劉建華，吳桂靈，胡 月，加爾肯，賈欽瑞，孫文程，撒瑞雪，張嗣玉，冉多良

(新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬皰疹病毒1型(Equine herpesvirs type 1，EHV-1)是馬鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis，ER)和馬皰疹病毒性腦脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy，EHM)的病原體之一，還可引起孕馬流產和新生馬駒死亡，嚴重制約著全球馬產業(yè)的健康發(fā)展[1]。EHV-1屬于皰疹病毒目(Herpesvirales)，皰疹病毒科(Herpesviridae)，α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)，水痘病毒屬(Varicellovirus)。和其他α亞科的皰疹病毒一樣，該病毒復制周期短，具有建立周圍神經系統(tǒng)潛伏期的獨特能力，這使得其具有很強的傳染性，可直接或間接接觸傳播[2]。EHV-1通過病毒外層囊膜與宿主細胞質膜或內體膜融合而進入細胞[3]。其中囊膜糖蛋白在病毒的識別、吸附、侵入等過程中起著重要的作用。目前研究較深入的有gB、gC、gD、gH、gL糖蛋白，與病毒的致病力息息相關[4]。而關于gp2糖蛋白功能的研究較少，值得注意的是，該基因只存在于α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬的馬皰疹病毒上。目前除EHV-1有部分報道外，未見其他馬皰疹病毒關于gp2基因功能的研究報道。我國于2015年分離出1株馬皰疹病毒流行毒株XJ2015株，對該毒株的進化分析表明，gp2基因為該病毒76個基因中保守性最低的基因[5]。該基因的特殊性決定了其在病毒致病過程中發(fā)揮著獨特的作用，相關致病機制尚需進一步研究證明。

本試驗以EHV-1 XJ2015株為研究對象，設計特異性引物擴增gp2基因完整開放閱讀框基因進行測序，對基因序列進行遺傳進化分析，對其所推導的氨基酸序列進行差異性分析，并對gp2蛋白進行蛋白質性質分析。以期為深入解析EHV-1gp2基因及其編碼蛋白功能、制作新型疫苗和診斷試劑等提供生物信息學依據。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞及試劑 馬皰疹病毒1型毒株于2015年分離自新疆伊犁地區(qū)，命名為XJ2015。RK-13細胞系由本實驗室保存。2 × Primer STAR Max Mix，購自北京全式金生物技術有限公司；DL5 000 DNA Marker，購自TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；Viral DNA Kit和Gel Extraction Kit，均購自OMEGA廣州飛揚生物工程有限公司。

1.2 引物設計 將EHV-1 XJ2015株接種于RK-13細胞，待病變率達到80%時收獲病毒液。按照Viral DNA Kit說明書提取病毒基因組DNA，測定基因組的濃度及純度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照本實驗室已經獲得的EHV-1 XJ2015株基因組序列，應用Primer 5.0軟件設計1對特異性引物，gp2-F：5′-TCAAGTGCTGCAGAGTCGTC-3′，gp2-R：5′-GAAGTTGAGTGGGC-GTTGGG-3′。

1.3 目的基因的擴增與鑒定 PCR擴增采用50 μL反應體系：2×Primer STAR Max Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 19 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；繼續(xù)72 ℃延伸10 min，72 ℃加A尾30 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后使用Gel Extraction Kit純化并與pMD19-T載體相連：目的片段4 μL，連接酶5 μL，載體0.5 μL，Nuclease-Free Water 0.5 μL，混合后于16 ℃金屬浴連接3 h。將連接產物轉化至大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞中，挑取白色克隆進行鑒定。以EHV-1基因組DNA作陽性對照，載體DNA作為陰性對照，對重組質粒進行PCR鑒定和酶切鑒定。鑒定成功后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 基因特征及系統(tǒng)進化分析 使用DNAMAN、DNASTAR軟件對EHV-1 XJ2015gp2基因特征進行分析，使用Clustal W列進行數據比對分析，采用MEGA 7.0中的Neighbor joining法繪制系統(tǒng)進化樹。

1.5 蛋白質分子特征分析 使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列相似性分析，DNASTAR軟件進行蛋白質組分分析、疏水性分析、表面可及性分析、抗原指數分析，Signal P 5.0、TMHMM 2.0、Net-NES 1.1、NetSurfP-2.0、Phyre2 Server在線服務器對gp2蛋白進行蛋白質性質分析。

2 結果

2.1 基因的擴增與鑒定 采用gp2基因特異性引物進行PCR擴增，EHV-1 XJ2015株擴增出現(xiàn)3個條帶，經測序鑒定，其中2個條帶為非特異性擴增，中間為目的條帶，其大小約為2 846 bp，與預期結果相符合。

