李 哲，楊寒淞，曹應(yīng)葵，范青飛，李玉葉

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，云南 昆明 650032；2.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，熱帶植物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐臘 666303）

我國是抗生素使用大國，世衛(wèi)組織一項(xiàng)研究表明，我國住院病人抗生素使用率高達(dá)80.00%［1］，中國細(xì)菌耐藥率高達(dá)45.00%，遠(yuǎn)高于歐美國家，而抗生素濫用帶給人體的傷害也是不可估量的［2］。鑒于全國各地如此嚴(yán)重的抗生素耐藥狀況，并且抗生素存在多重耐藥以及交叉耐藥的情況下，亟需尋找不同靶點(diǎn)、不同作用機(jī)制的抗菌藥物。大量研究表明中藥的天然產(chǎn)物具有良好的抗菌活性，并可以逆轉(zhuǎn)耐藥，因此我們應(yīng)充分利用中醫(yī)藥寶藏，研究具有抗菌作用的中藥及提取物，為新藥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 淋球菌ATCC-49226 來源于云南省疾病預(yù)防與控制中心；金黃色葡萄球菌ATCC-12228、光滑念珠菌ATCC-66032、白念珠菌ATCC-14053 來源于昆明醫(yī)科大學(xué)；新型隱球菌ATCC-32045 來源于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.1.2 主要儀器、設(shè)備 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific 公司；比濁儀、麥?zhǔn)瞎苜徸灾袊楹５蠣柹锕こ逃邢薰?；移液器購自美國Eppendorf 公司；生物安全柜購自美國Labconco 公司。

1.1.3 中藥提取物及其制備

1.1.3.1 提取物 ① 乙醇提取物：紫草素、桂皮醛、巴西蘇木素、竹葉椒、貴州花椒、刺異葉椒、異葉花椒、毛刺花椒、菱葉花椒、滇丹參葉。以上由中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園提供。② 其他提取物：云南紅豆杉、清明花、白鉤藤、兩面針、定心藤、青牛膽、傣百解、黑皮跌打、鴉膽子，以上由中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園提供。③ 茶提取物：茶黃素類、茶褐素類、茶紅素類、咖啡堿類由云南漢德生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3.2 中藥提取物制備方法 ① 乙醇提取物：分別將10 種中藥（紫草、桂皮、蘇木、竹葉椒、貴州花椒、刺異葉椒、異葉花椒、毛刺花椒、菱葉花椒、滇丹參葉）粉碎成粗粉，用95 %的乙醇浸泡3 次，過濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓，回收溶劑，得到提取物。上述提取物以無菌生理鹽水 （含5%二甲基亞砜助溶劑） 配成濃度為 1 mg/ml 的溶液作K-B紙片法初篩用。② 其他提取物：分別將9 種中藥（云南紅豆杉、清明花、白鉤藤、兩面針、定心藤、青牛膽、傣百解、黑皮跌打、鴉膽子）粉碎后，用甲醇提取，然后將甲醇提取物溶解在甲醇和水（9：1）的混合溶劑中，用石油醚萃取，得到石油醚提取物。甲醇和水層脫溶后，加水溶解，然后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，上述中藥就得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水四個部位提取物。上述提取物用無菌生理鹽水（含5%二甲基亞砜助溶劑）配成濃度為 1 mg/ml 的溶液作K-B 紙片法初篩用。③ 茶提取物：將普洱茶粉碎成粗粉，加入蒸餾水浸提回流，濾液進(jìn)行一次萃取，得到的有機(jī)相加入氯仿萃取、濃縮，得到咖啡堿類；將水相進(jìn)行二次萃取，得到的有機(jī)相加入正丁醇萃取、濃縮，得到茶紅素類、茶黃素類；將二次萃取得到的水相進(jìn)行三次萃取，得到的水相濃縮蒸干，得到茶褐素類。上述提取物用無菌生理鹽水（含5%二甲基亞砜助溶劑）配成濃度為 1 mg/ml 的溶液作K-B 紙片法初篩用。

