袁 嬌，徐國強，周 翔,3,4，徐三平，李 勝，黎望明，劉 榜,3,4*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070； 3.生豬健康養(yǎng)殖省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；4．湖北省地方豬品種改良工程技術(shù)研究中心，武漢 430070； 5．通城縣國營種畜場，通城 437400)

通城豬(Tongcheng pig)產(chǎn)于湖北省通城縣，是“華中兩頭烏豬”的代表類群，2000年被列入《國家級畜禽品種資源保護名錄》，具有肉質(zhì)嫩美、鮮香味濃、抗逆性強及抗高致病性藍耳病等種質(zhì)特性，是我國養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展、打好種業(yè)翻身仗的重要遺傳資源之一。通城豬遺傳資源保護(下稱“保種”)嚴格按照“以保為先，以用促保，保用結(jié)合”方針展開，建立以保種場和保護區(qū)的原位保種為主、種質(zhì)冷凍保存等生物技術(shù)保種為輔的保種體系。在保種的同時做好通城豬的利用，篩選出最優(yōu)雜交組合的優(yōu)質(zhì)商品豬“鄂青一號”，已在湖北省及其周邊省份成功推廣。在深入挖掘通城豬優(yōu)良肉質(zhì)和抗藍耳病的種質(zhì)特性基礎(chǔ)上，培育了抗病優(yōu)質(zhì)新品種，新品種在保留通城豬優(yōu)良肉質(zhì)等主要種質(zhì)特性的基礎(chǔ)上，生長速度和瘦肉率顯著提高，且對藍耳病有較強的抗病力。

近年來，受非洲豬瘟的影響，通城豬也和其他地方豬種一樣面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)，目前通城豬的保種效果如何? 基于小群體活畜保種理論，可從群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性兩方面進行評價。常用群體分層、遺傳距離、親緣關(guān)系、公豬家系數(shù)量等指標來反映群體結(jié)構(gòu)；用等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，)、雜合度、有效群體含量(effective population size，)和連續(xù)性純合片段(runs of homozygosity，ROH)等參數(shù)來評估遺傳多樣性。群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的研究方法隨著分子標記及其檢測技術(shù)的發(fā)展而不斷改變，目前數(shù)量多、覆蓋率高和穩(wěn)定性好的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)成為進行遺傳分析常用的分子標記，在豬、牛、羊、馬、雞、馴鹿等物種的群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究中得到廣泛使用?；蚪M測序技術(shù)的進步和SNP芯片的發(fā)明實現(xiàn)了從全基因組水平進行SNP掃描和基因分型，使得對群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的評價更加全面和準確。本研究將利用“中芯一號”("Zhongxin No.1")SNP 芯片對通城豬保種群體進行全基因組掃描和分析，評估通城豬保種場多年的保種效果，為通城豬遺傳資源的進一步保護和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以通城縣國營種畜場15個血統(tǒng)(系譜記錄)中具代表性的20頭公豬及48頭繁殖母豬為研究對象，采集耳組織樣品并用苯酚-氯仿法提取DNA。利用“中芯一號”50K SNP芯片在北京康普森生物技術(shù)有限公司對通城豬進行全基因組SNPs檢測，累計得到51 315個SNPs，利用Plink(v 1.90)軟件質(zhì)控后得到的26 999個SNPs進行群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析。

1.2 方法

1.2.1 群體結(jié)構(gòu)分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)是使用GCTA(v 1.93)軟件按Price等提出的EIGENSTRAT方法計算前2個主成分，分析結(jié)果通過R(v 4.0.2)軟件進行可視化。利用基因型信息構(gòu)建保種個體基因組加性遺傳相關(guān)矩陣，即親緣關(guān)系G矩陣：

