洪慧頤，楊春燚，王維新，張 迪，林德貴

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

犬貓真菌性皮膚病由皮膚癬菌侵襲毛發(fā)和皮膚角質(zhì)層引起，可導(dǎo)致動物出現(xiàn)不同程度的瘙癢、皮屑、紅疹、斑塊狀脫毛等臨床癥狀，其中犬小孢子菌是小動物臨床常見的皮膚癬菌[1-2]。臨床中常用的抗真菌藥主要有效成分包括特比萘芬、伊曲康唑、酮康唑等，但隨著藥物的廣泛使用，真菌的耐藥性問題也隨之而生[2-3]。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)臭氧化油對于皮膚癬菌具有良好的抗菌、殺菌效果[4-10]，臭氧能穿透真菌的細胞壁，進入細胞質(zhì)并破壞細胞功能，達到殺滅真菌的作用。也有研究表明，臭氧能通過抑制皮膚癬菌的產(chǎn)孢能力、增加菌絲營養(yǎng)物質(zhì)的漏出和降低水解酶的活性，達到抑制和殺滅真菌的效果[8-9]。而動物機體具有良好的抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對臭氧的強氧化性，外用醫(yī)療臭氧可在不損害機體的情況下達到殺滅真菌、促進感染性創(chuàng)面修復(fù)的功效[11-14]。因此本試驗選用商品化人用臭氧化油產(chǎn)品，研究其對犬小孢子菌感染的治療效果，探討臭氧療法應(yīng)用于犬貓真菌性皮膚病的醫(yī)療價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級豚鼠，體重200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016—0011。

1.2 試驗菌種 犬小孢子菌株，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院檢驗科臨床分離所得，根據(jù)患病動物的臨床表現(xiàn)、染色鏡檢、真菌培養(yǎng)以及測序結(jié)果，鑒定為犬小孢子菌。

1.3 試驗試劑及藥品 沙氏葡萄糖瓊脂(Sabouraud dextrose agar,SDA)培養(yǎng)基(Solarbio)；RPMI-1640液體培養(yǎng)基(Gibco)；乳酸棉酚藍(安徽雷根生物技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(Solarbio)；98%伊曲康唑粉劑(上海麥克林生化科技有限公司)。快氧TM臭氧化油抗菌劑(OZONE OIL antibacterial liquid，臭氧含量為25 mg/mL)(北京偉器天成醫(yī)藥科技有限公司)；復(fù)方伊曲康唑軟膏“霉菌凈”(天津市保靈動物保健品有限公司)。

1.4 試驗儀器 DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；SW-CJ-1B標準型凈化工作臺(蘇州精華設(shè)備廠)；BS202光學(xué)顯微鏡(重慶光學(xué)和電子設(shè)備有限公司)。

1.5 真菌培養(yǎng) 在無菌條件下，用接種環(huán)將犬小孢子菌臨床菌株接種于SDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)14 d備用。

1.6 體內(nèi)試驗

1.6.1 菌懸液的制備 使用轉(zhuǎn)純后培養(yǎng)14 d的真菌[15]。在無菌條件下，向無菌EP管中加入1～2 mL無菌生理鹽水，用玻片或刀片將培養(yǎng)物表面的菌絲和孢子刮至微量離心管中，在振蕩器上振蕩5 min后靜置10 min，過濾沉淀菌絲后用血球計數(shù)板計算大分生孢子的濃度，用RPMI-1640液體培養(yǎng)基將菌懸液濃度調(diào)整至104CFU/mL備用。

1.6.2 動物模型的建立 共11只豚鼠，用電動剃毛刀將豚鼠腰背部兩側(cè)剃毛，形成2個略大于2 cm×2 cm的脫毛區(qū)。用砂紙打磨脫毛區(qū)皮膚至滲血而不出血，形成2 cm×2 cm的滲血區(qū)。用槍頭吸取200 μL 104CFU/mL的菌懸液涂布于每一滲血區(qū)。接種后每天進行觀察，包括豚鼠的精神、食欲、接種區(qū)域的癥狀等。

1.6.3 鑒定感染成功 接種后第3天，觀察接種部位的癥狀，采樣接種于SDA培養(yǎng)基觀察菌落形態(tài)并進行染色鏡檢，確定為犬小孢子菌感染，則為造模成功。

