蔣亞君，王召陽，崔 帥，王 洋，鑫 婷，郭曉宇 ，劉雪婷，陳世鈺，房立春，朱鴻飛，賈 紅

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100193 ； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510630 ；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一種急性、熱性、高度傳染性疾病，可導(dǎo)致患豬出現(xiàn)高熱、出血、共濟(jì)失調(diào)、嚴(yán)重抑郁等癥狀[1]，高毒力毒株對家豬的致死率可達(dá)100%。由于目前缺乏有效的商業(yè)疫苗和特異性療法，該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

ASFV是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的成員，為直徑約200 nm的大型包囊病毒，基因組由170～193 kb的雙鏈DNA組成，包含超過150多個(gè)開放閱讀框，可編碼54個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和一些非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。A104R蛋白(pA104R)位于病毒核仁，主要出現(xiàn)于感染后期，是ASFV主要DNA結(jié)合蛋白之一，其結(jié)合活性穩(wěn)定，結(jié)合位點(diǎn)的大小為14～16 nt，蛋白表達(dá)可在感染后16 h達(dá)到最大峰值[3]。研究顯示，pA104R參與病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和基因組包裝，抗體反應(yīng)性好，是研究類核形成和基因組組裝過程的理想靶點(diǎn)，也可作為ASFV疫苗研究的重要靶標(biāo)蛋白[4-6]。

本研究通過基因合成獲得ASFV的A104R基因，將其連接至pET-28a(+)載體，成功構(gòu)建pET-28a-A104R原核表達(dá)系統(tǒng)，并制備了反應(yīng)性和免疫原性良好的多克隆抗體，以期為進(jìn)一步研究pA104R的生物學(xué)功能及ASFV疫苗和診斷試劑的開發(fā)提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pET-28a(+)載體，購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；pMDTM18-T載體、EcoR I、XhoI限制性內(nèi)切酶，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；T4連接酶，購自New England Biolabs (Beijing), lnc公司；2×Phanta Max Master Mix和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，均購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(26616)和BCA蛋白定量試劑盒，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DNA Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，均購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)誘導(dǎo)劑和TanonTMHigh-sig ECL Western Blotting Substrate(ECL發(fā)光液)，均購自上海天能科技有限公司；KPL SureBlueTMTMB Microwell Peroxidase Substrate(TMB顯色液)，購自北京西美杰科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記羊抗豬IgG抗體，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜，購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni親和層析柱，購自通用電氣(GE)公司。ASF陽性血清，由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心三級(jí)實(shí)驗(yàn)室滅活后申請傳出。

1.2 主要儀器 超聲破碎儀，北京德泉興商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；AKTA purifier蛋白純化儀，格來賽生命科技(上海)有限公司產(chǎn)品；AB SCIEX MALDI TOF-TOFTM5800 Analyzer質(zhì)譜分析儀，上海SCIEX分析儀器貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：北京百善SCXK(京)2021-0006。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1A104R基因合成 根據(jù)GenBank中ASFV Georgia 2007/1的A104R基因參考序列(GenBank 登錄號(hào)：MN393476.1)，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因合成，基因全長315 bp，理論編碼蛋白大小為11.6 kDa。

1.4.2 pA104R序列生物信息學(xué)分析 根據(jù) ASFV 參考蛋白序列(GenBank 登錄號(hào)：QIE06827.1)，利用蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測軟件ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)、蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測軟件SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、蛋白質(zhì)抗原決定簇預(yù)測軟件Predicting Antigenic Peptides (http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl) 、蛋白質(zhì)核定位信號(hào)預(yù)測軟件cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)等在線軟件對pA104R進(jìn)行生物信息學(xué)分析[7]。

1.4.3 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建 依據(jù)A104R基因序列，采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，并在上、下游引物中分別引入EcoR Ⅰ和XhoⅠ 酶切位點(diǎn)及其對應(yīng)的保護(hù)性堿基，引物序列為：上游引物 ASFV-A104R-F:5′-CCGGAATTCATGTCGACAAAAAAA-AAGCC-3′(EcoR Ⅰ);下游引物ASFV-A104R-R:5′-CCGCTCGAGGTTTAACATATCATGGACAGGTT-3′(XhoⅠ)；引物由金唯智生物科技有限公司合成。將合成基因連接至pMD18T載體，并以此為模板，利用上述引物通過PCR擴(kuò)增ASFVA104R基因片段，用膠回收試劑盒回收目的片段，將膠回收產(chǎn)物與pET-28a(+)載體DNA分別進(jìn)行EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后經(jīng)T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，次日挑取單菌落擴(kuò)增，送金唯智生物科技有限公司測序。將測序正確的重組菌命名為pET-28a-A104R/BL21，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.4.4 重組pA104R(rA104R)誘導(dǎo)條件優(yōu)化及可溶性分析 將活化后的重組菌(1∶100)接種于LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(1 mmol/L)于37 ℃振蕩誘導(dǎo)表達(dá)，并在培養(yǎng)后每2 h收集1 mL菌液制樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白表達(dá)情況，取表達(dá)量較高時(shí)間點(diǎn)的菌液超聲破碎，離心后分別收集沉淀和上清，對表達(dá)產(chǎn)物的可溶性進(jìn)行分析。