1.1.4 培養(yǎng)基 沙氏培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、瓊脂粉購于北京酷來搏科技有限公司；淋球菌GC 培養(yǎng)基及Isoviatale X 增菌劑、抑菌劑購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；10%脫纖維新鮮羊血購自南京便診生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 K-B 紙片法抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 制備菌懸液 從固體培養(yǎng)基中挑取菌落于液體培養(yǎng)基，置于35℃搖床250 r/min 搖速下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心去上清，加入無菌生理鹽水混勻，校正細(xì)菌懸液濃度至1×108個/ml。

1.2.1.2 菌液接種 每個平板各加載菌液250 μl，用無菌棉拭子涂板，用鑷子加載直徑為6 mm 的無菌濾紙片。用移液器吸取10 μl 中藥提取物分別滴入2個濾紙片的正中心，生理鹽水組為空白對照，細(xì)菌用氨芐西林為陽性對照，真菌用氟康唑作陽性對照。

1.2.1.3 觀察結(jié)果 在37℃培養(yǎng)箱孵育（20 ～24）h，讀取抑菌圈的直徑，抑菌圈直徑包括紙片的直徑。

1.2.2 肉湯稀釋法檢測最小抑菌濃度（MIC） 通過K-B紙片法篩選出對上述有較強(qiáng)抗菌活性的中藥提取物后，根據(jù)CCLSI M27-A3 用肉湯稀釋法測定植物提取物對除淋球菌外其他幾種菌的最小抑菌濃度。

1.2.2.1 待測樣品溶液配制 取100 mg/ml 中藥提取物儲存液，用液體培養(yǎng)基稀釋成8 mg/ml；氨芐西林、氟康唑均用培養(yǎng)基稀釋為8 mg/ml（DMSO 占最終體積的濃度≤2%）。

1.2.2.2 菌懸液制備 取培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)（2-3）代的純菌落制成菌懸液，濃度調(diào)整至1×105-2×105CFU/ml。在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)出真菌濃度，濃度調(diào)整為2×106-5×106CFU/ml。

1.2.2.3 倍比稀釋藥物濃度 取96 孔板，在每行（1-12）號孔分別加入100 μl 液體培養(yǎng)基，在1 號孔加入待測樣品溶液100 μl，混勻后取100 μl 加入2 號孔，2 號孔混勻后取100 μl 加入3 號孔…直至10 號孔。在（1-11）號孔分別加入80 μl 配置好的菌懸液，再加20 μl Alamar Blue。第11 號孔只加菌懸液，第12 號孔只加培養(yǎng)基。

1.2.2.4 結(jié)果判讀 將96 孔板置于37℃恒溫箱孵育（16-48） h，觀察孔里顏色變化，當(dāng)孔中有菌生長時，Alamar Blue 會由藍(lán)色變?yōu)榧t色，因此最小抑菌濃度應(yīng)為最后一個顏色為藍(lán)色孔的濃度。

1.3 瓊脂稀釋法檢測淋球菌MIC 通過K-B 紙片法篩選出對淋球菌有較強(qiáng)抗菌活性的中藥提取物后，再通過瓊脂稀釋法檢測提取物對淋球菌的MIC。提取物用無菌GC 培養(yǎng)基稀釋，每種提取物的濃度梯度設(shè)置為32 mg/ml、16 mg/ml、8 mg/ml……0.25 mg/ml， 在每個平皿中加入1×107CFU/ml 的細(xì)菌10 μl，試驗(yàn)設(shè)空白對照。37℃培養(yǎng)24h，分別轉(zhuǎn)種GC 瓊脂平板培養(yǎng)基，24 小時后無細(xì)菌生長的平皿則為藥物最低濃度。

2 結(jié)果

2.1 K-B紙片法 檢測50種中藥提取物的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)紫草素、桂皮醛在1mg/ml 濃度下有抑菌活性，其余提取物無抑菌活性（見表1）。判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會 M27-A3 方案［3］。

表1 50 種中藥提取物抗菌活性

注：T 表示總提取物，P 表示石油醚萃取物，E 表示乙酸乙酯提取物，B 表示正丁醇提取物，W 表示水提物

2.2 肉湯稀釋法測MIC 用肉湯倍比稀釋法測紫草素和桂皮醛對金黃色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌的MIC 值，結(jié)果為：紫草素對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為7.81 μg/ml，對白念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌最小抑菌濃度均為15.625 μg/ml。桂皮醛對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為160 μg/ml，對白念珠菌、光滑念珠菌最小抑菌濃度為250 μg/ml，對新型隱球菌無抑制作用。