圖1 馬皰疹病毒1型gp2基因的PCR擴增

2.2 基因特征及系統(tǒng)進化分析 EHV-1 XJ2015株gp2基因核苷酸序列長度為2 454 bp，G+C含量占54.89%，A+T占45.11%，其中堿基A、G、T、C分別占26.49%、19.60%、18.62%和35.29%。gp2基因僅存在于α-皰疹病毒亞科中的馬皰疹病毒中，其中，EHV-3單獨為一分支，EHV-1、EHV-4、EHV-8、EHV-9被列為同一分支，但EHV-1與EHV-8、EHV-9親緣關系較EHV-4近，此外，EHV-8 wh株與EHV-1毒株列為同一分支，在EHV-1與EHV-8之間可能發(fā)生基因重組(圖2A)。

通過對NCBI上已有的30株EHV-1gp2基因分析，系統(tǒng)進化樹共分為兩大分支，其中3株為非馬源性毒株，屬于同一分支，并且這3株具有相似的突變位點，EHV-1 XJ2015株在另一分支中，該分支均是馬體分離毒株(圖2B)。經基因相似性分析表明，馬體分離株EHV-1 5586株與其他分離株的相似性均較低，XJ2015株與5586株gp2基因相似性僅為64.3%，而與其他分離株gp2基因的相似性為92.5%～98.1%(圖2C)。

圖2 gp2基因的遺傳進化分析

2.3 EHV-1 gp2蛋白分子特征分析 EHV-1 XJ2015株gp2蛋白氨基酸序列長度為817 aa，相對分子質量為82.095 51 kDa，理論等電點PI=5.417，堿性氨基酸(K、R)占4.16%；酸性氨基酸(D、E)占6.00%；疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)占24.24%；親水性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)占52.02%。通過對氨基酸序列分析表明，31株EHV-1 gp2蛋白氨基酸序列一致性為62.92%，除5586株以外，30株EHV-1毒株gp2蛋白氨基酸序列一致性為90.38%，總差異氨基酸數為178個(圖3A)。此外，gp2蛋白存在部分氨基酸序列重復，在第186～225位點和第230～273位點，分別出現(xiàn)TAATT重復。在EHV-1 Ab4株gp2蛋白中，還存在SSATTAATT序列重復，但在EHV-1 XJ2015株中沒有發(fā)現(xiàn)該序列重復(圖3B)。

圖3 gp2蛋白氨基酸序列差異性分析

2.4 基因特征及系統(tǒng)進化分析

2.4.1 蛋白質二級結構、親水性、抗原指數和表面可及性分析 EHV-1 gp2蛋白二級結構預測結果顯示：EHV-1 gp2蛋白富含無規(guī)卷曲，包含719個氨基酸，含量高達88%；其次β-折疊包含79個氨基酸，含量為9.7%；而α-螺旋僅包含19個氨基酸，含量為2.3%；未見β-轉角。EHV-1 gp2蛋白親水性較高區(qū)段在第25～85、319～367、377～404位和第407～567位氨基酸；抗原指數分析表明位于第25～130、144～152、281～374、378～500、508～564、665～686位和第744～784位氨基酸具有顯著的抗原性；表面可及性區(qū)域位于第25～85、105～124、155～188位和第321～565位氨基酸。B細胞表位分析表明第25～130位和第273～565位氨基酸易形成潛在的抗原表位(圖4)。

圖4 gp2蛋白二級結構、親水性、抗原指數和表面可及性分析

2.4.2 信號肽、α跨膜螺旋結構域及核外運信號分析 Signal P 5.0信號肽預測結果顯示：EHV-1 gp2蛋白包括一種由Sec轉運蛋白轉運并被信號肽酶I(Lep)切割的“標準”分泌信號肽，切割位點在第21～22位氨基酸：AIG-ST，表明gp2蛋白為分泌蛋白。TMHMM 2.0 α跨膜螺旋結構域預測結果顯示：EHV-1 gp2蛋白跨膜預測的期望值為22.844 87，高于閾值18，存在1個跨膜螺旋結構域，位于第787～809位氨基酸處,共包含23個氨基酸殘基，結構簡式為ALVAATTLTVTILCLLCCLYCML。Net-NES 1.1核外運信號預測結果顯示：EHV-1 gp2蛋白包括1個核外運信號，位于第9～15位氨基酸，共包含7個氨基酸殘基，結構簡式為LLLCMAV。

2.4.3 蛋白質二級結構及三級結構預測 利用Phyre2 Server 在線服務器預測EHV-1 gp2蛋白的三級結構，采用同源建模法預測，預測模型置信度為91.5%，其中73%的序列沒有同源結構，使用折疊識別法預測，而22%的序列含180個殘基與免疫系統(tǒng)IgG-1鏈C端結構相似(圖5)。