公式中，為×標準化的基因型矩陣，為標記個數(shù)，為分型個體數(shù)；為第i個位點最小等位基因頻率。

根據(jù)連鎖不平衡分析利用Plink(v 1.90)軟件去除冗余位點，以50個SNPs為一個窗口，每次步移5個SNPs，r的閾值為0.6，去除強連鎖位點，再進一步基于狀態(tài)同一(idendity by state，IBS)分析個體間遺傳距離(distance，D)?；?0頭公豬遺傳距離用R(v 4.0.2)及MEGA(v 11.0.10)軟件進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以3代內(nèi)無親緣關(guān)系劃分公豬家系，依據(jù)個體間遺傳距離：D=1-r(r為個體間親緣關(guān)系)將親緣系數(shù)0.062 5作為劃分公豬血統(tǒng)的依據(jù)，并進行可視化。

1.2.2 遺傳多樣性分析 通過Plink(v1.90)軟件計算等位基因頻率，每個基因座上等位基因一個親本為雜合子另一個親本為不同基因型的概率為多態(tài)信息含量()，群體內(nèi)多態(tài)性基因座所占比例為多態(tài)性標記比()，群體中雜合子所占比率為觀測雜合度(observed heterozygosity，)，群體內(nèi)隨機抽取兩等位基因各不相同的概率為期望雜合度(expected heterozygosity，)?；陔s合度衡量理想群體中一個基因座上產(chǎn)生與實際群體中相同雜合度所需要的等位基因數(shù)目為有效等位基因數(shù)()，的計算也通過Plink(V1.90)軟件實現(xiàn)。利用TASSEL(v 5.0)軟件計算每個位點上核苷酸差異的平均值，得到核苷酸多樣性()。

歷史有效群體含量()通過SNeP(v 1.1)軟件利用連鎖不平衡程度進行分析，計算公式為：

而當前世代的是根據(jù)數(shù)量遺傳學(xué)理論計算的，若群體中公、母畜的數(shù)量分別設(shè)為N和N，則群體在各家系等量留種的情況下為：

群體每一世代的近交增量為：

通過Plink(v 1.90)軟件檢測基因組上出現(xiàn)的一定數(shù)量和密度SNPs表現(xiàn)為純合的區(qū)域，即為連續(xù)性純合片段(ROH)，主要參數(shù)如下：20個SNPs的滑動窗口沿染色體滑動、每個滑動窗口的雜合子個數(shù)不超過1個、最小長度>10 kb，SNP個數(shù)/ROH>20、最小SNP密度>1 000 kb/SNP?；趥€體的ROH總長度和基因組的總長度可計算個體基因組近交系數(shù)()，計算公式如下：

式中，∑為一個個體檢測到的所有ROH的長度之和，為常染色體基因組總長度。本研究為排除全同胞對計算的影響，僅計算41頭無全同胞關(guān)系個體的基因組近交系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 群體結(jié)構(gòu)

通城豬保種群主成分分析中PC1和PC2主成分可解釋的遺傳變異分別為6.92%、5.19%，種群內(nèi)個體也有很好的分散，20頭種公豬均未見明顯聚集，這表明保種群的群體結(jié)構(gòu)無明顯分層(圖1)。基于IBS遺傳距離矩陣和親緣關(guān)系矩陣分析群體結(jié)構(gòu)(圖2和圖3)，群體內(nèi)個體間的遺傳距離平均值為0.27±0.02，范圍為0.14～0.31，親緣系數(shù)平均為0.17，保種群大多數(shù)個體間具有中等程度的親緣關(guān)系?；?0頭公豬的遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，按親緣系數(shù)小于0.062 5的標準劃分公豬家系，共分為10個公豬家系(圖4)。

圖1 通城豬PCA分析結(jié)果Fig.1 PCA analysis results of Tongcheng pigs

圖中每一個小方格代表第一個到最后一個個體兩兩之間的遺傳距離，該值越大小方格越接近橙色，反之越接近藍色。圖中編號m代表公豬，f代表母豬，m和f后的數(shù)字代表個體號，下同Each small square in the figure represents the genetic distance between the first and last individuals. The larger the value, the closer the square is to orange, and vice versa, the closer to blue. The m in the figure represents the boar, and f represents the sow, the numbers after m and f represent individual numbers,the same as below圖2 遺傳距離矩陣可視化結(jié)果Fig.2 Visualization results of genetic distance matrix

