劉春顯，李 南

（集安市北緯四十一度參業(yè)有限公司·吉林通化·134211）

皮膚的衰老是一個(gè)不可逆且復(fù)雜的過(guò)程，受多種內(nèi)外因素調(diào)控。目前人們一直致力于研究皮膚的衰老機(jī)制。其中，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的一個(gè)重要因素[1-3]；細(xì)胞在代謝的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化能力的自由基，其可以攻擊生物膜系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，最終引起病變或衰老[4-6]。因此，抗氧化成為防御衰老的一個(gè)熱門作用靶點(diǎn)，而抗氧化天然藥物的篩查也成為了近年來(lái)的熱點(diǎn)問(wèn)題。

人參具有抗氧化，抗炎癥，抗疲勞，調(diào)節(jié)血壓等功效，其在中藥中的應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史[7-10]。人參皂苷是人參中的有效成分，是一種甾體皂苷，主要來(lái)源于人參的根部[11]。人參皂苷Rb1是人參皂苷中最常見、含量較為豐富的一種亞型，其在不同組織中的抗氧化作用也得到了較為廣泛的報(bào)道，但尚未有皮膚相關(guān)的研究開展。本研究圍繞人參皂苷Rb1抗氧化作用在皮膚領(lǐng)域的應(yīng)用研究，在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了人參皂苷Rb1可以預(yù)防抵抗過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞氧化衰老，并探究了人參皂苷Rb1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

本實(shí)驗(yàn)所用的人體真皮成纖維細(xì)胞系（HSF細(xì)胞系）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號(hào)CPH103）。

1.1.2 主要試劑

人參皂苷Rb1購(gòu)于MCE公司（貨號(hào)HYN0039）；人體真皮成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號(hào)CM-H103）；CCK8試劑盒購(gòu)自Biosharp公司（貨號(hào)BS350A）；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司（貨號(hào)S0033S）；抗Cleaved Caspase-3抗體購(gòu)自CST公司（貨號(hào)9664S）；山羊抗兔IgG 594購(gòu)自中杉金橋公司（貨號(hào)ZF-0516）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；超凈工作臺(tái)（Airtech）；倒置熒光顯微鏡（Nikon）；酶標(biāo)儀（Tecan）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

HSF細(xì)胞培養(yǎng)于人體真皮成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，條件為37℃，5%CO2，傳代時(shí)，先使用移液器吸去舊培養(yǎng)基，隨后使用無(wú)菌PBS清洗2次，再加入適量的0.25%的胰酶，37℃孵育1分鐘后終止消化，將皿底/瓶底的細(xì)胞吹打下來(lái)，取適量細(xì)胞傳代至其他培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板中。

1.2.2 CCK8細(xì)胞活力檢測(cè)

將5×103個(gè)細(xì)胞傳代至96孔板中培養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行加藥處理（篩選過(guò)氧化氫濃度時(shí)，使用200、400、600、800、1000μM濃度的過(guò)氧化氫處理細(xì)胞3小時(shí)；篩選人參皂苷Rb1濃度時(shí)，先使用0～1000μM等9個(gè)濃度的人參皂苷Rb1預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)，隨后再使用600μM過(guò)氧化氫處理細(xì)胞3小時(shí)），處理結(jié)束后，為避免培養(yǎng)基中所含物質(zhì)對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的影響，將96孔板中的培養(yǎng)基替換為100μl新的培養(yǎng)基，隨后每孔加入5μl CCK8溶液，將培養(yǎng)板放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘后，使用酶標(biāo)儀450nm吸光值進(jìn)行波長(zhǎng)測(cè)定，并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.3 DCFH-DA活性氧檢測(cè)

將適量細(xì)胞傳代至共聚焦皿中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加藥處理過(guò)后，棄掉培養(yǎng)基；使用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶1000的比例稀釋DCFH-DA探針，并將適量稀釋后的探針加入到共聚焦皿中，加

入量以蓋住所有細(xì)胞面積為宜，隨后將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30分鐘，完成后使用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次，隨后直接使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察與圖片拍攝。

1.2.4 Caspase-3免疫熒光染色

使用4%多聚甲醛溶液固定加藥處理后的細(xì)胞（處理方法見1.2.1）15分鐘，隨后使用PBS洗滌3次；然后使用0.02%TritonX-100溶液透化細(xì)胞15分鐘并使用PBS洗滌3次，使用10%山羊血清溶液于室溫下封閉細(xì)胞1小時(shí)，4℃過(guò)夜孵育一抗（Caspase-3稀釋比例為1∶400，使用PBS稀釋）。第二天，將細(xì)胞從4℃冰箱取出，室溫下復(fù)溫30分鐘后，使用PBS洗滌3次，隨后于避光室溫下孵育熒光二抗1小時(shí)（二抗稀釋比例為1∶400，使用PBS稀釋），孵育后，使用PBS清洗3次后封片，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍攝圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖。數(shù)據(jù)以表示，采用雙尾t檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)間差異，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 不同處理下的HSF細(xì)胞活力測(cè)定

