毛彥妮，常佳偉，李 娜，王 鑫，康馨勻，馬 強(qiáng)，馬 靚，王桂琴

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

生物被膜是引起細(xì)菌持續(xù)感染和慢性傷口感染的重要原因，細(xì)菌形成生物被膜后通常能夠抵抗宿主的免疫反應(yīng)，相比于浮游態(tài)菌，其對(duì)抗生素、殺生物劑的耐受性更高。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是人類(lèi)皮膚的共生菌，可通過(guò)感染傷口并蔓延至植入裝置，形成生物被膜。研究表明，葡萄球菌形成生物被膜后使治療更加困難。

尋找新的和有效的抗生物被膜手段將有助于對(duì)抗金黃色葡萄球菌的感染。本研究比較了生物被膜態(tài)和浮游態(tài)生長(zhǎng)條件下，金黃色葡萄球菌在形態(tài)和生理學(xué)上的不同以及兩種狀態(tài)下表達(dá)差異顯著的基因，通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的功能和信號(hào)通路富集的研究，以期了解生物被膜菌的高持久性和高抗性，為進(jìn)一步深入探究金黃色葡萄球菌的耐藥性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)菌株、試劑及儀器

本研究使用的的金黃色葡萄球菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離純化，保存于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25923)購(gòu)自中國(guó)藥品與生物制品鑒定所；MHB肉湯和TSB肉湯購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司；抗菌藥物購(gòu)自中國(guó)藥品與生物制品鑒定所；細(xì)菌RNA提取試劑購(gòu)自TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購(gòu)自諾唯贊公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自德國(guó)Jena公司；Simpli Nano超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1 浮游態(tài)細(xì)菌培養(yǎng) 試驗(yàn)菌株接入MHB肉湯中于37 ℃下以210 r·min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，離心(10 min，12 000 r·min)收集浮游態(tài)細(xì)菌。

1.2.2 生物被膜態(tài)細(xì)菌培養(yǎng) 根據(jù)Yooh等報(bào)道的培養(yǎng)皿法培養(yǎng)靜態(tài)的生物被膜。將過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌株培養(yǎng)物稀釋至1×10cfu·mL， 接種到添加了葡萄糖的新鮮TSB肉湯培養(yǎng)基中，于96孔板中培養(yǎng)生物被膜。離心收集被膜態(tài)菌用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 生物被膜態(tài)菌觀察分析 采用結(jié)晶紫染色半定量法檢測(cè)金黃色葡萄球菌生物被膜，37 ℃培養(yǎng)生物被膜8、24、48、72、96 h后，棄掉浮游菌，用0.1 mol·L磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)沖洗3次，4 ℃ 使用戊二醛固定，經(jīng)結(jié)晶紫染色后，使用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡(SEM)對(duì)生物被膜進(jìn)行觀察。

1.2.4 金黃色葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的敏感性試驗(yàn) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定9種抗菌藥物對(duì)32株金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)和浮游態(tài)的最低抑菌濃度(MIC)。首先將梯度稀釋的不同濃度抗菌藥物按照每孔100 μL加到96孔板中，將濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏纳锉荒B(tài)以及浮游態(tài)的金黃色葡萄球菌菌液稀釋100倍后分別取100 μL接種到不同藥物濃度的孔中。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以MHB肉湯作為陰性對(duì)照，ATCC25923作為質(zhì)控菌株。置于37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判定參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 文庫(kù)構(gòu)建及RNA-seq測(cè)序委托北京諾禾致源科技有限公司完成。首先，通過(guò)加入帶有oligo(DT)的磁珠于總RNA中富集帶有poly-A尾的mRNA，然后通過(guò)片段化緩沖液進(jìn)行片段化，隨后使用試劑盒合成雙鏈cDNA。對(duì)合成的cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，并在3′末端加上一個(gè)A堿基。根據(jù)Illumina配對(duì)末端樣品制備試劑盒的說(shuō)明書(shū)，制備RNA-seq文庫(kù)并測(cè)序。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每種生長(zhǎng)條件下分別提取3份RNA樣本。