1.6.4 用藥治療 確定造模成功后，在接種菌懸液第14天時，將11只豚鼠兩側(cè)感染部位，即共22個感染部位隨機分為3個組，即試驗組(n=8)、陽性對照組(n=8)和空白對照組(n=6)。試驗組使用快氧TM臭氧化油抗菌劑治療，陽性對照組使用復(fù)方伊曲康唑“霉菌凈”治療，每天用藥1次，連續(xù)用藥2周，空白對照組接種成功后不做任何處理。每周觀察記錄1次，包括接種部位的癥狀、真菌培養(yǎng)檢查等。豚鼠飼養(yǎng)于同一動物房內(nèi)，飼料均為同一公司提供的豚鼠專用糧，自由采食和飲水。

1.6.5 療效判斷標準 臨床上犬小孢子菌感染的癥狀包括發(fā)紅、丘疹、皮屑和角化等，對這4個主要癥狀用計分法分別進行4級評價，即0=無、1=輕、2=中、3=重，相加后得到總積分。在治療前和治療2周后進行評分。按照積分下降指數(shù)來對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

癥狀積分下降指數(shù)/%=(治療前總積分-治療后總積分)/治療前總積分×100%。

療效評價分為治愈、顯效、好轉(zhuǎn)和無效共4級判定。治愈：用藥后癥狀消失，癥狀積分下降指數(shù)為100%，采樣犬小孢子菌鏡檢、培養(yǎng)陰性；顯效：用藥后癥狀基本消失，癥狀積分下降指數(shù)>60%，采樣犬小孢子菌鏡檢、培養(yǎng)陰性；好轉(zhuǎn)：用藥后癥狀減輕，癥狀積分下降指數(shù)30%～60%，采樣犬小孢子菌鏡檢、培養(yǎng)陰性或陽性；無效：用藥后癥狀無改善，癥狀積分下降指數(shù)<30%，采樣犬小孢子菌鏡檢、培養(yǎng)陽性。經(jīng)療效判定后，將治愈病例、顯效病例和好轉(zhuǎn)病例計為有效病例，計算有效率。

有效率/%=(治愈病例數(shù)+顯效病例數(shù)+好轉(zhuǎn)病例數(shù))/治療總病例數(shù)×100%。

1.7 體外藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)發(fā)布的M38-A方案，選用微量液基稀釋法測定快氧TM臭氧化油抗菌劑和伊曲康唑?qū)θ℃咦泳淖钚∫志鷿舛?Minimum inhibitory concentration,MIC)，每種藥物重復(fù)測定3次。其中快氧TM臭氧化油抗菌劑的終濃度范圍為2.44～1 250 μg/mL，伊曲康唑的終濃度范圍為0.031 3～16 μg/mL。將肉眼觀察犬小孢子菌生長100%受抑制作為MIC終點判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)試驗 各組的癥狀積分下降指數(shù)見圖1，療效比較見表1。試驗組、陽性對照組、空白對照組的癥狀積分下降指數(shù)平均值分別為47.23%、72.89%、-17.93%，試驗組與陽性對照組、空白對照組之間均差異顯著(P<0.05)；有效率分別為87.5%、100%、0%。可見在療效方面，復(fù)方伊曲康唑“霉菌凈”優(yōu)于快氧TM臭氧化油抗菌劑。>

圖1 癥狀積分下降指數(shù)

表1 療效比較

在試驗過程中，用藥開始3～7 d，試驗組和陽性對照組均有部分病例出現(xiàn)發(fā)紅、瘙癢、丘疹等癥狀加重的現(xiàn)象，但用藥2周后均顯示好轉(zhuǎn)。兩組病例治療后犬小孢子菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。同時也觀察到，相較于陽性對照組(圖2)，試驗組部分前期癥狀較嚴重的豚鼠在治療期間有更嚴重的瘙癢、啃咬患部的現(xiàn)象，且患部顯得更為干燥(圖3)?？瞻讓φ战M部分病例癥狀輕微好轉(zhuǎn)，但主要表現(xiàn)為病癥惡化(圖4)。

圖2 復(fù)方伊曲康唑“霉菌凈”治療前后對比

圖3 快氧TM臭氧化油抗菌劑治療前后對比

圖4 空白對照組

2.2 體外藥敏試驗 體外藥敏試驗結(jié)果如表2所示，快氧TM臭氧化油抗菌劑對犬小孢子菌的MIC范圍為312.5～625.0 μg/mL，高于伊曲康唑的MIC范圍(0.5～2.0 μg/mL)。

