徐頌為，向 華*，張煥容*，楊 璐，王憲軍，撒朗文朱，朱江江

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041； 2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用 四川省重點實驗室，成都 610041)

羊傳染性膿皰皮炎俗稱“羊口瘡”，是由羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)引起的一種急性、接觸性、嗜上皮性的人獸共患傳染病，既能造成嚴重的經(jīng)濟損失，又威脅著人類健康。ORFV屬于痘病毒科副痘病毒屬，為雙股DNA病毒，由末端的可變基因區(qū)(001-008和112-134)和中間保守的核心基因區(qū)(009-111)組成。其中125基因編碼蛋白(ORFV125)能夠抑制細胞凋亡，然而對于其機制尚不清楚。深入探討ORFV125蛋白抑制細胞凋亡的分子通路對于揭示ORFV的致病機制具有重要作用。蛋白質CGI-55，又被稱為SERBP1(SERPINE mRNA binding protein 1)或PAIRBP1(PAI1 RNA-binding protein)，是一種被精氨酸甲基化修飾的RNA結合蛋白，修飾后的SERBP1蛋白可改變其亞細胞定位以及影響與其他蛋白的相互作用。對于SERBP1蛋白功能的研究目前主要集中在人源上，如2003年，Peluso發(fā)現(xiàn)1可通過與孕激素受體膜復合物結合進而激活細胞內信號通路，從而抑制顆粒細胞凋亡。2006年，Lemos和Kobarg通過酵母雙雜交試驗鑒定出SERBP1蛋白與CHD-3(chromo-helicase-DNA-binding domain protein)、Daxx(death domain associated protein)等9種細胞轉錄調控蛋白存在相互作用，推測SERBP1蛋白可能參與細胞轉錄調控過程。2014年，Costa等發(fā)現(xiàn)，1基因可下調細胞內與mRNA代謝和轉錄相關基因的表達，導致細胞周期的G期出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象。2016年，Guo等研究表明，過表達1后可促進腫瘤細胞的增殖?？梢奡ERBP1蛋白在mRNA代謝和轉錄、細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖等方面發(fā)揮重要作用。

近期研究發(fā)現(xiàn)，SERBP1蛋白過表達可抑制由內質網(wǎng)壓力引起的細胞凋亡過程。酵母雙雜交技術顯示，1與125存在相互作用，且125具有抑制細胞凋亡的作用。推測，ORFV可能通過SERBP1蛋白參與調控細胞的周期及凋亡，然而目前尚無山羊1基因序列及其蛋白在調控山羊鼻甲骨原代細胞凋亡作用的相關報道。同時，山羊鼻甲骨原代細胞常被作為羊口瘡病毒的增殖和致病機制研究的理想細胞類型之一。本研究選用簡州大耳羊為試驗動物，RT-PCR技術克隆山羊1基因序列并進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR技術檢測1基因在不同組織的表達水平；通過構建干擾RNA，并將其轉染山羊鼻甲骨原代細胞探究SERBP1蛋白對細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡的作用，以及對細胞凋亡相關基因的影響。為進一步深入研究1基因功能，揭示125抑制細胞凋亡的分子機制提供重要的試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和組織來源

本試驗所用動物為16只10月齡健康簡州大耳羊，屠宰后立即收集山羊心、肝、脾、肺、腎、胰腺、大腸、小腸、瘤胃9個組織樣本，使用已滅菌的DEPC水清洗后將組織用錫箔紙包好，迅速放入液氮罐中保存，備用。山羊鼻甲骨原代細胞由實驗室前期試驗分離獲得，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher Science公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒、Premix Taq、SYBRPremix Ex Taq、DL2000 DNA Marker、pMD-19T Simple載體購自TaKaRa公司；DL5000 DNA Marker購自蘇州宇恒生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自昂羽生物公司；GET Extraction kit和Plasmid Mini Kit I購自OMEGA公司；胎牛血清購自QUACELL公司；MTT細胞增殖及毒性檢測試劑、胰蛋白酶、雙抗和PBS購自博士德生物公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；siRNA干擾片段由上海吉瑪公司合成；Opti-mem減血清培養(yǎng)基、Lipofectamine轉染試劑購自賽默飛世爾科技公司；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；氯仿、異丙醇、二甲基亞砜等其他試劑均為國產(chǎn)生化試劑。

