王 樂,柳成林,韓文靜,李旭辰,侯麗慧,陳 欣,于秀華*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.第964醫(yī)院，長春 130021；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021）

補(bǔ)腎活血顆粒是一種復(fù)方制劑，由丹參、赤芍等中藥組成,以各味藥材的理化性質(zhì)和藥理作用為研究基礎(chǔ)，同時(shí)考慮到臨床要求及生產(chǎn)制備的可行性等因素，對(duì)其工藝路線進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。經(jīng)查閱資料顯示，制成顆粒劑能最大限度保持原方功效。中藥顆粒劑制備工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，攜帶方便[1]，為了更好發(fā)揮藥物性能,同時(shí)便于患者服用，將其制成顆粒劑，根據(jù)對(duì)處方中中藥化學(xué)成分及理化性質(zhì)的分析，研究采用丹參、當(dāng)歸等醇提、剩余丹參、赤芍等水煎醇沉提取工藝技術(shù)條件，醇提以提取物中丹酚酮IIA、蒼術(shù)素的含量為考察指標(biāo)，采用多因素多水平設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)選。剩余丹參、赤芍等也采用正交方法選出最佳條件，以樣品中丹酚酸B、芍藥苷、阿魏酸的含量為考察指標(biāo)，結(jié)合藥物中有效成分的理化性質(zhì)，選取水為提取溶劑，進(jìn)行水煎提取工藝研究。本文將補(bǔ)腎活血顆粒工藝進(jìn)行優(yōu)化,既為該方開發(fā)成醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑提供依據(jù)[2]，又為其藥物性能開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津，SPD檢測(cè)器）；C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；AMW220D分析天平（日本島津）；BSA224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；超聲波清洗儀器（昆山合創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

丹參酮ⅡA對(duì)照品（110805-200508）、蒼術(shù)素對(duì)照品（111924-201605）、芍藥苷對(duì)照品（110736-200934）、丹酚酸B對(duì)照品（120976-200503）、阿魏酸對(duì)照品（0773-9910）均購于中國食品藥品生物檢定研究院；甲醇、乙腈及其他試劑均為分析純，純水、超純水（長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心）。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA、蒼術(shù)素的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取定量標(biāo)準(zhǔn)品置棕色量瓶中配置成以下濃度的混合溶液：丹參酮ⅡA(30μg/ml)、蒼術(shù)素(70μg/ml)，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

按照正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，將容量瓶內(nèi)各藥材醇提溶液搖勻，精密吸取5ml至錐形瓶，蒸干，加入用移液管精準(zhǔn)稱量的25ml甲醇，使用分析天平對(duì)其進(jìn)行稱重，放入超聲波清洗器中超聲30分鐘，再次用分析天平稱定，用膠頭滴管緩慢滴加甲醇進(jìn)行補(bǔ)重，使重量與之前稱定重量一致，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20μl，注入儀器，根據(jù)峰面積積分值和進(jìn)樣量繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

通常情況下，于朦朧習(xí)慣于做一個(gè)傾聽者和安慰別人的人，朋友們也喜歡找他傾訴，安慰別人是不求回報(bào)的，但安慰別人安慰得多了，自然也會(huì)得到別人的安慰，這是一個(gè)雙向的過程?！盾庌@劍之漢之云》拍攝時(shí)，于朦朧從高處意外摔傷，腿部骨折，說起這段受傷經(jīng)歷，他第一時(shí)間的反應(yīng)不是傷痛多么厲害，而是“我躺在病床上，也還是感受到世界深深的善意，身邊的朋友和同事都來看我，當(dāng)時(shí)就覺得很溫暖”。

表1 丹參酮‖A、蒼術(shù)素線性回歸方程

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，精密吸取10μl，選擇不同時(shí)間、于不同儀器、不同人員進(jìn)行測(cè)定，記錄圖譜。丹參酮ⅡA RSD值0.08%、蒼術(shù)素RSD為0.09%。RSD平均值都小于1%，試驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)照品溶液精密度較好。

2.2 芍藥苷、丹酚酸B、阿魏酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

采用C18（Apollo-C18，250mm×4.6mm）色譜柱；流動(dòng)相為0.2%磷酸（B）-乙腈（A）梯度洗脫(0-10min,15%A;10-20min,15-33%A;30-35min,20%-40%A;33-22min,40%-44%A;40-50min,22%-15%A)，檢測(cè)波長為286nm、230nm、320nm，流速為1.0ml/min。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取定量標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，配置成以下濃度的溶液：丹酚酸B(30μg/ml)、芍藥苷（400μg/ml)、阿魏酸(5μg/ml)，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱定上述9份提取物粉末各0.3g，放于錐形瓶，加入30ml甲醇，稱重，超聲30分鐘，再次稱定，補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品溶液5.0、10.0、12.0、15.0、20.0、25.0μl，注入儀器，根據(jù)峰面積積分值和進(jìn)樣量計(jì)算回歸方程，詳見表2，結(jié)果表明，線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，精密吸取10μl，于不同時(shí)間、不同儀器、不同人員進(jìn)行測(cè)定，記錄HPLC圖譜。RSD值分別為芍藥苷2.97%、丹酚酸B0.69%、阿魏酸0.22%。試驗(yàn)結(jié)果表明：精密度較好。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 醇提工藝考察

