楊伏春，劉 芮，李曉涵，高 立，劉長軍，祁小樂，崔紅玉，王笑梅，高玉龍，李 凱

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室 禽免疫抑制病創(chuàng)新團隊，哈爾濱 150069)

鴨腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)感染引起鴨、鵝和其他雁形目禽類發(fā)生一種稱為鴨瘟的急性、熱性、敗血性、烈性傳染病，又被稱為鴨瘟病毒。鴨瘟的特征是血管損傷，消化道出血、炎癥和壞死，淋巴器官受損以及實質器官的退行性變化。鴨瘟發(fā)病率和死亡率都很高，是養(yǎng)鴨業(yè)的一大危害。DEV具有廣泛的組織嗜性，自然條件下很多途徑均可以引發(fā)感染，包括消化道、眼、鼻、皮膚外傷及泄殖腔等。鴨瘟在世界各地均有分布，遷徙的水禽在其傳播中起重要的作用。我國于1957年在廣東首先發(fā)現(xiàn)該病，隨后在湖北、上海、浙江、廣西、江蘇、湖南和福建等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)本病流行。DEV感染后容易潛伏在三叉神經(jīng)、淋巴組織和外周血液淋巴細胞中，潛伏的病毒活化后易于造成鴨病毒性腸炎在家禽和遷徙的水禽中暴發(fā)。

DEV系皰疹病毒科的甲型皰疹病毒亞科成員之一，基因組為雙鏈DNA。DEV具有典型的甲型皰疹病毒基因特征，病毒基因由相互共價結合的長獨特區(qū)(UL)和短獨特區(qū)(US)及兩側的重復序列組成；位于基因組US 區(qū)末端的重復序列稱為末端重復序列(TRS)，位于基因組內部的重復序列稱為內部重復序列(IRS)。DEV基因組為UL-IRS-US-TRS結構方式，與水痘帶狀皰疹病毒和傳染性喉氣管炎病毒基因組構成方式相同，約編碼78個病毒蛋白。與其他皰疹病毒相比，DEV基因組研究起步較晚，但近些年研究發(fā)展較為迅速，已經(jīng)有很多病毒基因被預測、克隆表達并進行了基本特性分析，目前，正逐步進行基因功能研究，為探索DEV的致病機制提供了科學依據(jù)。

皰疹病毒41基因編碼宿主關閉蛋白(vhs)，因其可以通過抑制mRNA的活性來關閉宿主細胞大分子的合成而得名。Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)是迄今為止被研究最廣泛的皰疹病毒之一。HSV-1的vhs蛋白屬于晚期蛋白，又是一種核酸內切酶，具有RNase活性。已有報道表明，HSV-1 UL41可以特異性降解許多宿主蛋白的mRNAs，這些mRNA的3′端UTR包含有AU富集元件，已發(fā)現(xiàn)的其mRNA可被UL41降解的宿主基因包括IFIT3、Viperin和cGAS等。目前，對DEV41基因編碼的vhs功能還知之甚少，特別是其在病毒免疫逃逸及潛伏感染中發(fā)揮的作用尚不清楚，需要做更深入的研究。本研究采用DEV多片段黏粒拯救系統(tǒng)和Red/ET重組技術構建了DEV41基因缺失病毒，為研究DEV vhs的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株

克隆有DEV強毒SD19株基因組片段的5個重組黏粒D1、D2、D3、D4、D5由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病實驗室構建并保存。pRed/ET質粒購自Gene Bridges公司。大腸桿菌EPI300株購自Epicentre公司，DH10B大腸桿菌菌株由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

Counter-Selection BAC Modification Kit購自Gene Bridges公司，常規(guī)DNA聚合酶購自TaKaRa公司，質粒中提試劑盒購自QIAGEN公司，磷酸鈣轉染試劑盒購自Invitrogen公司，細胞培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司，DEV UL41蛋白兔多克隆抗體由本團隊制備，羊抗兔IgG-TRITC、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、鏈霉素購自Sigma公司。無特定病原體(SPF)鴨胚購自國家禽類實驗動物資源庫。鴨胚成纖維細胞(DEF)用10～11日齡SPF鴨胚制備。

1.3 引物的設計與合成

根據(jù)DEV CV株基因組序列(GenBank No. JQ673560)及rpsL-neo基因序列(GENE BRIDGES)，利用Oligo 7.0軟件設計重組黏粒D1改造引物UL41 hmL和UL41 hmR。根據(jù)DEV CV株序列設計41基因上下游旁側序列擴增引物：UL41P1F、UL41P1R、UL41P2F和UL41P2R，以及2基因鑒定引物UL2L和UL2R。引物序列如表1所示，引物均由吉林省庫美生物公司合成。