1.3 山羊SERBP1基因克隆及序列分析

按照TRIzol法提取簡州大耳羊組織總RNA，測定RNA樣品濃度以及OD/OD值，確保符合試驗要求。按反轉錄試劑盒說明書要求將總RNA反轉錄為cDNA，保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中山羊1基因預測序列(XM_018045378.1)，利用Primer Premier 5設計引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列見表1。以山羊脾組織cDNA為模板，使用上、下游引物進行PCR擴增。PCR反應體系：Tap PCR Master Mix9(2×)12.5 μL,上、下游引物(10 μmol·L)各1.0 μL,模板cDNA 1.0 μL，ddHO 9.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，63 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，使用GET Extraction kit膠回收試劑盒對目的片段進行回收，并將回收產(chǎn)物連接至pMD-19T Simple載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞，陽性菌落PCR鑒定正確后，擴大培養(yǎng)提取質粒并送至上海生工生物工程股份有限公司測序，將測序正確的重組質粒命名為pMD19-1。按照王憲軍等的方法對所得序列進行生物信息學分析。

1.4 檢測山羊SERBP1基因組織表達差異分析

選擇16只健康簡州大耳羊的9個組織(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胰腺、瘤胃)和鼻甲骨細胞，分別對每個樣本提取總RNA并反轉錄獲得cDNA。根據(jù)“1.3”克隆獲得的1基因序列，利用Primer Premier 5設計特異性RT-qPCR引物，RT-qPCR檢測1基因在各組織中的表達差異。選擇泛表達轉錄子基因(Ubiquitously-Expressed Transcript，)作為試驗的內參基因，引物序列見表1。

表1 引物信息

1.5 山羊鼻甲骨原代細胞的分離培養(yǎng)及SERBP1 siRNA的轉染

參考文獻[12]的方法進行山羊鼻甲骨原代細胞的分離培養(yǎng)。使用眼科剪將鼻甲骨組織剪碎，使之成為體積約1 mm的塊狀。DMEM(不含血清)沖洗后，1 000 r·min、5 min離心，反復幾次至上清液澄清，然后將少量含體積分數(shù)為15% FBS的DMEM培養(yǎng)基小心滴加置組織塊周圍，將六孔板置于37℃，5% CO的條件下培養(yǎng)2 h。等組織塊和六孔板全部貼壁后沿壁加入2 mL營養(yǎng)液，24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。等細胞培養(yǎng)至細胞貼壁80%～90%后，使用0.125%胰蛋白酶中消化20 s后繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿后以1∶2進行傳代培養(yǎng)。待傳至第六代，將細胞按照(1～5)×10個·cm的接種量接種于12孔培養(yǎng)板中，次日待細胞生長至80%融合時，按Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行轉染，具體操作步驟參考王江林等的方法。培養(yǎng)48 h后，TRIzol法提取收集到的細胞總RNA，反轉錄成cDNA，利用RT-qPCR檢測1基因的mRNA表達水平，篩選有效的siRNA干擾片段。試驗設置3個重復。山羊3條1-siRNA序列由上海吉瑪基因公司設計合成，引物序列見表2。同時，以基因作為內參基因。

表2 siRNA的引物序列

1.6 干擾SERBP1對山羊鼻甲骨原代細胞增殖的影響

將第6代山羊鼻甲骨原代細胞接種于96孔培養(yǎng)板，次日待細胞生長至80%時，按照“1.5”的方法進行轉染。培養(yǎng)24、48、72、96 h后，按照MTT試劑說明書，每孔加入10 μL的MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，振蕩10 min溶解結晶，酶標儀選擇490 nm波長檢測各孔光吸收OD值，每天在相同的時間測定1次，根據(jù)每組測定的OD值的平均值繪制細胞生長曲線。每組設5個重復孔，試驗重復3次。

1.7 干擾SERBP1對山羊鼻甲骨原代細胞周期的影響

參照“1.5”方式進行轉染，轉染48 h后，按照細胞周期檢測試劑盒說明書，胰蛋白酶消化細胞，離心收集沉淀細胞，加入1 mL預冷的PBS溶液重懸細胞，再次加入4 mL預冷的95%乙醇，混勻后在4 ℃條件下固定過夜，離心收集沉淀細胞，加入5 mL預冷的PBS溶液，重懸細胞，再次離心收集沉淀細胞，隨后向每管細胞樣品中加入0.4 mL的碘化丙啶染色液，充分重懸細胞，37 ℃避光條件染色30 min，使用流式細胞儀進行檢測。