丹參（處方一半的量）、當(dāng)歸等藥材，采用正交法優(yōu)選最佳醇提條件：考察因素為乙醇濃度（A）、加醇量（B）、提取次數(shù)（C）、提取時(shí)間（D），每個(gè)因素選取三個(gè)水平，乙醇濃度分別為70%、80%、95%，加醇量分別為4、6、8倍，提取次數(shù)為1、2、3次，提取時(shí)間分別為1、1.5、2h，以丹酚酮IIA、蒼術(shù)素含量為評(píng)估指標(biāo)。按處方比例稱取9份藥材，按上述試驗(yàn)，提取液濾過后濃縮并定容于100ml量瓶,備用。按照上述三因素四水平生成正交表，計(jì)算結(jié)果。蒼術(shù)素含量（mg/g生藥）分 別 為4.3926、2.1624、5.9729、8.5341、9.0506、7.7666、7.2777、3.1846、4.6490，丹參酮ⅡA含量（mg/g生藥）分別為0.4938、4.8049、7.5451、4.8536、6.3142、0.3847、1.7650、0.3137、0.5594。

以丹參酮ⅡA含量、蒼術(shù)素含量作為指標(biāo)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如下文所示，丹參酮ⅡA含量正交結(jié)果分析中A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1，蒼術(shù)素含量正交結(jié)果分析中A2＞A1＞A3，B1＞B2＞B3，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1。各因素影響順序均為提取次數(shù)（C）＞乙醇濃度（A）＞提取時(shí)間（D）＞加醇量（B），方差分析結(jié)果可知乙醇濃度（A）、加醇量（B）、提取次數(shù)（C）、提取時(shí)間（D）的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，由此可以看出，對(duì)丹參酮ⅡA含量影響較大的是提取次數(shù)，其他因素對(duì)丹參酮ⅡA顯著性差異影響很小，而對(duì)蒼術(shù)素含量影響較大的是乙醇濃度，其次為提取次數(shù)。從實(shí)際的生產(chǎn)角度出發(fā)，擬定出最優(yōu)工藝為A2B2C3D3，即6倍量80%乙醇提取3次，每次2個(gè)小時(shí)。

2.3.2 水提工藝考察

丹參（處方量的一半）、赤芍等藥材，可有效去除葉綠素等極性小的成分，最大限度保留活性成分。用正交法優(yōu)選：以加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)、煎煮次數(shù)(C)、空白(D)為考察因素，每個(gè)因素選取三個(gè)水平，分別為加水量4倍、6倍、8倍，煎煮時(shí)間1、1.5、2小時(shí)，煎煮次數(shù)1、2、3次，考察樣品中丹酚酸B、芍藥苷、阿魏酸的含量以及出膏率。

按處方比例稱取9份藥材，每份65g。按表6實(shí)驗(yàn)，將水煎液濾過蒸干，減壓干燥，取出，稱重，粉碎，計(jì)算出膏率。得到出膏率分別為17.8、30.21、36.34、29.32、37.02、22.73、36.02、23.58、34.42，阿魏酸含量（mg/g生藥）分別為0.24、0.2、0.21、0.36、0.17、0.29、0.16、0.12、0.37，芍藥苷含量 （mg/g生藥）分別為33.56、48.09、54.79、51.84、46.31、40.29、65.37、46.37、63.57，丹酚酸B含量（mg/g生藥）分別為5.67、6.53、8.92、7.73、8.2、6.3、11.01、6.68、9.18。

以出膏率、芍藥苷含量、丹酚酸B、阿魏酸含量作為指標(biāo)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如下文所示，出膏率的正交結(jié)果分析中A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，芍藥苷的正交結(jié)果分析中A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1,丹酚酸B的正交結(jié)果分析中A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1,阿魏酸的正交結(jié)果分析中A2＞A1=A3，B3＞B1＞B22，C2＞C1＞C3，出膏率的各因素影響順序?yàn)椋杭逯蟠螖?shù)（C）＞煎煮時(shí)間（B）＞加水量(A），芍藥苷、丹酚酸B的各因素影響順序?yàn)椋杭逯蟠螖?shù)（C）＞加水量(A）＞煎煮時(shí)間（B）。方差分析結(jié)果可知加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)、煎煮次數(shù)(C)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，其他因素對(duì)提取時(shí)間及加水量對(duì)活性成分顯著性差異影響很小。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合方差分析最終確定工藝為A3B1C2，即8倍量水提取2次，每次1個(gè)小時(shí)為最佳。