2.1.1 不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)HSF細(xì)胞的影響

由于皮膚衰老時(shí)伴隨著細(xì)胞氧化應(yīng)激的出現(xiàn)，因此細(xì)胞氧化應(yīng)激模型成為研究皮膚衰老的常用模型之一。我們采用過(guò)氧化氫處理HSF細(xì)胞，從而構(gòu)建HSF細(xì)胞氧化衰老模型。我們使用了不同濃度的過(guò)氧化氫處理HSF細(xì)胞，結(jié)果顯示，較低濃度的過(guò)氧化氫（200μM與400μM）處理細(xì)胞時(shí)并未對(duì)細(xì)胞造成明顯影響，而當(dāng)濃度提升至600μM，處理3小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變并出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1與圖3A,B）,隨著濃度的增大，細(xì)胞死亡過(guò)于嚴(yán)重?zé)o法進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，因此我們選擇濃度600μM過(guò)氧化氫作為構(gòu)建模型的最佳濃度，并進(jìn)行下一步的研究。

圖1：過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞衰老模型的建立

2.1.2 不同濃度的人參皂苷Rb1對(duì)過(guò)氧化氫毒性的拯救作用

在確立了過(guò)氧化氫的毒性后，我們進(jìn)一步探究人參皂苷Rb1是否可以拯救HSF細(xì)胞氧化衰老模型。我們使用不同濃度的人參皂苷Rb1預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)后，再使用600μM過(guò)氧化氫繼續(xù)處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1濃度提升至250μM時(shí)對(duì)過(guò)氧化氫所帶來(lái)的氧化毒性有一定的緩解作用，而500μM的人參皂苷Rb1便可顯著抵抗過(guò)氧化氫的毒性（圖2與圖3C）。這提示人參皂苷Rb1具有一定的抗氧化作用，從而可以抵御過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的影響。

圖2：人參皂苷Rb1抗氧化作用的探究

圖3：不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞形態(tài)

2.2 人參皂苷Rb1可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平

為了進(jìn)一步驗(yàn)證人參皂苷Rb1的抗氧化性，我們分別檢測(cè)了對(duì)照組，過(guò)氧化氫處理組與過(guò)氧化氫和人參皂苷Rb1共處理組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。熒光探針DCFH-DA本身不自帶任何熒光，當(dāng)其穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，可以被酯酶水解生成DCFH,而細(xì)胞內(nèi)的ROS可以將DCFH氧化為帶有熒光的DCF，因此細(xì)胞內(nèi)熒光的強(qiáng)弱即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。由于600μM過(guò)氧化氫處理細(xì)胞3小時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞有較多死亡，不利于觀察，因此我們選擇縮短處理時(shí)間，檢測(cè)細(xì)胞中ROS變化。結(jié)果顯示，當(dāng)使用600μM過(guò)氧化氫處理2小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量急劇上升，而500μM人參皂苷Rb1預(yù)處理2小時(shí)可以降低由過(guò)氧化氫造成的ROS過(guò)量生成（圖4），從而避免細(xì)胞氧化應(yīng)激的出現(xiàn)，這為人參皂苷Rb1的抗氧化作用提供了直接證據(jù)。

圖4：不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞ROS含量測(cè)定

2.3 人參皂苷Rb1可以抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

最后，為了探索人參皂苷Rb1影響細(xì)胞存活的機(jī)制，我們使用抗Cleaved Caspase-3抗體進(jìn)行免疫熒光染色觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示過(guò)氧化氫處理2h導(dǎo)致細(xì)胞核中的Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)，即誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而人參皂苷Rb1預(yù)處理后可顯著抑制凋亡的發(fā)生，結(jié)果證實(shí)了人參皂苷Rb1具有明顯的抗細(xì)胞凋亡的作用（圖5），保護(hù)細(xì)胞使其繼續(xù)存活。

圖5：不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞凋亡檢測(cè)