1.4.5 rA104R重組蛋白純化和Western blotting(WB)鑒定 重組菌活化、大量誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，冰浴中超聲破碎后收集上清并過濾，參考鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)(Ni-NTA)說明書進(jìn)行純化，純化的重組蛋白命名為rA104R。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。

取純化的rA104R進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂乳37 ℃封閉2 h，以ASF陽性血清(1∶100)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG(1∶5 000)為二抗分別進(jìn)行孵育，ECL發(fā)光液顯色。

1.4.6 rA104R液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析 將rA104R制樣后進(jìn)行SDS-PAGE，切取目的條帶，參照參考文獻(xiàn)[8]處理樣品，制備好的樣品經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDAI TOF-MS)分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用GPS Explorer(V3.6)和MASCOT(2.3)進(jìn)行搜索分析。

1.4.7 鼠源抗rA104R多克隆抗體制備 取純化后的rA104R 50 μg與等量弗氏完全佐劑混勻乳化后，采用腹部皮下多點(diǎn)注射的方法免疫小鼠，第2周和第4周以相同劑量的rA104R與弗氏不完全佐劑混勻乳化后加強(qiáng)免疫，三免1周后采血，收集血清。

1.4.8 鼠源抗rA104R多克隆抗體WB鑒定 操作同1.4.5，以免疫小鼠血清(1∶1 000)為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗，ECL發(fā)光液顯色。

1.4.9 鼠源抗rA104R多克隆抗體效價(jià)檢測 采用方陣滴定法將純化的rA104R倍比稀釋后包被酶標(biāo)板，將制備的多克隆抗體進(jìn)行2倍倍比稀釋作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗，經(jīng)TMB避光顯色20 min，2 mol/L H2SO4終止后測定OD450 nm處吸光值。

2 結(jié)果

2.1 pA104R序列生物信息學(xué)分析 利用1.4.2中在線軟件進(jìn)行預(yù)測，ExPASy預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白氨基酸為104個(gè)，分子量為11 608.74，理論等電點(diǎn)為10.22，不穩(wěn)定指數(shù)為33.41，總平均親水性為-0.435。如圖1所示，pA104R存在信號(hào)肽的可能性為0.000 6；pA104R有5個(gè)抗原決定簇；軟件cNLS Mapper分析結(jié)果如圖2所示，該蛋白具有9個(gè)核定位信號(hào)(NLS)基團(tuán)，其Cut-off值分別為3.7、2.3、2.7、2.7、2.6、3.7、2.5、2.6、2.9。

圖1 pA104R信號(hào)肽預(yù)測

圖2 pA104R核定位信號(hào)預(yù)測

2.2 原核表達(dá)載體的雙酶切鑒定 測序正確的重組菌提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，如圖3所示，出現(xiàn)預(yù)期大小的2個(gè)條帶，分別為5 000 bp和315 bp，表明構(gòu)建的pET-28a-A104R重組質(zhì)粒正確。

圖3 重組質(zhì)粒pET-28a-A104R雙酶切鑒定

2.3 rA104R誘導(dǎo)條件優(yōu)化及可溶性分析 根據(jù)1.4.4方法進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示，pET-28a-A104R/BL21在37 ℃誘導(dǎo)8 h后表達(dá)量最高，在上清和沉淀中均有蛋白表達(dá)，表明該蛋白呈現(xiàn)可溶性和包涵體2種表達(dá)形式。

圖4 rA104R的誘導(dǎo)表達(dá)(A)和可溶性分析(B)

2.4 rA104R純化和WB鑒定 純化的rA104R經(jīng)BCA定量檢測，濃度為0.371 mg/mL，隨后進(jìn)行SDS-PAGE分析和WB鑒定。SDS-PAGE結(jié)果如圖5A所示，出現(xiàn)較為單一的目的條帶，大小約為16 kDa，與預(yù)期結(jié)果一致；WB結(jié)果如圖 5B所示，rA104R可與ASF陽性血清反應(yīng)，反應(yīng)原性良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 純化rA104R的SDS-PAGE分析(A)和WB鑒定(B)