1.2.7 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理與分析 測(cè)序后，使用軟件SeqPrep對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。質(zhì)控完成后再使用軟件HISAT2將原始數(shù)據(jù)置于NCBI上進(jìn)行比對(duì)，獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝和表達(dá)量計(jì)算等的mapped reads，比對(duì)完成后對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。

1.2.8 表達(dá)量差異分析及GO、KEGG富集分析 為了確定差異表達(dá)基因的功能，使用檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具(STRING)進(jìn)行了GO和KEGG通路的富集分析。并用UniProt信息庫(kù)確定未被STRING鑒定的蛋白質(zhì)的功能。

1.2.9 RT-qPCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)，選擇10個(gè)生物被膜形成相關(guān)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。使用Primer premier 5設(shè)計(jì)引物并用NCBI Primer-BLAST對(duì)引物特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，挑選出合格的引物進(jìn)行試驗(yàn)(表1)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用諾唯贊的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用SYBR Green I Real-Time PCR試劑盒進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以16S rRNA為內(nèi)參基因，ddHO為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 RT-qPCR引物信息

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2法計(jì)算生物被膜態(tài)和浮游態(tài)金黃色葡萄球菌 mRNA的表達(dá)量。其中△△Ct=[Ct(處理組目的基因)-Ct(處理組內(nèi)參基因)]-[Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因)]。使用one-way ANOVA進(jìn)行差異分析，≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 金黃色葡萄球菌生物被膜形成過(guò)程的觀察

光學(xué)顯微鏡觀察金黃色葡萄球菌生物被膜的形成過(guò)程。如圖1所示，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)晶紫染色后的生物被膜，可見(jiàn)表面云絮樣、團(tuán)塊樣。8～72 h隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表面云絮樣物質(zhì)逐漸緊密，聚集黏附形成小菌落，雜亂無(wú)章，逐步遍布整個(gè)觀察視野(圖1A～D)。培養(yǎng)8 h后，生物膜已初具規(guī)模，但數(shù)量較少；24 h后，玻片上形成了厚厚且緊密的生物被膜，層層堆集。此后，生物被膜開(kāi)始分散，96 h時(shí)生物被膜結(jié)構(gòu)開(kāi)始疏散，玻片上形成的生物膜結(jié)構(gòu)較為稀松(如圖1E)。

A～E. 培養(yǎng)時(shí)間分別為8、24、48、72、96 hA-E. Culture time are 8, 24, 48, 72, 96 h, respectively圖1 光學(xué)顯微鏡下金黃色葡萄球菌生物被膜形成過(guò)程(100×)Fig.1 The biofilm formation process of S.aureus under optical microscope(100×)

掃描電鏡觀察金黃色葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)。掃描電鏡能更直觀地展現(xiàn)金黃色生物被膜形成過(guò)程的結(jié)構(gòu)變化。如圖2所示，8～72 h時(shí)生物被膜菌胞外基質(zhì)更加黏稠、濃密，膜內(nèi)金黃色葡萄球菌更加聚集(圖2A～D)。96 h時(shí)，細(xì)菌生物被膜立體結(jié)構(gòu)被破壞，緊密的結(jié)構(gòu)變的稀松，零散的游離菌聚集形成小型團(tuán)狀。生物被膜內(nèi)細(xì)胞開(kāi)始凹陷形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2E)。

A～E. 培養(yǎng)時(shí)間分別為8、24、48、72、96 hA-E. Culture time are 8, 24, 48, 72, 96 h, respectively圖2 掃描電鏡下金黃色葡萄球菌生物被膜形成過(guò)程(3 000×)Fig.2 The biofilm formation process of S.aureus under SEM(3 000×)

2.2 金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)和浮游態(tài)對(duì)抗菌藥物敏感性