圖5 gp2蛋白三級結構預測

3 討論

病毒基因功能的解析是研究病毒致病機制的重要環(huán)節(jié)。目前，對皰疹病毒的基因功能的研究主要集中在人型皰疹病毒，而其他屬皰疹病毒主要在于對同源基因進行功能驗證[6]。在EHV-1中，研究較為深入的基因有UL16(gC)、UL33(gB)、US5(gD)、UL63(EICP0)、UL38(TK)等，這些基因在單純皰疹病毒1型上均有對應的同系物[7]。gp2基因是馬皰疹病毒的特有的基因，無法進行功能驗證，想要掌握該基因的功能，生物信息學分析是必不可少的基本環(huán)節(jié)[8-9]。通過研究蛋白質的二級和三級結構，有助于了解蛋白質的作用和其如何行使其生物功能，并且更深層次地明確該蛋白與其他分子之間的相互作用。前期基礎中對該蛋白功能進行預測，并設計相關功能確認的生物學試驗，也為改造蛋白質提供可靠的依據[10]。此外，通過預測目的蛋白的信號肽序列，經切除信號肽序列后的前體蛋白才可能成為具有正常功能的成熟蛋白。對信號肽切割位點的預測，可為進一步進行表達研究的引物設計和表達載體的構建提供必要的信息[11]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，30株EHV-1病毒gp2基因相似性為92.5%～98.1%，僅5586毒株與其他分離株的相似性較低，這表明gp2基因屬于EHV-1較保守的基因，而在之前的研究中，進行31株病毒序列比對時顯示gp2基因是保守性最低的基因，是由5586毒株的差異性所致。此外，gp2蛋白存在部分氨基酸序列重復，且表現(xiàn)出毒株差異性，這些重復序列的差異及功能值得進一步研究。gp2蛋白預測包括1個信號肽、1個螺旋跨膜結構域和1個核外運信號，表明gp2蛋白是分泌型蛋白，這對于在不同的載體系統(tǒng)中表達重組蛋白發(fā)揮著重要的作用。二級、三級結構預測顯示，該蛋白在無規(guī)則卷曲區(qū)的氨基酸占比為88%，且極性分子居多，親水性氨基酸占52.02%，第25～133位和第273～587位氨基酸親水性和抗原性較強，易形成潛在的抗原表位，表明該蛋白具有良好的抗原性。但是利用大腸桿菌 DH5α表達該蛋白時，表達量較低，這可能與gp2蛋白攜帶的信號肽有關。此外，Smith等證明EHV-1 RacL 11株在感染細胞的過程中，gp2全長的結構會被切割為2個亞基，在序列HRGRAGGR506R507G處2個相鄰的精氨酸殘基發(fā)生蛋白水解裂解，產生42 kDa的羧基末端和富含絲氨酸和蘇氨酸的約200 kDa的氨基末端(高度O-糖基化)[12]。本試驗對EHV-1 XJ2015株gp2基因序列進行分析，表明在序列HRGRAGGR526R527G處也存在蛋白裂解位點。因此，在構建原核表達載體時需將信號肽切割位點及蛋白裂解位點去除。

目前已經證明gp2基因產物對于病毒在組織培養(yǎng)中的生長是非必需的[13]，但是發(fā)現(xiàn)該基因的缺失使得病毒在感染細胞中形成的噬斑大小和病毒滴度顯著下降，需要進一步的研究來闡明該基因中重復序列的核苷酸數目以及重復序列的修飾在EHV-1的免疫逃逸和致病性中重要性[14-15]。盡管gp2基因缺失的突變病毒能從感染的BHK-21細胞中釋放出來，但突變病毒無法在5%～15%的蔗糖密度梯度上進行條帶化，這表明缺少gp2基因的EHV-1在蔗糖溶液中的浮密度會發(fā)生改變[16]。體內觀察表明，突變病毒在感染小鼠的肺組織中增殖能力較差，并且毒性不如野生型病毒和其他的EHV-1 lacZ插入突變體[17]。Learmonth等研究表明，雖然EHV-1 gp2的C末端區(qū)域與EHV-4 gp2的氨基酸同源性為73%，但其抗原僅能檢測到EHV-1誘導產生的抗體，而不能檢測到EHV-4誘導產生的抗體，這為研發(fā)EHV-1特異性診斷測試提供基礎[18]。

本試驗為該基因的進一步研究提供理論指導，為新型疫苗和診斷試劑的研發(fā)奠定基礎，今后將繼續(xù)探索該基因在病毒致病機制中的作用以及gp2蛋白的分子作用模式，深入分析gp2基因的功能，為病毒致病機制的研究提供科學依據。