姬書會，郭世棟，蘇玉賢

(1.平頂山市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊，河南 平頂山 467000 ； 2.新鄉(xiāng)市動物疫病預(yù)防控制中心 ，河南 新鄉(xiāng) 453000 ； 3.平頂山市畜牧技術(shù)推廣站，河南 平頂山 467000)

沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科的重要致病菌屬，在人和動物的腸道細胞內(nèi)寄生，可引起動物腹瀉、人腸胃炎和食物中毒。沙門菌血清型繁多，國內(nèi)報道的有290多種[1]。絕大部分血清型對人類和畜禽有致病性，是一種重要的人獸共患病病原菌和食源性致病菌[2]。

雞源沙門菌病是某些致病性沙門菌引起的雞白痢病、雞副傷寒病和雞傷寒病的統(tǒng)稱，通常造成雛雞腹瀉、脫水，甚至死亡，成年雞呈慢性或隱性感染，長期攜帶病原菌，蛋雞產(chǎn)蛋性能下降。病雞和帶菌雞為主要傳染源，可以水平和垂直傳播，養(yǎng)雞場如果發(fā)生疫情很難完全凈化，嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展，同時也直接威脅公共衛(wèi)生安全。

目前，養(yǎng)雞場在加強生物安全、疫苗免疫防控的同時，使用抗生素成為預(yù)防和治療該病的臨床用藥主要手段。但是，由于抗生素的長期大量使用和不合理用藥，導(dǎo)致沙門菌株耐藥性越來越強，尤其是多重耐藥現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，動物成為耐藥菌的重要儲存庫[3]，給有效防治沙門菌病帶來很大困難。由于沙門菌血清型眾多，不同地區(qū)或者同一地區(qū)內(nèi)的流行菌株也存在差異[4]，因此，了解當?shù)仉u源沙門菌流行特點和耐藥性情況，對于有效防控雞沙門菌病具有重要指導(dǎo)意義。本試驗于2020年采集河南省平頂山和新鄉(xiāng)地區(qū)雞源病料進行細菌分離鑒定、血清型分析和耐藥性檢測，為今后雞源沙門菌病凈化、篩選臨床安全合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源和菌株 無菌采集河南省平頂山、新鄉(xiāng)35個規(guī)?；半u、肉雞場的疑似患沙門菌病的雞的雞蛋、肝臟、脾臟、肛拭子和腸道等器官組織樣品154份。大腸埃希菌(ATCC29922)和腸炎沙門菌標準株(CVCC3377)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、SS瓊脂培養(yǎng)基、沙門菌屬顯色培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌微量生化反應(yīng)管、沙門菌屬血清診斷試劑盒(60種)，均購自蘭州生物制品有限公司；DL2 000 DNA Marker、2×PCR Premix、細菌基因組DNA提取試劑盒，均購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；15種K-B藥敏紙片，包括大觀霉素(SPT)、氨芐西林(AMP)、環(huán)丙沙星(CIP)、呋喃唑酮(FUR)、阿米卡星(AN)、氟苯尼考(FLO)、鏈霉素(STR)、復(fù)方新諾明(SXT)、新霉素(NTL)、阿奇霉素(AZM)、多西環(huán)素(DOX)、左氧氟沙星(LEV)、慶大霉素(CN)、頭孢曲松(CTRX)、頭孢喹肟(CTX)，均購自杭州天河微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng) 參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》(GB 4789.4—2016)進行沙門菌的分離培養(yǎng)。每份稱取25 g樣品放入含225 mL BPW的無菌均質(zhì)袋，10 000 r/min離心1～2 min,(36±1)℃培養(yǎng)8～18 h。取上述樣品混合物1 mL接種于10 mL TTB增菌液，(42±1)℃培養(yǎng)18～24 h，同時，另取上述樣品混合物1 mL接種于10 mL SC增菌液，(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。然后，用接種環(huán)挑取增菌液分別接種于沙門菌屬顯色培養(yǎng)基和SS瓊脂平板，(36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h。觀察每個平板上的菌落特征。挑取沙門菌屬顯色培養(yǎng)基上紫色菌落和SS平板上的無色透明或黃色、有黑點的菌落進行純培養(yǎng)和細菌涂片，革蘭染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.4 生化鑒定 用生理鹽水將疑似菌落制備成滴度適當?shù)木鷳乙?，無菌接種于靛基質(zhì)(Indole)、pH 7.2尿素(URE)、硫化氫(H2S)、氰化鉀(KCN)、蔗糖(SAC)、葡萄糖(GLU)、甘露醇(MAN)、山梨醇(AG)、賴氨酸(Lys)和V-P試驗細菌微量生化反應(yīng)管，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄結(jié)果。結(jié)果判定依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》(GB 4789.4—2016)進行。