表1 UL41基因缺失黏粒構建及鑒定引物

1.4 UL41基因缺失黏粒的構建

以克隆有41基因的重組黏粒D1為骨架，利用Red/ET重組技術，缺失41基因編碼序列，構建41基因缺失黏粒D1 dUL41，構建圖譜如圖1所示。將克隆有DEV41基因的重組黏粒D1轉化入DH10B，經(jīng)氯霉素抗性LB平板篩選后挑取陽性菌株DH10B-D1；將pRed/ET質粒轉化入DH10B-D1，經(jīng)四環(huán)素抗性LB平板篩選后挑取陽性菌株DH10B-D1-Red/ET。以UL41 hmL、UL41 hmR為引物，rpsL-neo基因片段(GENE BRIDGES)為模板，PCR擴增獲得帶有41基因旁側序列的基因片段UL41-rpsL-neo；將UL41-rpsL-neo片段轉化進入菌株DH10B-D1-Red/ET，經(jīng)卡那霉素抗性LB平板篩選陽性重組菌D1-UL41-rpsL-neo。以UL41P1F、UL41P1R為引物，DEV SD19株基因組DNA為模板，PCR擴增獲得41基因上游300 bp旁側序列UL41F；以UL41P2F、UL41P2R為引物，SD19株基因組DNA為模板，擴增獲得41基因下游300 bp旁側序列UL41R；以UL41P1F、UL41P2R為引物，PCR產(chǎn)物UL41F、UL41R為模板，經(jīng)融合PCR擴增獲得41基因缺失替換片段UL41-KO。將PCR片段UL41-KO轉化入重組菌D1-UL41-rpsL-neo，經(jīng)鏈霉素抗性LB平板篩選獲得41基因被UL41-KO片段替換的重組黏粒D1dUL41。

圖1 UL41基因缺失黏粒D1dUL41構建示意圖Fig.1 The schematic diagrams of the UL41 deletion fosmid D1dUL41

1.5 DEV UL41基因缺失病毒的拯救及鑒定

利用質粒提取試劑盒提取含有DEV基因組片段的D1、D2、D3、D4、D5親本黏粒以及41基因缺失重組黏粒D1dUL41。通過磷酸鈣法將5個親本黏粒共轉染DEF，4～5 d后，觀察轉染的細胞是否出現(xiàn)DEV特異性蝕斑病變，電鏡檢測出現(xiàn)細胞病變的細胞中是否含有皰疹病毒樣病毒粒子；用重組黏粒D1dUL41替換親本黏粒D1轉染DEF，拯救41基因缺失病毒。利用試劑盒提取重組病毒基因組DNA，同時設親本病毒基因組DNA對照，利用引物UL2L、UL2R和UL41P1F、UL41P2R對提取的病毒基因組進行PCR鑒定，并測序檢測基因缺失位置及旁側序列是否正確。

1.6 DEV UL41基因缺失病毒蛋白表達檢測

將拯救的41缺失病毒rDEV-SD19/dUL41與親本病毒rDEV-SD19分別接種DEF，培養(yǎng)4～5 d 后經(jīng)顯微鏡觀察，比較病毒在感染細胞中產(chǎn)生的蝕斑病變。分別以UL41蛋白多克隆抗體和US3蛋白多克隆抗體作為一抗，以羊抗兔IgG-TRITC(1∶200) 作為二抗，采用間接免疫熒光方法(IFA)鑒定UL41和US3蛋白表達情況，同時設置未接毒DEF作為陰性對照。

1.7 DEV UL41基因缺失病毒生長曲線的測定

將41缺失病毒rDEV-SD19/dUL41與親本病毒rDEV-SD19以感染復數(shù)(MOI)為0.01接種次代DEF，感染后每隔24 h收集上清和細胞，持續(xù)至感染后96 h。將各個時間點所收集的病毒液接種96 孔板中的DEF，測定各時間點病毒液的半數(shù)感染量(TCID)，繪制生長曲線，分析41基因缺失病毒和親本病毒在DEF中的生長特性。

2 結 果

2.1 UL41基因缺失黏粒的構建及鑒定

以41上游旁側序列引物UL41P1F、41下游旁側序列UL41P2R為引物，分別對親本黏粒D1和構建的41基因缺失黏粒進行PCR檢測。結果顯示，親本黏粒擴增獲得2 094 bp的基因片段，測序發(fā)現(xiàn)其包含41編碼區(qū)上游旁側序列(300 bp)、41基因編碼序列(1 494 bp)以及41基因下游旁側序列(300 bp)；41基因缺失黏粒擴增獲得600 bp的基因片段，測序發(fā)現(xiàn)其僅包含41編碼區(qū)上游旁側序列(300 bp)和下游旁側序列(300 bp)，41基因編碼區(qū)序列被成功缺失(圖2)。以上結果表明，41基因缺失黏粒D1 dUL41構建成功。