圖中每一個方格代表第一個到最后一個個體兩兩之間的親緣關(guān)系值，該值越大越接近于橙色，反之越接近藍色Each small square in the figure represents the relationship coefficient value between the first and last individuals. The larger the value, the closer to orange, and vice versa, the closer to blue圖3 親緣關(guān)系G矩陣可視化結(jié)果Fig.3 Visualization results of genetic relationship G matrix

圖中數(shù)字代表公豬樣品編號，縱坐標代表遺傳距離，紅線代表親緣系數(shù)值為0.062 5The number represents the boar individual number, the ordinate represents the genetic distance, and the red line represents the relationship coefficient is 0.062 5圖4 20頭公豬遺傳距離聚類圖Fig.4 Clustering diagram of genetic distance of 20 boars

2.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性評估參數(shù)計算結(jié)果見表1，其中等位基因頻率為0.77、有效等位基因數(shù)為1.52、多態(tài)信息含量為0.31、觀測雜合度為0.32，期望雜合度為0.31，這些結(jié)果表明，通城豬保種群具有豐富的遺傳多樣性。

表1 通城豬遺傳多樣性相關(guān)參數(shù)統(tǒng)計

基于連鎖不平衡計算歷史世代有效群體含量()，通城豬1 000代前=2 245頭、500代前=978頭、20代前=105頭，歷史世代的表明，通城豬的有效群體含量呈逐代下降的趨勢(圖5)。通城豬保種場一直采用各家系等數(shù)留種方式進行選留，根據(jù)留種方式計算通城豬當前世代為94頭，近交增量為0.53%。從全基因組水平對通城豬群體進行連續(xù)性純合片段(ROH)分析，共發(fā)現(xiàn)184個ROHs，平均ROH長度為23.71 Mb，范圍在11.26～69.02 Mb之間，主要集中在15～20 Mb之間(占28.80%)；ROH集中分布在1、2、3、13號染色體上，其中13號染色體ROH數(shù)量最多為22個(圖6)。對通城豬個體進行分析，其ROH數(shù)量在1～9個 之間，長度主要分布在50～75 Mb之間，平均ROH總長度為(71.97±52.95) Mb(圖7)?；谌蚪MROH估計通城豬基因組近交系數(shù)()為0.04%。

圖5 通城豬的歷史有效群體含量Fig.5 Historical effective population size (Ne) of Tongcheng pigs

A.不同染色體的ROH數(shù)量分布；B.不同長度的ROH數(shù)量分布A.Distribution of ROH numbers on different chromosomes; B. Distribution of ROH numbers with different lengths圖6 通城豬基因組ROH數(shù)量及分布Fig.6 Number and distribution of ROH in the genome of Tongcheng pigs

A.不同ROH數(shù)量的個體分布；B.個體的ROH總長度分布A.ROH quantity distribution of individuals; B. ROH length distribution of individuals圖7 通城豬個體ROH分布Fig.7 ROH distribution of all individuals in Tongcheng pigs

3 討 論

畜禽遺傳資源保護(簡稱保種)的本質(zhì)是保護遺傳多樣性。通城豬作為優(yōu)質(zhì)抗逆地方品種代表之一，自20世紀80年代建立通城縣國營種畜場(通城豬保種場)以來，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和地方政府的支持下保種工作已持續(xù)近40余年。本研究利用全基因組SNP信息從群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性兩個方面評估保種場多年的保種效果。