2.5 rA104R的LC-MS分析 將獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Proteome Discoverery軟件、Mascot搜索引擎進(jìn)行本地化數(shù)據(jù)庫檢索，如圖6所示，肽段QELYSLVAADTQLINKA、IFTSQQK、IIQNALK、HNQEVIIPPGIKFTVVTVK、QGHNPATCEPIQIK均與目標(biāo)蛋白片段氨基酸序列匹配(紅色字母)，其氨基酸序列匹配覆蓋度為59%，表明rA104R表達(dá)正確。

圖6 rA104R的氨基酸序列匹配

2.6 鼠源抗rA104R多克隆抗體的WB鑒定 rA104R經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，以制備好的多克隆抗體為一抗，進(jìn)行WB鑒定，結(jié)果如圖7所示，出現(xiàn)單一目標(biāo)條帶，表明該多克隆抗體可特異性結(jié)合rA104R。

圖7 鼠源抗rA104R多克隆抗體的WB鑒定

2.7 鼠源抗rA104R多克隆抗體效價(jià)檢測 經(jīng)間接ELISA方法檢測分析，rA104R的最佳包被濃度為2 μg/mL；根據(jù)免疫血清與陰性血清比值(P/N)分析，鼠源抗rA104R多克隆抗體效價(jià)大于2 048 000(圖8)，表明純化的rA104R具有良好的免疫原性。

圖8 鼠源抗rA104R多克隆抗體效價(jià)檢測

3 討論

ASF可感染所有品種、年齡的野豬和家豬，可通過直接接觸感染動(dòng)物或間接接觸污染物、感染的豬肉產(chǎn)品及軟蜱等媒介進(jìn)行傳播，高毒力毒株對家豬致死率可達(dá)100%，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大影響[9-11]。目前針對ASF尚無獲得批準(zhǔn)的疫苗和藥物，僅依靠早期檢測、嚴(yán)格的生物安全措施以及動(dòng)物撲殺等方式進(jìn)行防控。

ASFV是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的成員，可編碼150～167種蛋白，這些病毒蛋白參與病毒核苷酸代謝、轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)以及宿主免疫調(diào)節(jié)等眾多功能[12-13]，但很多的蛋白功能還未知。pA104R是在病毒復(fù)制晚期表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白，存在于病毒顆粒的類核中，與DNA的結(jié)合可能會(huì)產(chǎn)生拓?fù)鋸埩?，與P1192R結(jié)合時(shí)可展示出DNA超螺旋活性[5]。研究表明，經(jīng)siRNA敲除ASFV-Ba71V 株的A104R基因后，病毒復(fù)制子減少、基因拷貝數(shù)降低、ASFV編碼的p72基因的mRNA水平也降低，表明A104R基因在病毒復(fù)制和基因表達(dá)中具有重要作用[5,14]。在慢性感染的無癥狀動(dòng)物中，研究人員也檢測到較高的A104R抗體反應(yīng)，表明該蛋白有望用于疫苗及檢測方法的開發(fā)[15]。

原核表達(dá)系統(tǒng)制備抗原的方法簡單高效，應(yīng)用成熟，且有助于提高抗原純度和濃度，原核表達(dá)產(chǎn)物制備的抗體也具有較好的特異性和反應(yīng)活性[16]，本研究利用生物信息學(xué)分析，預(yù)測pA104R理化性質(zhì)、信號(hào)肽信息、核定位信號(hào)等信息后，將A104R基因連接至pET-28a(+)載體進(jìn)行原核表達(dá)，成功獲得rA104R，并制備了鼠源抗rA104R多克隆抗體。為更進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白的正確表達(dá)，本研究采用了具有強(qiáng)分離能力、高靈敏性、選擇性和準(zhǔn)確性的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[17]對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，rA104R的多個(gè)多肽與目標(biāo)片段氨基酸序列匹配，表明rA104R正確表達(dá)。純化的rA104R濃度為0.371 mg/mL，蛋白表達(dá)量不高，可能與蛋白純化方式有關(guān)，也可能與A104R基因轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。WB試驗(yàn)證明制備的rA104R可與ASF陽性血清發(fā)生反應(yīng)，表明其反應(yīng)性良好，可為后續(xù)ASFV診斷方法開發(fā)提供生物材料。本研究中考慮到小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更易獲得，且經(jīng)小鼠制備的多克隆抗體所需抗原量小、周期短、抗體滴度可滿足單克隆抗體制備、間接免疫熒光等試驗(yàn)的需要，因此選擇BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。本研究制備的鼠源rA104R多克隆抗體效價(jià)大于2 048 000，具有較好的免疫原性，可用于下一步試驗(yàn)。由此可見，本研究制備的rA104R及其多克隆抗體可用于蛋白生物學(xué)功能研究、ASFV相關(guān)免疫保護(hù)機(jī)制研究以及ASFV相關(guān)診斷方法的開發(fā)。