1.8 干擾SERBP1對山羊鼻甲骨原代細胞凋亡的影響

同樣參考“1.5”方式進行轉染，轉染48 h后，收集上層清液，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書，使用不含有EDTA的胰蛋白酶消化細胞，加入上層清液，離心收集沉淀細胞。加入1 mL 4 ℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心收集沉淀細胞。向沉淀細胞中加入500 μL Binding Buffer進行重懸，加入5 μL Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育5 min，加入10 μL的碘化丙錠溶液(濃度為μg·mL)，并加400 μL PBS，立即上流式細胞儀進行檢測。

1.9 干擾SERBP1對山羊鼻甲骨原代細胞凋亡相關基因的影響

根據(jù)GenBank公布的山羊凋亡相關基因(KJ782303.1)、-2(KJ782304.1)、3(NM_001286089.1)、7(XM_018041622.1)序列以及牛凋亡相關基因53(DQ656491.1)、211(NM_001075310.1)、1(XM_027564618.1)序列，利用Primer Premier 5.0軟件分別設計引物，引物序列見表3。利用RT-qPCR檢測干擾1對細胞凋亡相關基因的mRNA表達水平，選擇作為試驗的內參基因。

表3 凋亡相關基因的引物序列

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對實時熒光定量數(shù)據(jù)采用2方法進行處理。利用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan’s法對各組織mRNA表達進行多重比較。<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 山羊SERBP1基因CDS區(qū)的克隆、鑒定及生物信息學分析

經(jīng)克隆測序得到一條長1 293 bp的1基因序列，包含5′UTR 44 bp，CDS區(qū)1 179 bp，3′UTR 70 bp，編碼392個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖1A)(GenBank登錄號：MZ389322)。膠回收產(chǎn)物經(jīng)轉化后，菌落PCR鑒定得到與預期1基因大小相符的條帶(圖1B)。

A. 山羊 SERBP1 克隆的凝膠電泳圖；B. 山羊 SERBP1 克隆的質粒凝膠電泳圖。M. DL5000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker；1. SERBP1 目的條帶；N. 陰性對照A. Gel electropherogram of the goat SERBP1 clone; B. Plasmid gel electrophoresis of goat SERBP1 clone. M. DL5000 DNA Marker, DL2000 DNA Marker; 1. SERBP1 target band; N. Negative control圖1 山羊SERBP1基因克隆Fig.1 Cloning of SERBP1 in goat

SERBP1蛋白分子式為CHNOS，為穩(wěn)定的疏水性蛋白(圖2A)，蛋白分子質量為43.04 ku，不存在信號肽(圖2B)，無跨膜結構域(圖2D)。 SERBP1蛋白中α螺旋占比13.27%，無規(guī)則卷曲占比76.28%和延伸鏈占10.46%(圖2C)， 三級結構結果如圖3A。該蛋白主要包括兩種磷酸位點，分別是17個絲氨酸(Serine)、10個蘇氨酸(Threonine)(圖2E)。亞細胞定位顯示SERBP1蛋白主要存在于細胞核(78.3%)。與SERBP1蛋白可能存在相互作用的蛋白包括：RPL8(ribosomal protein L8)、RPS29(ribosomal protein S29)、SND1(staphylococcal nuclease domain-containing protein)、IFRD2(interferon related developmental regulator 2)、RPL26(ribosomal protein L26)、FMR1(fragile x mental retardation 1)、RPS5(ribosomal protein S5)、RPL29(ribosomal protein L29)、GTF3C6(general transcription factor IIIC subunit 6)、RPL18(ribosomal protein L18)(圖3B)。系統(tǒng)進化樹顯示，山羊和預測綿羊、牛、豬的親緣關系較近，與綿羊親緣關系最近，與生物分類學保持一致(圖3C)。

A.山羊SERBP1蛋白質疏水結構預測；B.山羊SERBP1蛋白的信號肽分析；C.山羊SERBP1蛋白質二級結構分析，長豎線代表α螺旋，中豎線代表延伸鏈，短豎線代表代表無規(guī)卷曲；D.山羊SERBP1蛋白跨膜結構預測；E.山羊SERBP1蛋白磷酸化位點預測A. Prediction of hydrophobic structure of goat SERBP1 protein; B. Signal peptide analysis of goat SERBP1 protein; C. Secondary structure prediction of goat SERBP1 protein, the long vertical lines represent alpha helix, the middle vertical lines represent extended strand, the short vertical lines represent random coil; D. Prediction of transmembrane structure of goat SERBP1 protein; E. Prediction of SERBP1 protein phosphorylation sites in goat圖2 山羊 SERBP1 蛋白生物信息學分析Fig.2 Bioinformatics analysis of SERBP1 protein in goats