表2 受試藥物對犬小孢子菌的最小抑菌濃度

3 討論

3.1 藥物不良反應(yīng) 魯建云等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在多次給藥試驗和過敏試驗中，基質(zhì)油(茶油)和臭氧化油均對豚鼠的皮膚具有輕微刺激性且對個別豚鼠輕度致敏，因此筆者認為在臨床應(yīng)用時控制臭氧化油的使用濃度和使用頻率，能有效避免其對皮膚的刺激性和過敏性，達到良好的治療效果。快氧TM臭氧化油抗菌劑是已應(yīng)用于治療人類感染性疾病的產(chǎn)品，有明顯療效且并未產(chǎn)生明顯不良反應(yīng)，考慮到豚鼠、犬貓皮膚與人類皮膚的結(jié)構(gòu)存在差異性，可能是由于本藥物臭氧濃度過高導(dǎo)致初始癥狀較嚴重的豚鼠出現(xiàn)更明顯瘙癢、啃咬患部、治療周期較長的現(xiàn)象。

3.2 本試驗的合理性分析 體內(nèi)試驗部分未設(shè)置陰性對照組，即用基質(zhì)油(茶油)治療，以觀察基質(zhì)油在治療過程中是否有所作用。有研究表明，茶油具有促進藥物經(jīng)皮吸收的作用，能在一定程度上緩解人類皮膚病癥狀[16]。Varol等選用橄欖油、氟康唑和臭氧化油進行對比治療試驗，結(jié)果顯示，橄欖油雖然有一定的抑菌效果，但效果遠不及臭氧化油[10]。故猜想本試驗中若設(shè)置茶油作為陰性對照組，其結(jié)果可能是茶油對犬小孢子菌感染有輕微治療效果，相較于空白對照組更好，但效果仍低于試驗組和陽性對照組。茶油主要還是作為臭氧化油的溶劑和透皮劑存在。

體外藥敏試驗部分，由于目前還沒有臭氧化油對犬小孢子菌的MIC測定標準，本試驗參考了Thomson等[7]和Geweely[9]的研究，采用微量液基稀釋法進行藥敏試驗。在試驗中觀察到快氧TM臭氧化油抗菌劑與液體培養(yǎng)基分離的現(xiàn)象，這可能與該產(chǎn)品本身的特性有關(guān)；且由于臭氧具有不穩(wěn)定性，可能在操作過程中分解而無法維持抑菌效果。因此猜想本藥敏試驗中，臭氧化油的抑菌作用可能是由于油劑覆蓋于液體表面創(chuàng)造了無氧環(huán)境，從而抑制真菌生長而得。故認為此方法所測定的臭氧化油MIC僅具有試驗參考意義。

對于未有明確測定標準的藥物與菌株，或者體外藥敏試驗結(jié)果不能反映體內(nèi)試驗結(jié)果的情況，李杰[15]認為可以通過瓊脂擴散法比較不同藥物的抑菌效果，能更為直觀地顯示藥物的抑菌能力與藥物間的差異，且結(jié)果與臨床更為貼切。所以后期再進行臭氧化油抗菌劑的體外藥敏試驗可考慮采用瓊脂擴散法。Geweely[9]用瓊脂稀釋法測得臭氧化橄欖油(Oleozone)對多種皮膚癬菌的MIC范圍為0.53～2.00 mg/mL，其中犬小孢子菌最敏感。

3.3 臭氧化油對真菌性皮膚病的治療作用 不同研究表明，臭氧化油用于治療兔子感染犬小孢子菌[5]、紅色毛癬菌和白色念珠菌導(dǎo)致的灰指甲病例[4]、小鼠感染犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌時[7]，均表現(xiàn)出抗真菌活性，可作為治療臨床皮膚癬菌感染的安全替代品。本試驗中，試驗組用藥后臨床癥狀有所好轉(zhuǎn)，真菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，即快氧臭氧化油抗菌劑能夠有效抑菌。對于感染犬小孢子菌的犬貓，癥狀較輕者可以考慮使用快氧臭氧化油抗菌劑治療；較嚴重的病例，宜先試用、觀察其是否存在不良反應(yīng)，或者調(diào)整臭氧化油的濃度后再投入使用。

此外，Varol等[10]研究指出臭氧化油的抗菌活性與其過氧化值(Peroxide value, PV)有關(guān)，而臭氧化的時間和酸堿度均能影響過氧化值。有研究表明，油劑的過氧化值越高，其抗菌、殺菌活性越好[6,10,17]。結(jié)合本試驗體外部分結(jié)果，筆者認為通過調(diào)整生產(chǎn)方式、油劑、臭氧含量、使用頻率、酸堿度和過氧化值等，臭氧化油有望成為一種新型的抗菌藥物應(yīng)用于犬貓真菌性皮膚病的治療。后期的試驗可評估不同濃度或酸堿度的臭氧化油對皮膚癬菌感染病例的治療效果，以開發(fā)適合犬貓使用的臭氧化油抗菌劑。