗從湖南省不同地區(qū)部分豬場隨機選擇22份PEDV陽性樣品M基因序列進行擴增與分析。結(jié)果顯示，湖南省PEDV流行株基因型較復(fù)雜，同時存在變異株和傳統(tǒng)株，但變異株仍然是優(yōu)勢株，這與Tan等調(diào)查結(jié)果一致[8]。基于M基因序列同源性分析結(jié)果顯示，湖南省流行毒株出現(xiàn)不同程度的變異，但由于該基因在病毒進化過程中相對保守，為進一步分析流行毒株的變異情況，還需要對其他變異速率相對較快的基因片段進行擴增與分析，如S基因和ORF3基因等[1-2,10]。