1.5 PCR鑒定 挑取待檢菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)6 h，備檢待用。使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取疑似沙門菌和對照菌株基因組DNA，并設(shè)大腸埃希菌(ATCC29922)為陰性對照和腸炎沙門菌標準株(CVCC3377)為陽性對照。根據(jù)GenBank(登錄號：JQ665438.1)發(fā)表的序列，針對沙門菌fimY基因設(shè)計1對引物，上游引物序列：5′-CGCCCAGCCATACGGATAACC-3′,下游引物序列：5′-TACCACGCAGGAAAGACACC-3′。引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，預(yù)期擴增片段大小427 bp。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×PCR Premix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并記錄。

1.6 血清型鑒定 分離菌株的血清型分群和定型鑒定根據(jù)GB 4789.4—2016標準采用玻片凝集試驗方法。待檢菌以1.2% LB瓊脂作為測定A～F、O、H抗原的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，用生理鹽水制備成2麥氏單位的菌懸液。取20 μL血清診斷試劑盒中的血清于潔凈玻片上，再挑取20 μL菌懸液與血清搖動混勻30 s，觀察凝集結(jié)果。同時，設(shè)生理鹽水為陰性對照試驗，觀察菌株是否發(fā)生自凝現(xiàn)象。1 min 內(nèi)凝集者判為陽性，均勻渾濁或清亮者為陰性。根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H抗原鑒定結(jié)果，查閱沙門菌抗原表，進行被檢菌株血清型分群和定型。

1.7 藥敏試驗 藥敏質(zhì)控菌株為腸炎沙門菌標準株CVCC3377。采用世界衛(wèi)生組織(WHO)提供的藥敏紙片瓊脂擴散法(Kirby-Baue)測定48株分離菌對15種常見抗菌藥的耐藥性，測量抑菌圈直徑大小，依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)標準判定15種抗菌藥的敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)結(jié)果，根據(jù)藥敏試驗判定耐藥表型。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng) (36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h后，沙門菌屬顯色培養(yǎng)基的菌落呈現(xiàn)為大小一致、邊緣整齊的紫色菌落，SS瓊脂平板上菌落呈現(xiàn)圓形、黑色金屬光澤，有些為中間黑色菌落，周圍培養(yǎng)基沒有變化。革蘭染色為陰性，鏡檢可見短桿狀菌，兩端鈍圓，單個、成對或成叢存在。共有48株初步判定為疑似沙門菌菌株。

2.2 生化鑒定 生化試驗鑒定結(jié)果顯示，48株分離菌株均能分解甘露醇、葡萄糖和山梨醇，不發(fā)酵蔗糖，賴氨酸、硫化氫試驗陽性，靛基質(zhì)、尿素、V-P試驗陰性，依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》(GB 4789.4—2016)符合典型的沙門菌特征。

2.3 PCR鑒定 部分分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果見圖1。凝膠電泳結(jié)果顯示，以沙門菌fimY基因引物對48株分離菌株進行PCR擴增鑒定，均能擴增出大小約為427 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小一致，陰性對照無條帶。對來自平頂山、新鄉(xiāng)不同縣市的樣品和鑒定結(jié)果統(tǒng)計，48株沙門菌中平頂山有29株(郟縣13株、葉縣9株、舞鋼7株)，新鄉(xiāng)有19株(延津11株、原陽8株)。結(jié)合生化鑒定結(jié)果，本次沙門菌檢出率為31.17%，表明平頂山和新鄉(xiāng)均有不同程度雞源沙門菌感染。

圖1 部分沙門菌分離菌株的PCR鑒定

2.4 血清型鑒定 采用玻片凝集法對48株沙門菌進行血清型分型試驗，結(jié)果顯示，共鑒定出44株沙門菌的血清型，占沙門菌分離株的91.67%(44/48)，分屬3個大群5種血清型，包括19株雞白痢沙門菌(39.58%)、13株腸炎沙門菌(27.08%)、7株鼠傷寒沙門菌(14.58%)、3株甲型副傷寒沙門菌(6.25%)和2株乙型副傷寒沙門菌(4.17%)，其余4株未確定出血清型。優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌。平頂山和新鄉(xiāng)地區(qū)血清型分布見表1。