金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)和浮游態(tài)對(duì)抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，菌株形成生物被膜后，膜內(nèi)細(xì)菌在胞外聚合物的屏障作用保護(hù)下，其抗藥性較游離態(tài)菌增加，最高增加4 096倍，最低增加8倍。

本文對(duì)某規(guī)模化豬場(chǎng)長(zhǎng)白豬、大白豬、長(zhǎng)大二元豬的第一、二、三胎的妊娠期、總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、產(chǎn)健仔數(shù)、仔豬初生窩重等繁殖指標(biāo)進(jìn)行整理，并采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，旨在為豬場(chǎng)下一步的選種、選配及提高母豬的繁殖性能提供可靠的理論依據(jù)，同時(shí)為其他豬場(chǎng)提供方法參考。

表2 32株金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)與浮游態(tài)對(duì)9種抗菌藥物的耐藥情況

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估與比對(duì)統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)中的測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià)和對(duì)比統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)匯總?cè)绫?所示。每個(gè)樣本中有97%以上的重復(fù)比對(duì)率，數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。剔除低質(zhì)量片段后組裝到試驗(yàn)組轉(zhuǎn)錄組中，組成轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)錄組序列上的標(biāo)記數(shù)分別為18 190 880、16 375 516、19 683 816、20 619 370、 16 578 378和19 221 314 bp，分別占文庫(kù)的97.95%、98.03%、98.03%、98.12%、98.16%和97.88%。記錄序列大小相同的unigenes的數(shù)量，得到unigenes的長(zhǎng)度。這些結(jié)果證明了本研究中組裝的unigenes是高質(zhì)量的。

表3 總讀取數(shù)和與參考基因組對(duì)應(yīng)的總讀取百分比

圖3為生物被膜態(tài)菌和浮游態(tài)菌的轉(zhuǎn)錄本讀數(shù)密度。如圖所示，生物被膜態(tài)菌的lg(FPKM+1)在0～4內(nèi)表達(dá)值較低，而在相同范圍內(nèi)，浮游態(tài)具有更多的表達(dá)基因。而且，浮游態(tài)的lg(FPKM+1)在3～4有大多數(shù)讀數(shù)偏向，因此浮游態(tài)具有較高的基因表達(dá)水平?？傮w而言，兩種樣品類(lèi)型之間大約90%的基因表達(dá)水平相似。

圖3 各樣本類(lèi)型表達(dá)量分布密度圖Fig.3 Density graph showing the distribution of expression levels for each sample type

圖4為顯示浮游態(tài)菌和生物被膜態(tài)菌基因關(guān)系的散點(diǎn)圖。如圖所示，兩樣本之間的基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。兩樣本類(lèi)型之間差異最大的上調(diào)或下調(diào)的離群值即為目標(biāo)基因。

圖4 浮游態(tài)和生物被膜態(tài)菌FPKM散點(diǎn)圖Fig.4 Scatter plot of the FPKM reads for both the planktonic and biofilm state bacteria

2.4 金黃色葡萄球菌生物被膜態(tài)和浮游態(tài)全基因表達(dá)分析

從cDNA文庫(kù)中，生物被膜態(tài)和浮游態(tài)分別獲得了2 499個(gè)和2 494個(gè)測(cè)序讀數(shù)。有37個(gè)基因僅在生物被膜態(tài)表達(dá)，32個(gè)僅在浮游態(tài)表達(dá)。如圖5A所示，重疊區(qū)域中的2 462個(gè)基因?yàn)閮煞N狀態(tài)下細(xì)菌均可轉(zhuǎn)錄的基因。為了進(jìn)行后續(xù)分析，僅考慮倍數(shù)變化大于2的基因，與浮游態(tài)菌相比，生物被膜態(tài)菌中顯著差異表達(dá)的基因共1 512個(gè)，其中，760個(gè)(50.26%)基因轉(zhuǎn)錄水平升高，而752個(gè)(49.74%)基因轉(zhuǎn)錄水平降低(圖5B)。