3 討論

皮膚衰老是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其伴隨著含水量降低，新陳代謝減慢，免疫力下降等多個(gè)過(guò)程。皮膚衰老的特征是失去彈性、松弛、出現(xiàn)皺紋和粗糙的外觀等[12]。這一老化過(guò)程伴隨著皮膚細(xì)胞的表型改變以及細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白和彈性蛋白的結(jié)構(gòu)和功能改變以及炎癥的增多等[13],[14]。皮膚是人體最大的器官，是隔離身體與外界的屏障，防止人體水分的流失以及微生物的感染；皮膚衰老不僅會(huì)影響人的外貌儀表，其健康屏障的生理功能也會(huì)因此受損，致使免疫力降低進(jìn)而引發(fā)疾病等[15]，因此，抵御或逆轉(zhuǎn)皮膚衰老不僅是改善外在容貌的問(wèn)題，又是一個(gè)意義深遠(yuǎn)但又十分艱巨的健康維持問(wèn)題。在關(guān)于皮膚衰老機(jī)制的探索研究中，ROS過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原失衡是皮膚衰老的主要因素之一[16-18]。ROS是機(jī)體內(nèi)或者自然環(huán)境中由氧組成，含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞內(nèi)部的線粒體電子呼吸鏈、過(guò)氧化物酶體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白在行使生理功能時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量ROS[19]；而皮膚作為人體與外界直接接觸的器官，又會(huì)受到一些外部因素的影響，例如紫外線的照射會(huì)加劇ROS的過(guò)量生成，造成皮膚“光老化”[20-22]。這些內(nèi)外因素共同作用生成的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞的生物膜系統(tǒng)，誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，并且ROS可以激活MAPK途徑，隨后增加MMP的產(chǎn)生，從而降解膠原，最終導(dǎo)致皮膚的衰老[23],[24]，因此抗氧化，即使用還原劑中和過(guò)量生成的ROS是抵抗皮膚衰老的常用策略。

但值得令人注意的是，一些研究人員認(rèn)為，抗氧化劑的過(guò)量補(bǔ)充可能有害，并產(chǎn)生不良副作用。特別是在營(yíng)養(yǎng)良好的人群中，抗氧化劑的最佳來(lái)源應(yīng)該源自飲食，或者一些中藥等天然的抗氧化物質(zhì)，而不是專用的抗氧化補(bǔ)充劑等藥物?？寡趸委煹哪康氖腔謴?fù)氧穩(wěn)態(tài)，把活性氧水平降低到健康細(xì)胞的水平，而不是完全將其消除，抗氧化治療才會(huì)對(duì)衰老(包括皮膚衰老)有幫助[25,26]。人參皂苷Rb1是野山參、西洋參等所含含量較高、功能較強(qiáng)的人參皂苷之一，在目前的研究中，人參皂苷Rb1被證實(shí)具有多種功效，例如抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗炎癥等，但尚未有關(guān)于人參皂苷Rb1抗皮膚氧化的研究報(bào)道。值得注意的是，一項(xiàng)研究通過(guò)小鼠模型證明了人參皂苷Rb1在緩解修復(fù)燒傷皮膚以及抵御紫外誘導(dǎo)慢性皮膚光老化的重要作用[27]，這更加證實(shí)了人參皂苷Rb1在皮膚領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。

在本研究中，我們旨在探究天然化合物人參皂苷Rb1是否具有作為抵抗皮膚衰老還原劑的潛能。使用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化損傷的細(xì)胞是衰老研究的常用方法之一[28,29]，我們首先使用了不同濃度過(guò)氧化氫處理HSF細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)過(guò)氧化氫濃度達(dá)到500μM時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡現(xiàn)象，因此我們采用該處理?xiàng)l件建立HSF細(xì)胞氧化衰老模型，隨后我們發(fā)現(xiàn)500μM人參皂苷Rb1預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)可以顯著緩解過(guò)氧化氫的細(xì)胞毒性，因此我們初步認(rèn)為人參皂苷Rb1的抗氧化作用可以使HSF細(xì)胞免受過(guò)氧化氫的氧化毒性，為了驗(yàn)證我們的猜想，我們使用熒光探針檢測(cè)了各組細(xì)胞中ROS的含量，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1預(yù)處理組的細(xì)胞中ROS含量的確明顯低于未預(yù)處理組，因此我們得出結(jié)論，在HSF細(xì)胞中，人參皂苷Rb1通過(guò)抗氧化作用影響過(guò)氧化氫毒性，該結(jié)論為人參皂苷Rb1的抗氧化性在皮膚抗氧化防治中提供了堅(jiān)實(shí)的證據(jù)，最后，我們通過(guò)免疫熒光染色證實(shí)了人參皂苷Rb1的抗凋亡作用。綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明了人參皂苷Rb1的抗氧化作用，揭示了其在皮膚衰老干預(yù)的應(yīng)用前景，為后續(xù)相關(guān)人參產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。