圖2 基因缺失黏粒D1dUL41的PCR鑒定結果Fig.2 Identification of gene deletion fosmid D1dUL41 by PCR

2.2 DEV UL41基因缺失病毒的拯救及鑒定

通過將克隆有DEV基因組片段的親本黏粒D1、D2、D3、D4、D5(圖1)共轉染DEF，拯救DEV親本病毒rDEV-SD19；用41基因缺失黏粒替換親本黏粒D1轉染DEF，拯救41基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41。將拯救的親本病毒與41基因缺失病毒接種DEF后，觀察細胞病變情況。結果顯示，上述病毒在DEF上均產(chǎn)生典型的DEV蝕斑病變(圖3A)。電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，41基因缺失病毒和親本病毒感染的DEF中存在典型皰疹病毒樣病毒粒子，大多以核衣殼形式存在于細胞核中(圖3B)。提取41基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41以及親本病毒基因組DNA，利用2基因鑒定引物UL2L、UL2R進行PCR鑒定，結果顯示，rDEV-SD19/dUL41和rDEV-SD19均可擴增獲得1 002 bp大小的基因片段(圖4)，片段大小與DEV強毒株2基因相符，表明上述病毒拯救成功；進一步用41旁側序列引物UL41P1F、UL41P2R對上述毒株進行PCR鑒定，親本病毒rDEV-SD19擴增獲得2 094 bp的片段，41缺失病毒擴增獲得600 bp的片段(圖4)，與重組黏粒D1dUL41的PCR鑒定結果一致，片段大小和測序結果與預期相符。以上結果表明，41基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41拯救成功。

圖3 UL41基因缺失病毒(rDEV-SD19/dUL41)和親本病毒(rDEV-SD19)感染DEF產(chǎn)生的細胞病變(A)和病毒粒子(B)Fig.3 The CPE (A) and electron microscopy (B) detection of the UL41 gene deletion virus rDEV-SD19/dUL41 and the parental virus rDEV-SD19 in DEFs

M. DL5000 DNA分子質量標準；1～3. UL2引物(UL2L、UL2R)PCR鑒定；4～6. UL41旁側引物(UL41P1F、UL41P2R)PCR鑒定；1、4. rDEV-SD19；2、5. rDEV-SD19/dUL41；3、6. ddH2OM. DL5000 DNA marker; 1-3. PCR detection with UL2 primers UL2L and UL2R; 4-6. PCR detection with UL41 flanking primers UL41P1F and UL41P2R; 1, 4. rDEV-SD19; 2, 5. rDEV-SD19/dUL41; 3, 6. ddH2O圖4 UL41基因缺失病毒的PCR鑒定Fig.4 Identification of the UL41 gene deletion virus by PCR

2.3 UL41基因缺失病毒蛋白表達鑒定

將UL41基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41與親本病毒rDEV-SD19分別接種DEF后3 d，利用IFA檢測UL41蛋白表達情況。結果顯示，用UL41蛋白抗體進行檢測，親本病毒rDEV-SD19感染的細胞可見紅色熒光信號，41基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41以及沒有接毒的對照細胞未見熒光；用US3蛋白抗體作為對照進行檢測，親本病毒rDEV-SD19和41基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41接毒的細胞均可見熒光(圖5)。以上結果進一步表明rDEV-SD19/dUL41構建成功。

圖5 間接免疫熒光試驗檢測UL41基因缺失病毒(rDEV-SD19/dUL41)和親本病毒(rDEV-SD19)感染DEF中UL41蛋白表達情況Fig.5 IFA detection of UL41 expression in DEFs infected with UL41 gene deletion virus rDEV-SD19/dUL41 or the parental virus (rDEV-SD19)

2.4 UL41基因缺失病毒復制動力學分析

將41基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41與親本病毒rDEV-SD19以MOI=0.01分別接種DEF，每24 h收集細胞和上清，測定病毒的復制曲線。結果如圖6所示，感染后24、48、72、96 h，親本病毒平均滴度分別為10、10、10、10TCID·mL；41缺失病毒在上述時間點的平均滴度分別為10、10、10、10TCID·mL；各時間點41缺失病毒rDEV-SD19/dUL41的平均滴度均顯著低于親本病毒(<0.05)。以上結果表明，41基因的缺失影響了DEV在DEF上的復制水平，41基因編碼的vhs蛋白在DEV復制中發(fā)揮重要作用。