A. 基因表達(dá)維恩圖；B. 差異表達(dá)基因火山圖。有顯著性差異表達(dá)的基因用紅色點(diǎn)(上調(diào))和綠色點(diǎn)(下調(diào))表示，無(wú)顯著性差異表達(dá)的基因用藍(lán)色點(diǎn)表示A. Venn diagram of gene expression; B. Volcanic map of differentially expressed genes. Significantly differentially expressed genes are represented by red dots (up-regulated) and green dots (down-regulated), while not significantly differentially expressed genes are represented by blue dots圖5 基因表達(dá)水平比對(duì)圖Fig.5 Gene expression level comparison chart

2.5 差異表達(dá)基因的GO分析

從GO功能分析結(jié)果中列舉了部分功能條目，并選取了最顯著的條目繪制分類(lèi)餅狀圖(圖6)。在篩選的功能條目中，有5個(gè)生物過(guò)程，3個(gè)細(xì)胞組成和7個(gè)分子功能發(fā)生變化，生物過(guò)程的分類(lèi)結(jié)果表明，參與細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程的基因最多，分別占差異表達(dá)基因的28.72%和17.83%。細(xì)胞組分分類(lèi)結(jié)果中，細(xì)胞實(shí)體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)組分分別占差異表達(dá)基因的49.98%和37.09%。分子功能分類(lèi)結(jié)果中，結(jié)合和催化功能蛋白基因分別占差異表達(dá)基因的41.59%和27.83%。

圖6 GO富集圖Fig.6 GO enrichment pie chart

2.6 KEGG富集分析

KEGG分析結(jié)果顯示，有20條途徑顯著富集，如圖7所示，與代謝相關(guān)的通路顯著富集(<0.05)。其次為氨基酸的生物合成和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路。

圖7 差異表達(dá)基因KEGG富集散點(diǎn)圖Fig.7 KEGG enrichment scatter plot of differentially expressed genes

2.7 差異顯著基因表達(dá)分析

表4列出了生物被膜菌中轉(zhuǎn)錄上調(diào)和下調(diào)最多的10個(gè)基因。在轉(zhuǎn)錄水平下降的基因中，與編碼核糖體蛋白相關(guān)的基因?yàn)?、和，與葡萄糖代謝途徑相關(guān)的基因有SAOUHSC_01802、SAOUHSC_01064、、、、、和。而轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的基因主要包括生物被膜形成相關(guān)，如結(jié)合因子 ()、編碼相關(guān)轉(zhuǎn)移蛋白的基因、SAOUHSC_01028、、SAOUHSC_00315、1、以及SAOUHSC_02864等。

表4 差異表達(dá)基因列表

2.8 與金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關(guān)的關(guān)鍵基因的RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq鑒定的基因表達(dá)譜，選擇10個(gè)與生物被膜形成相關(guān)的主要基因，以16S rRNA為內(nèi)參基因，用RT-qPCR方法對(duì)其相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量。如圖8所示，RT-qPCR的表達(dá)趨勢(shì)與RNA-seq表達(dá)譜一致。其中、、、和基因表達(dá)上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別為5、4、8、2和5倍，而基因、、、和表達(dá)下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)分別為10、5、10、20和10倍。

圖8 各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of mRNA of each gene

3 討 論

細(xì)菌生物被膜是由多糖、DNA和/或蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜生物群落。除了幫助細(xì)菌在表面定植外，生物被膜還能增強(qiáng)對(duì)抗生素的耐藥性。金黃色葡萄球菌是引起人與動(dòng)物感染的重要致病菌之一，感染范圍從皮膚和黏膜的淺表感染到高侵襲性和潛在的致命感染。金黃色葡萄球菌感染，如心內(nèi)膜炎、骨髓炎和與留置醫(yī)療器械相關(guān)的感染，均與細(xì)菌生物被膜的形成有關(guān)。因此，對(duì)生物被膜態(tài)和浮游態(tài)細(xì)菌進(jìn)行生理和遺傳差異分析十分有意義。