A. 山羊SERBP1蛋白三級級結構預測；B. 山羊SERBP1蛋白與其他蛋白相互作用網(wǎng)絡；C. 不同物種間SERBP1蛋白的系統(tǒng)進化樹A. Tertiary structure prediction of goat SERBP1 protein; B. The interaction network of goat SERBP1 with other proteins; C. Phylogenetic tree of SERBP1 protein among different species圖3 山羊SERBP1蛋白生物信息學分析Fig.3 Bioinformatics analysis of SERBP1 protein in goats

2.2 山羊SERBP1基因的組織表達差異分析

結果顯示(圖4)，1基因在9個組織及鼻甲骨細胞中均有表達，其中胰腺中表達量最高，脾、肝、鼻甲骨細胞次之，達到了極顯著和顯著水平(<0.01或<0.05)，而在腎、肺、小腸、大腸表達量最低。

不同大寫字母表示數(shù)據(jù)間差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different uppercase letters indicate highly significant difference between data (P<0.01); Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖4 山羊SERBP1基因的組織表達譜Fig.4 Tissue expression profile of goat SERBP1

2.3 SERBP1干擾效率的確定

RT-qPCR檢測結果表明(圖5A)，與對照細胞組表達水平相比，1-siRNA1下調1表達量為70%，1-siRNA2和1-siRNA3分別下調35%和46%。因此，1-siRNA1對1表達水平的干擾效果更好，達到了極顯著水平(<0.01)，后續(xù)試驗選用1-siRNA1。

2.4 siRNA干擾SERBP1對山羊鼻甲骨原代細胞增殖的影響

試驗結果見圖5B，與對照細胞組相比，轉染1-siRNA1片段的山羊鼻甲骨原代細胞48 h后增殖受到了一定程度的抑制，隨著時間的延長，其抑制作用也極顯著增加(<0.01)。

A. SERBP1基因干擾效率檢測; B. siRNA干擾SERBP1基因對山羊鼻甲骨細胞增殖的影響。**. P<0.01A. Interference efficiency detection of SERBP1 gene; B. The effects of siRNA interference with SERBP1 gene on the proliferation of goat turbinate bone cells. **. P<0.01圖5 siRNA干擾SERBP1的篩選及其對山羊鼻甲骨細胞增殖的影響Fig.5 The screening of siRNA interfering SERBP1 and its effect on the proliferation of goat turbinate bone cells

2.5 siRNA干擾SERBP1對山羊鼻甲骨原代細胞周期的影響

細胞周期檢測結果顯示(圖6A)，G/G期細胞數(shù)，與對照細胞組((69.61±0.02)%)比較，1-siRNA1組G/G期細胞數(shù)((72.69±0)%)顯著增加 (<0.05)； 而G/M期細胞數(shù)，與對照細胞組((18.92±0.98)%)比較，1-siRNA1組G/M期細胞數(shù)((16.67±0.26)%)極顯著減少 (<0.01)；對于S期細胞數(shù)，與對照細胞組((11.48±1)%)比較，1-siRNA1組S期細胞數(shù)((10.56±0.25)%)無顯著變化 (>0.05)，可見細胞被阻滯于G/G期。

A. SERBP1-siRNA1和NC組不同期細胞數(shù)量對比；B. 試驗組SERBP1-siRNA1山羊鼻甲骨原代細胞周期分布；C. 對照組NC山羊鼻甲骨原代細胞周期分布。*. P<0.05，**. P<0.01A. Comparison of the number of cells at different stages between the SERBP1-siRNA1 and NC groups; B. Experimental group SERBP1-siRNA1 goat primary turbinate bone cells cycle distribution; C. Control group NC goat primary turbinate bone cells cycle distribution. *. P<0.05, **. P<0.01圖6 siRNA干擾SERBP1對山羊鼻甲骨細胞周期的影響Fig.6 The effects of SERBP1-siRNA1 on the cycle of goat turbinate bone cells