在群體結(jié)構(gòu)研究中，通過主成分分析表明通城豬保種群是一個沒有分層的純種群體。群體中個體間的遺傳距離范圍在0.14～0.31之間，較2013年對通城豬(12頭)的分析結(jié)果(0.11～0.23)遠，這可能是由于樣本含量差異導(dǎo)致。通城豬遺傳距離平均為0.27，高于青裕豬，低于馬身豬和藍塘豬，3個 品種分別為0.26±0.03、0.29、0.33±0.03，這表明通城豬群體具有適中的遺傳距離。公豬家系數(shù)量是保種成敗的關(guān)鍵，長期以來通城豬保種場系譜記載血統(tǒng)數(shù)量為15個，本研究結(jié)合遺傳距離以及親緣系數(shù)將20頭種公豬劃分為10個基因組家系，以親緣系數(shù)為0.062 5作為劃分家系的閾值。閾值的設(shè)置是基于不同的公豬血統(tǒng)其3代內(nèi)沒有親緣關(guān)系，若3代內(nèi)有親緣關(guān)系即為近交個體，其近交系數(shù)為0.031 25；若個體間沒有近交，其近交系數(shù)至少應(yīng)當小于0.031 25，那么親緣系數(shù)應(yīng)小于0.062 5。不論是系譜記錄的家系還是基因組家系數(shù)量都滿足農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的《畜禽遺傳資源保種場保護區(qū)和基因庫管理辦法》文件對公豬家系數(shù)量的要求?；蚪M家系為通城豬進一步的保種提供了新的策略，對于同一基因組家系的不同系譜記錄家系，可通過選配構(gòu)建出不同的基因組家系，進一步增加通城豬的基因組家系數(shù)量。

本研究中通過等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、多態(tài)性標記比例、雜合度、核苷酸多樣性等參數(shù)從多態(tài)性和雜合性度量遺傳多樣性，利用有效群體含量()、連續(xù)性純合片段(ROH)以及近交程度評估保種效果。等位基因頻率為0.5時群體中雜合基因型頻率最高，也就是說群體遺傳多樣性最豐富，通城豬等位基因頻率均值為0.77，群體的遺傳多樣性豐富。雜合度是度量遺傳變異的一個重要指標，雜合度越高的群體其遺傳多樣性越豐富，本研究中通城豬的觀測雜合度和期望雜合度均與本課題組在2015年的研究結(jié)果(為0.32，為0.31)相一致，高于大部分其他主要中國地方豬種(為0.14～0.26，為0.15～0.29)，說明保種群體雜合度高且比較穩(wěn)定。從多態(tài)信息含量分析，通城豬基因組大部分位點為中度多態(tài)位點(0.25<<0.5)，本課題組前期通過全基因組測序研究也發(fā)現(xiàn)，在通城豬基因組存在7百萬個SNPs位點，這些結(jié)果均表明通城豬具有豐富的遺傳多樣性。

有效群體含量()是評價保種效果的一個重要指標。越大，群體受遺傳漂變的影響越小，更有利于維持高的雜合度，種群維持能力更強。通城豬保種群20世代前為105頭，與其他“華中兩頭烏”類群如贛西兩頭烏(84)、沙子嶺豬(85)相比較具有更大的。有效群體含量的大小主要受群體中數(shù)量少的性別的影響，也就是說公豬對的影響更大，要想提高有效群體含量來確保保種效果，就要增加群體中公畜的數(shù)量。ROH普遍存在于受選擇強度密集的基因組區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域基因純合將導(dǎo)致遺傳多樣性降低，一般來說，選擇強度大的商業(yè)品種具有更長、更多的ROH，其ROH平均長度范圍在23.3～286 Mb之間，而中國地方豬種在1.8～245 Mb之間，與其他品種相比，通城豬平均ROH長度(23.71 Mb)處于較低水平，同時基于ROH計算的近交系數(shù)(0.04%)低于近交個體的兩種閾值0.781%或3.125%，這表明通城豬遺傳多樣性受到了非常好的保護。

4 結(jié) 論

通城豬保種群是一個沒有分層的純種群體，具有豐富的遺傳多樣性，表明通城豬得到了有效保護。