2.3 瓊脂稀釋法測MIC 用瓊脂稀釋法測紫草素對淋球菌的最小抑菌濃度為1mg/ml，桂皮醛對淋球菌無抗菌作用。

3 討論

近年來，隨著各類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌、真菌對常用抗生素的耐藥性也逐年攀升。我們課題組已發(fā)現(xiàn)云南地區(qū)淋球菌耐藥現(xiàn)狀為：環(huán)丙沙星耐藥率100%、四環(huán)素耐藥率89.9%、青霉素耐藥率89.3%、阿奇霉素耐藥率14.5%，其中多重耐藥株占比73.6%［4］。因此，在現(xiàn)有抗生素對耐藥菌的治療效果不佳，且研發(fā)新型抗菌藥物難度大、周期長的背景下，加強(qiáng)對中藥抗菌活性的研究和開發(fā)，對解決細(xì)菌耐藥問題具有重要意義。中藥是中華民族的瑰寶，目前，已有大量研究證實(shí)中藥單體、復(fù)方或中藥提取物中的活性成分具有明顯抗菌作用，并已廣泛應(yīng)用于臨床。已被證實(shí)的中草藥抗耐藥菌的作用機(jī)制主要包括消除耐藥質(zhì)粒、影響細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、抑制細(xì)菌體內(nèi)酶的活性、影響蛋白質(zhì)和核酸的合成、抑制耐藥菌外排泵等［5］。中藥配伍也由于其通過多靶點(diǎn)、多途徑抗菌而具有毒性低、不易誘導(dǎo)耐藥等特點(diǎn)。

紫草是紫草科紫草屬植物，在我國有悠久的藥用歷史，有涼血活血、清熱解毒等功效，民間將其外用于外生殖器部位來治療感染。紫草中脂溶性的醌類化合物為其主要活性成分，包括紫草素類及其二聚體、紫草呋喃類、苯醌類等混源萜類化合物。紫草素是1，4－萘醌的烷基化衍生物，化學(xué)式為C16H16O5。近年來隨著對紫草研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)紫草素具有抗菌、抗炎［6］、抗腫瘤活性［7］，還有抗氧化損傷［8］以及抗病毒［9］作用。本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)紫草素對金黃色葡萄球菌、淋球菌、白念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌均具有抑制作用。先前的研究表明紫草素通過改變白念珠菌的細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+外流，從而發(fā)揮抗白念珠菌的作用。也有研究者發(fā)現(xiàn)紫草素可以改變耐甲氧西林金黃色葡萄球菌肽聚糖的親和力、細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，從而抑制其生長［10］。桂皮醛又名肉桂醛、苯丙烯醛、桂醛，來源于天然植物桂枝或肉桂中，是從肉桂樹中提取的烯醛類有機(jī)化合物，其化學(xué)分子式 C9H8O。國內(nèi)外對桂皮醛的大量藥理研究表明，其具有抗菌、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降糖、抗肥胖等多種藥理活性［11］。本次研究證明了桂皮醛對金黃色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌有抑制作用，有研究者發(fā)現(xiàn)桂皮醛直接作用于真菌細(xì)胞膜表面的中藥成分麥角甾醇，改變細(xì)胞的膜完整性、流動性、細(xì)胞活力等，從而抑制真菌生長，除此之外，還發(fā)現(xiàn)桂皮醛對耐氟康唑的白念珠菌仍有抑制作用［12］。有研究表明亞抑菌濃度的桂皮醛能夠抑制金黃色葡萄球菌的α-溶血素、腸毒素A 和B 的產(chǎn)量，從而抑制金黃色葡萄球菌的生長［13］。本研究中傣百解、定心藤、白鉤藤、黑皮跌打等藥物是我國傣族醫(yī)藥的常用藥材，在本次研究中并未發(fā)現(xiàn)其具有抗菌活性，但其藥用價值仍不可忽視。

紫草素、桂皮醛對金黃色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌均有抗菌活性，紫草素對淋球菌和新型隱球菌也有抗菌作用，可對藥物研發(fā)提供參考。