3 討論

3.1 劑型的選擇

在現(xiàn)代中藥發(fā)展的進(jìn)程中，中藥顆粒劑在人類的生產(chǎn)生活中逐漸被廣泛應(yīng)用。其特色在于劑量相對(duì)較小且質(zhì)量穩(wěn)定，便于患者攜帶、服用[3]，顆粒劑將原中藥經(jīng)典方劑的藥性、藥效進(jìn)行保留，且相對(duì)于湯劑相比較其優(yōu)點(diǎn)在于不需要煎煮可直接沖開服用、量少且迅速在體內(nèi)發(fā)揮藥效[4]。傳統(tǒng)湯劑煎煮耗費(fèi)時(shí)間、程序繁瑣、保質(zhì)期短、對(duì)保存條件比較嚴(yán)格，顆粒劑恰好能夠完善傳統(tǒng)劑型中存在的缺點(diǎn)。中藥配方顆粒劑大大滿足了現(xiàn)代人們的生活需求，近些年來，中藥配方顆粒在我國發(fā)展迅速，在臨床中被廣泛使用，逐漸替代了傳統(tǒng)中藥飲片[5]，在工業(yè)生產(chǎn)中也具有相當(dāng)好的發(fā)展前景。與傳統(tǒng)劑型比較，劑量精準(zhǔn)藥效吸收迅速，且作用相對(duì)較緩[6]，制劑過程中又可加入矯味劑改善口感，便于患者中年幼的孩童和年邁的老人服用，故選擇采用顆粒劑劑型。顆粒劑不但提升了補(bǔ)腎活血顆粒處方中藥的藥物性能,劑型上來講更有利于攜帶和服用,某種程度上來講大大的為患者們提供了便利,同時(shí)也給補(bǔ)腎活血顆粒帶來更廣闊的發(fā)展前景。

3.2 工藝路線的確定

補(bǔ)腎活血顆粒的處方為中藥復(fù)方制劑，由丹參、赤芍等中藥所組成。丹參有活血化瘀的功效，丹參酮ⅡA是丹參中有效成分,藥理作用范圍廣[7，8]，蒼術(shù)素作為蒼術(shù)的有效成分之一，其藥理活性表現(xiàn)在抗炎、抗腫瘤、利尿等方面[9，10]，根據(jù)各味藥材的理化性質(zhì)和藥理作用，首先將1/2丹參、當(dāng)歸、益母草、蒼術(shù)、香附、石菖蒲、焦山楂，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選乙醇提取條件，提取物中最具有代表性的丹酚酮IIA、蒼術(shù)素進(jìn)行考察。

丹酚酸B為水溶性成分，在丹參中含量最多[11，12，13]。阿魏酸易溶于水是川芎酚酸類活性成分的代表性物質(zhì)[14]，是一種功能性酚酸存在于植物細(xì)胞壁中[15]。芍藥苷是赤芍的主要成分，是一種水溶性單萜類糖苷[16，17]，其藥理作用于為抗炎，神經(jīng)系統(tǒng)等方面。根據(jù)各藥物理化性質(zhì)，對(duì)樣品中丹酚酸B、芍藥苷、阿魏酸含量進(jìn)行分析。設(shè)計(jì)工藝流程將1/2丹參、赤芍、牛膝、茯苓、續(xù)斷、熟地、柏子仁、澤蘭采用水煎醇沉工藝，有效去除葉綠素等極性小的成分，最大限度保留藥物的活性成分。

3.3 提取工藝技術(shù)條件的研究

藥品的質(zhì)量和療效與藥物有效活性物質(zhì)的提取息息相關(guān)。藥物的有效成分提出的溶解度高，藥品的質(zhì)量會(huì)得到提升，藥效也會(huì)更好。考慮到處方中各藥材的理化性質(zhì)，藥理作用，研究將丹參、當(dāng)歸等醇提、剩余丹參、赤芍等水煎醇沉提取工藝技術(shù)條件進(jìn)行考察，通過醇提取法和水煎煮法提取補(bǔ)腎活血顆粒處方中有效活性物質(zhì)，通過正交試驗(yàn)選取最優(yōu)工藝，結(jié)果顯示，醇提的最佳工藝為6倍量80%乙醇提3次，每次2h。水煎煮的最佳工藝為8倍水提2次，每次1h。該方法簡(jiǎn)單可行，所得顆粒質(zhì)量穩(wěn)定。在該條件下，藥材可以被利用更加完全，得到的藥物有效成分提取率達(dá)到最高，可以更大程度的發(fā)揮藥物的療效。本研究不但使補(bǔ)腎活血顆粒更好滿足中醫(yī)臨床用藥需求，也為其在工業(yè)生產(chǎn)中開創(chuàng)了良好的應(yīng)用。