2.6 siRNA干擾SERBP1對山羊鼻甲骨原代細胞凋亡的影響

結果顯示(圖7A)，轉染對照細胞組的山羊鼻甲骨細胞的早期凋亡率是(1.74±0.15)%，晚期凋亡率為(15.3±1.75)%，總凋亡率為(17.04±1.9)%。而轉染的1-siRNA1山羊鼻甲骨細胞的早期凋亡率是(0.99±0.27)%，晚期凋亡率為(7.36±0.86)%，總凋亡率為(8.35±1.13)%，早期凋亡率顯著低于對照細胞組(<0.05)，晚期和總凋亡率極顯著低于對照細胞組(<0.01)。因此，siRNA干擾1基因后可抑制細胞凋亡。

A. SERBP1-siRNA1和NC組細胞凋亡比例對比；B. 試驗組SERBP1-siRNA1山羊鼻甲骨原代細胞凋亡情況；C. 對照組NC山羊鼻甲骨原代細胞凋亡情況。*.P<0.05，**. P<0.01A. Comparison of apoptosis rate of SERBP1-siRNA1 and NC groups; B. Experimental group SERBP1-siRNA1 goat primary turbinate bone cells apoptotic; C. Control group NC goat primary turbinate bone cells apoptotic. *.P<0.05，**. P<0.01圖7 siRNA干擾SERBP1對山羊鼻甲骨細胞凋亡的影響Fig.7 The effects of SERBP1-siRNA1 on apoptosis of goat turbinate bone cells

2.7 siRNA干擾SERBP1對山羊鼻甲骨原代細胞凋亡相關基因的影響

由圖8可以看出，與對照細胞組相比，siRNA干擾1后可導致山羊鼻甲骨細胞內促凋亡基因3和211 mRNA表達量極顯著下降(<0.01)，、7 mRNA表達量顯著下降(<0.05)，而-2、53、1 mRNA表達量無顯著變化(>0.05)。

*.P<0.05，**. P<0.01圖8 siRNA干擾SERBP1基因對凋亡相關基因表達的影響Fig.8 The effect of siRNA interference SERBP1 gene on the expression of apoptosis-related genes

3 討 論

目前國內外關于1基因的研究在人方面較多，但未見有關山羊1基因的研究報道。本研究以簡州大耳羊為研究對象，首次克隆得到山羊1基因序列1 293 bp，其中CDS區(qū)長1 179 bp，編碼392個氨基酸。氨基酸的一級結構分析發(fā)現(xiàn)，1不存在信號肽，且無跨膜區(qū)，推測其為非分泌性蛋白，此研究結果與Peluso等報道的人SERBP1蛋白不具有跨膜結構域的結果是一致的。蛋白亞細胞定位的預測對揭示其生物學功能具有重要的參考意義。目前關于SERBP1的亞細胞定位存在一定的爭議，如2003年，Lemos等研究發(fā)現(xiàn)，人源的SERBP1蛋白可穿梭于Hela細胞的胞質和胞核之間，且受到蛋白甲基化的影響。亞甲酸鹽處理引起的蛋白甲基化，可導致人源SERBP1蛋白發(fā)生核質穿梭，被脅迫從Hela細胞的胞質向胞核轉移，最終定位于細胞核。而早期文獻預測，當SERBP1蛋白定位于細胞核內時，其主要功能為參與細胞的轉錄調控，而當定位于細胞質內時，可能與(PAI-1) mRNA的穩(wěn)定性有關。本研究亞細胞定位預測結果顯示，山羊SERBP1蛋白主要存在于細胞核內，因此推測，該蛋白在細胞核內可能參與基因的轉錄調控作用，具體功能仍需進一步的研究確定。