*.P<0.05, **.P<0.01圖6 UL41基因缺失病毒復制動力學分析Fig.6 Analyses of the replication kinetics of the UL41 gene deletion virus rDEV-SD19/dUL41

3 討 論

近年來，鴨瘟在我國呈散在性流行，是危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的重要疫病之一。DEV致病機制及其編碼蛋白的功能分析為鴨瘟診斷方法與新型疫苗的研究奠定了基礎。皰疹病毒41基因編碼的vhs蛋白能夠關閉大多數(shù)宿主蛋白質合成。相比其他皰疹病毒，DEV41基因的功能及其在DEV復制和致病性中的作用仍然不是很清楚。本研究利用DEV多片段黏粒拯救系統(tǒng)和Red/ET重組技術，構建獲得了DEV41基因缺失病毒，并對其體外生物學特性進行了研究。

傳統(tǒng)的構建重組皰疹病毒的方法主要是同源重組法和細菌人工染色體(BAC)法。同源重組法依賴于細胞重組和修復機制，其可通過將選擇標記導入病毒基因組中實現(xiàn)富集和純化突變病毒。然而，這一過程費時費力，對獲得的重組突變病毒在體外細胞上進行連續(xù)傳代純化往往會造成重組病毒發(fā)生突變，而且重組病毒攜帶的選擇標記基因可潛在影響突變病毒的生物學特征。BAC法是將完整的皰疹病毒基因組插入到BAC中并在細菌中對其進行改造；病毒基因組重組BAC系統(tǒng)的構建仍舊依賴于同源重組方法，構建過程同樣復雜費時，而且重組病毒會攜帶BAC自身載體序列。本實驗室前期研究中建立了基于Fosmid黏粒的DEV拯救系統(tǒng)。相對于BAC系統(tǒng)，F(xiàn)osmid黏粒具有穩(wěn)定性好、無偏向性、構建周期短等諸多優(yōu)點。由于DEV基因組分為不同節(jié)段克隆入黏粒中，便于對不同的基因組片段分別進行操作，尤其適于皰疹病毒基因組中雙拷貝基因缺失病毒的構建。在DEV黏粒拯救系統(tǒng)基礎上，本研究采用Red/ET重組技術對DEV重組黏粒進行了改造，構建了41基因缺失黏粒，而后將41基因缺失黏粒D1dUL41與其他4個克隆有DEV基因組片段的親本黏粒共轉染DEF，拯救獲得41基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41。由于在轉染過程中將親本黏粒D1替換為41缺失黏粒D1dUL41，因此不會引入41未缺失的親本黏粒D1，拯救獲得的病毒為純凈的41基因缺失毒株，不含有親本病毒，因此不需要進行蝕斑純化，獲得的41基因缺失病毒序列缺失準確且病毒純凈，病毒拯救過程相對同源重組法和BAC法更加簡便、快捷。

41基因在多種α皰疹病毒中被稱為病毒宿主關閉基因。將偽狂犬病毒41缺失后獲得的41缺失病毒在體外細胞上表現(xiàn)出更小的蝕斑和更低的滴度，并且在小鼠模型中顯示出減弱的致死率。本研究構建了DEV41缺失病毒，研究發(fā)現(xiàn)41缺失DEV的體外復制能力明顯低于親本病毒，提示41基因編碼的vhs蛋白在DEV復制中起著重要作用。有研究表明，HSV-1可通過UL41蛋白的RNase活性誘導預先存在的宿主mRNA的快速降解，而且HSV-1 UL41蛋白能夠特異性降解多種天然免疫相關宿主蛋白mRNAs， 從而介導HSV-1逃逸宿主抗病毒天然免疫反應。本實驗室對DEV編碼的逃逸宿主天然免疫的病毒蛋白進行了篩選，發(fā)現(xiàn)UL41可以抑制Ⅰ型干擾素的表達，這可能是其缺失后影響DEV復制特性的機制之一，然而UL41影響DEV復制的具體分子機制還需進一步研究。本研究41基因缺失病毒的構建為研究UL41在DEV復制和致病中的功能奠定了基礎。

4 結 論

成功構建DEV41基因缺失毒株rDEV-SD19/dUL41，41基因缺失毒株在DEF中的復制能力明顯低于親本病毒，提示UL41蛋白在DEV復制中發(fā)揮重要作用。41基因缺失DEV的構建為進一步研究41基因在DEV感染和致病中的作用機制奠定了基礎。