表1 平頂山和新鄉(xiāng)地區(qū)雞源沙門菌血清型分布

2.5 藥敏試驗 對48株雞源沙門菌進行15種抗菌藥耐藥性檢測，結(jié)果見表2、表3。分離菌株對氨芐西林耐藥率最高，為95.83%，其次，對呋喃唑酮(66.67%)、大觀霉素(64.58%)、鏈霉素(62.50%)也具有較高的耐藥性；對氟苯尼考(22.92%)、環(huán)丙沙星(12.50%)、復(fù)方新諾明(12.50%)、左氧氟沙星(10.42%)耐藥率相對較低；對頭孢喹肟(8.33%)、頭孢曲松(8.33%)、慶大霉素(6.25%)、阿米卡星(6.25%)、多西環(huán)素(4.17%)、阿奇霉素(4.17%)和新霉素(2.08%)比較敏感，耐藥率均低于10.00%。

表2 分離菌株藥敏試驗

表3 48株沙門菌分離株血清型抗菌藥耐藥譜

在48株雞源沙門菌分離株中，有 2 株(4.17%)不耐藥，對所有試驗藥物均表現(xiàn)敏感，9株對2種抗菌藥耐藥，其余37 株則表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象(耐 3 種及 3 種以上抗菌藥)，多重耐藥率為77.08%。耐藥模式較多，以4重耐藥最多，有15 株，占31.25%(15/48)；最多耐受8種抗菌藥物，有1株，占2.08%(1/48)。

3 討論

本試驗采用傳統(tǒng)細菌分離鑒定和PCR方法對來自平頂山、新鄉(xiāng)的154份雞源樣品進行分離鑒定，共分離鑒定出雞源沙門菌48株，檢出率為31.17%，明顯高于錢明珠等[5]對河南省部分雞沙門菌流行病調(diào)查報道的分離率(27.97%)和楊瑞等[1]在2019—2020 年對河北地區(qū)雞源沙門菌流行病學調(diào)查報道的分離率(25.51%)。本次調(diào)查結(jié)果表明，被調(diào)查養(yǎng)雞場雞源沙門菌分布較廣，污染較重，建議引起重視，加強疫病防控，減少污染面。

本試驗血清學分型結(jié)果顯示，共鑒定出5種血清型，其優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門菌(39.58%)和腸炎沙門菌(27.08%)。多地學者研究結(jié)果顯示[6-8]，這2種血清型感染宿主范圍廣，是我國養(yǎng)雞場常見的流行菌株。作為腸桿菌科沙門菌屬成員的雞白痢沙門菌是嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的常見致病菌，可以引起雞敗血癥、雞白痢病。腸炎沙門菌是造成動物感染沙門菌和引起人類食物細菌性中毒的重要病原菌之一。此外，本試驗還檢出鼠傷寒沙門菌(14.58%)、甲型副傷寒沙門菌(6.25%)和乙型副傷寒沙門菌(4.17%)。表明上述血清型不同程度存在于兩地區(qū)雞群和飼養(yǎng)環(huán)境中，因此，需要以本地流行血清型為重點加強監(jiān)測。

本試驗對48株分離菌進行了15種抗菌藥耐藥性檢測，結(jié)果顯示，分離菌對氨芐西林、呋喃唑酮、大觀霉素和鏈霉素具有較高的耐藥性，耐藥率高于60.00%，與宋艷等[9]報道基本一致，這與當?shù)仞B(yǎng)雞場長期不規(guī)范使用抗菌藥有關(guān)，導(dǎo)致雞沙門菌耐藥性增強；盡管分離菌對頭孢喹肟、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、多西環(huán)素、阿奇霉素和新霉素比較敏感，但是部分抗菌藥的中敏率偏高，比如新霉素、頭孢喹肟、頭孢曲松的中敏率分別為60.42%、43.75%和41.67%，說明這些藥物在臨床一線用藥中也存在不合理使用現(xiàn)象，應(yīng)引起關(guān)注和跟蹤監(jiān)測。本試驗中48株雞源沙門菌多重耐藥率為77.08%，多重耐藥譜較廣，以4重耐藥最多，最多耐受8種抗菌藥物，耐藥譜型較多。

本試驗結(jié)果表明，平頂山和新鄉(xiāng)地區(qū)雞源沙門菌耐藥性比較嚴重，耐藥表型多樣化，提示在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)臨床治療和預(yù)防過程中應(yīng)科學合理使用抗菌藥，強化流行病學調(diào)查和耐藥性監(jiān)測，聯(lián)合用藥，輪換用藥，使用抗菌藥替代品，避免耐藥性進一步嚴重。