本試驗(yàn)首先通過(guò)光學(xué)顯微鏡與掃描電鏡觀察金黃色葡萄球菌生物被膜形成過(guò)程中的生理狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在生物被膜生長(zhǎng)的過(guò)程中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生物被膜聚集面積越來(lái)越大，其結(jié)構(gòu)也越來(lái)越緊密。在生物被膜態(tài)菌表面還可觀察到一些黏性物質(zhì)，可能是生物被膜形成過(guò)程中分泌的胞外多糖，可以促進(jìn)細(xì)胞間黏附與成熟生物被膜三維立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，有助于生物被膜態(tài)菌落的形成。但隨著培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步增加，生物被膜內(nèi)細(xì)胞開(kāi)始凹陷形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與大多數(shù)生物被膜態(tài)細(xì)菌如變形鏈球菌和肺炎鏈球菌類(lèi)似，可能是在生物被膜態(tài)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中，隨著細(xì)菌密度的增加，生物被膜內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和氧氣不足導(dǎo)致的。

在本研究中，與浮游態(tài)菌相比，生物被膜態(tài)菌的耐藥性增加，這與Cargill和Upton報(bào)道的結(jié)果相似，可能是生物被膜中細(xì)菌代謝狀態(tài)的多樣性及生物被膜基質(zhì)的保護(hù)，或者是抗菌藥物難以滲透生物被膜，細(xì)菌生長(zhǎng)速度緩慢以及存在抗菌藥物降解酶等，從而使耐藥性增加。除此之外，與浮游態(tài)菌相比，生物被膜的存在使細(xì)菌增加了突變的頻率，并且生物被膜菌中的基因會(huì)發(fā)生頻繁的水平轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致耐藥基因迅速擴(kuò)散。總之，生物被膜的產(chǎn)生為細(xì)菌提供了重要的保護(hù)屏障，阻止抗菌藥物接觸細(xì)菌，干擾抗菌藥物作用的正常發(fā)揮，從而加劇了細(xì)菌的感染性。

基因表達(dá)譜可以揭示有關(guān)細(xì)菌物種適應(yīng)特定環(huán)境的重要信息。生物被膜是細(xì)菌的一種高度動(dòng)態(tài)的活性成分，生物被膜的存在有助于細(xì)菌持續(xù)性感染。本研究分析了金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)和浮游態(tài)的基因轉(zhuǎn)錄情況，在生物被膜態(tài)細(xì)菌中，與生物被膜形成相關(guān)的基因表達(dá)較活躍，如編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平在生物被膜態(tài)細(xì)菌中升高，銅綠假單胞菌和加德納菌也表現(xiàn)出這種現(xiàn)象。而參與代謝的基因(如與糖酵解相關(guān)的基因)和翻譯的基因(如編碼核糖體蛋白的基因)轉(zhuǎn)錄水平呈下調(diào)趨勢(shì)，與表皮葡萄球菌和變形鏈球菌的報(bào)道一致，可能是由于生物被膜包裹著的細(xì)菌，其獲得的營(yíng)養(yǎng)成分和轉(zhuǎn)錄翻譯所需的原材料有限，從而限制了其代謝和轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。這些信息為研究金黃色葡萄球菌生物被膜形成過(guò)程中代謝情況以及基因功能提供了重要的參考。

4 結(jié) 論

金黃色葡萄球菌在生物被膜態(tài)和浮游態(tài)的基因表達(dá)中呈現(xiàn)出顯著的差異。這些變化可能與生物被膜態(tài)菌的持久性密切相關(guān)，同時(shí)可能與細(xì)菌毒性的發(fā)揮息息相關(guān)。生物被膜態(tài)和浮游態(tài)生物過(guò)程中的代謝差異可能對(duì)控制由金黃色葡萄球菌引起的感染有所幫助，此研究為了解金黃色葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。