STRING交互式數(shù)據(jù)庫是一種基因、蛋白質相互作用關系檢索的可靠工具，能夠幫助研究者獲得覆蓋范圍廣的預測的相互作用關系信息，從而構建蛋白質相互作用網(wǎng)絡。從蛋白互作關系來看，預測顯示SERBP1蛋白可能與RPL8、RPS29、SND1、IFRD2、RPL26、FMR1、RPS5、RPL29、GTF3C6、RPL18等蛋白存在相互作用，且以上預測相互作用的蛋白常被報道參與調控細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移、基因轉錄及mRNA翻譯等。如，2004年，Liu等研究表明，干擾29可以促進結腸癌HCT-116細胞的凋亡；2010年張軍等研究表明，過表達29會抑制成纖維細胞增殖，并促進細胞凋亡；2016年齊陽研究發(fā)現(xiàn)，過表達RPS5蛋白能抑制肝癌細胞遷移和肝癌干細胞樣細胞的產(chǎn)生。2019年Yu等研究表明,下調1可顯著抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲；2021年楊貴研究表明,過表達8可以明顯促進Hela細胞凋亡。而前期研究SERBP1蛋白的功能發(fā)現(xiàn)其主要在基因表達、mRNA代謝水平、細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡方面等發(fā)揮著重要作用。因此，結合與SERBP1蛋白相互作用的蛋白功能來看，進一步推測SERBP1蛋白可能普遍與這幾類蛋白存在聯(lián)系，進而共同參與細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡等方面的調控?；蛟诓煌M織中的表達規(guī)律可為研究該蛋白的功能提供試驗依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，1基因在山羊的心、肝、脾等9個組織及鼻甲骨細胞均有表達，且在胰腺中表達量最高。2003年Lemos等研究表明，1在人正常組織中均有表達，其中在心和骨骼肌中表達最高。而Serce等發(fā)現(xiàn)，1在人類正常乳腺組織中大量表達，而在骨骼肌和心組織檢測到相對較低的表達水平。因此推測，1基因在不同的物種組織間表達量的差異可能和其在不同物種組織中的功能差異相關。胰腺為一種特殊的實質器官，在細胞轉錄調控、mRNA代謝等過程中發(fā)揮著重要作用，而SERBP1蛋白同樣在mRNA代謝和轉錄水平發(fā)揮作用，進一步推測SERBP1蛋白可能在山羊胰腺中發(fā)揮著重要的生物學功能。

當細胞DNA發(fā)生損傷時，細胞會通過其周期蛋白共同調節(jié)細胞周期進程，被阻滯在某個細胞周期，為DNA的損傷修復爭取時間。同時，DNA損傷較輕時，細胞傾向于G/G期阻滯，而當損傷較重時，則啟動G/M期阻滯，從而有利于自身存活，而當損傷非常嚴重時，細胞DNA出現(xiàn)鏈斷裂，進而面臨細胞凋亡。本研究結果顯示，干擾1基因后可導致山羊鼻甲骨細胞的增殖能力下降，細胞發(fā)生G/G期阻滯，推測此種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能為DNA的損傷修復贏取時間，且該結果與Cao等和馬金亮等的研究結果相符。同時，從干擾1基因對細胞凋亡的結果來看，轉染48 h細胞凋亡率顯著降低。因此，進一步推測干擾1基因后，細胞增殖能力的降低后導致DNA的損傷進行修復，從而抑制了細胞的凋亡作用，此結果與Peluso等報道的研究相符。

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種方式，通過這種方式能有效地去除受損細胞，從而維持機體的正常生命活動。在細胞凋亡信號通路中，通過許多不同的信號傳遞系統(tǒng)傳遞凋亡信號，引起細胞凋亡，其中多種蛋白參與凋亡的信號通路調節(jié)，例如：Bcl-2、Casepases、P53、BCL2L11和PARP1。Caspase3是細胞凋亡過程中的最終執(zhí)行者，其激活可促進細胞凋亡。在本研究中，siRNA干擾1基因后下調基因3 mRNA表達，其基因表達量的變化與細胞凋亡率的變化規(guī)律是一致的，進而導致細胞的凋亡作用受到抑制。當細胞DNA損傷時，1基因可以過度激活導致3的激活，隨后被激活的3和1發(fā)生斷裂從而介導細胞凋亡。本研究結果顯示，干擾1基因后細胞內基因1 mRNA表達無顯著變化。因此推測，干擾1基因后，鼻甲骨細胞內可能存在其他基因參與調控1基因的表達，導致細胞凋亡作用受到抑制。但siRNA干擾1基因后抑制鼻甲骨細胞凋亡的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

4 結 論

山羊1基因cDNA全長1 293 bp，包含5′UTR 44 bp，CDS區(qū)1 179 bp，3′UTR 70 bp，編碼392個氨基酸，在胰腺中表達水平最高。1基因可能通過調控凋亡相關蛋白Caspase3、Caspase7、BCL2L11和Bax參與山羊鼻甲骨原代細胞凋亡調控。研究結果為進一步深入研究1基因功能，揭示125抑制細胞凋亡的分子機制提供重要的試驗數(shù)據(jù)。