趙天宇，李星辰，王法宇，何 蕊，李慶杰*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130012；3.北京醫(yī)藥集團(tuán)職工大學(xué)，北京 100079）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）為獼猴桃科獼猴桃屬（Actinidia）的大型落葉藤本植物，生于混交林或水分充足的雜木林中，在東北地區(qū)俗稱軟棗子[1]。我國(guó)境內(nèi)分布廣泛，中國(guó)從最北的黑龍江岸至南方廣西境內(nèi)的五嶺山地都有分布。軟棗獼猴桃果實(shí)味道鮮美，富含維生素C，廣泛用于生食、釀酒、加工蜜餞果脯等，其天然產(chǎn)量大、經(jīng)濟(jì)意義重大，并且有悠久的應(yīng)用歷史[2]。其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分豐富，具有一定的營(yíng)養(yǎng)與保健功能。迄今對(duì)軟棗獼猴桃栽培與產(chǎn)品加工、化學(xué)成分與生物活性研究的有關(guān)文獻(xiàn)較多，但特征指紋圖譜的研究未見報(bào)道，為了更全面控制軟棗獼猴桃質(zhì)量，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用UPLC法建立了軟棗獼猴桃的特征指紋圖譜分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀，含G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G4212B DAD檢測(cè)器（美國(guó)，Agilent公司）；JM-B2102型電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FA1605型電子天平（上海橫平儀表廠）；KH-100B型超聲波清洗器（昆山和創(chuàng)超聲儀器有限公司)。SVEA A132V1 C18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）。

1.2 試藥

熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：110742-201622），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為自制純水；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

收集不同產(chǎn)地的軟棗獼猴桃13批，將各產(chǎn)地編號(hào)為S1～S13，其中，S1（批號(hào)：200901）、S2（批號(hào)：200902）產(chǎn)地為安圖縣二道白河鎮(zhèn)；S3（批號(hào)：200903）、S4（批號(hào)：200904）產(chǎn)地為蛟河市；S5（批號(hào)：200905）、S6（批號(hào)：200906）、S7（批號(hào)：200907）產(chǎn)地為和龍市；S8（批號(hào)：200908）、S9（批號(hào)：200909）、S10（批號(hào)：200910）產(chǎn)地為吉林市；S11（批號(hào)：200911）、S12（批號(hào)：200912）、S13（批號(hào)：200913）產(chǎn)地為靖宇縣。經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院南敏倫教授鑒定為獼猴桃科植物軟棗稱猴桃Actinidia arguta(Sieb.&Zucc)Planch.ex Miq的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件

色譜柱：SVEA A132V1 C18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脫：0～2min，3%A；2～4min，3%～5%A；4～6 min，5%～8%A；6～8 min，8%～15%A；8～10 min，15%～25%A；10～15 min，25%～90%A；15～18 min，90%～95%A；18～20 min，95%～3%A；20～30 min，3%A；流速：0.3ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；進(jìn)樣量5μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取適量熊果酸對(duì)照品，精密稱定5.23mg，置于5ml量瓶中，加入甲醇振搖使溶解，后加甲醇定容至刻度，制成每1ml含有熊果酸1.046mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取樣品粉末5.0g，精密稱定，置于250ml索氏提取器中，加甲醇加熱回流提取5h，冷卻，搖勻，濾過，水浴濃縮，定容至2ml，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)[3,4]

取S1號(hào)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系》（2012版），計(jì)算相似度，相似度均為1.000。選用熊果酸色譜峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值，共有峰相對(duì)峰面積RSD≤1.2%，相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.5%，表明儀器精密度良好，符合檢測(cè)需求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取軟棗獼猴桃（S1）樣品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖。將其導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系》（2012版），得到各個(gè)樣品的相似度，結(jié)果顯示相似度均大于0.999。以熊果酸峰為參照峰，分別計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值。結(jié)果表明，共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD均≤2.0%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取S1號(hào)樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)，記錄色譜圖，將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系》（2012版），得到各個(gè)樣品的相似度，結(jié)果顯示均大于0.999。以熊果酸峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積、相對(duì) 保留時(shí)間的RSD，均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 軟棗獼猴桃UPLC指紋圖譜的建立[5,6]

取13批軟棗獼猴桃，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照 品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄UPLC色譜圖。樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 系統(tǒng)》（2012版）軟件進(jìn)行分析，選擇峰面積較大且分離度較好的S1號(hào)樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正，色譜峰全峰自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法(時(shí)間窗寬度為0.1)生成軟棗獼猴桃對(duì)照特征圖譜。軟棗獼猴桃UPLC的對(duì)照品圖譜及13批軟棗獼猴桃樣品特征圖譜的匹配圖分別見圖1、2。熊果酸的出峰時(shí)間居中，峰面積較大，分離度較好，因此選取該峰作為參照峰(S)，計(jì)算13批軟棗獼猴桃樣品各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，RSD均≤0.32%，表明所得軟棗獼猴桃指紋圖譜可信度較高。

2.5 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

將各個(gè)批次的軟棗獼猴桃指紋圖譜分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件，對(duì)各批次樣品的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。從圖1可以看出13批軟棗獼猴桃的整體圖貌基本一致。13個(gè)產(chǎn)地的軟棗獼猴桃的相似度達(dá)到了0.887，有較好的相似性，詳見表1。

表1 樣本相似度評(píng)價(jià)

圖1 對(duì)照品熊果酸的色譜圖

圖2 13批次軟棗獼猴桃提取物的指紋圖譜

2.6 軟棗獼猴桃中熊果酸含量

以熊果酸對(duì)照品為指標(biāo)，用UPLC測(cè)定13批軟棗獼猴桃中熊果酸的含量，其平均含量為0.0864mg/g，13批樣品含量RSD值為2.77%，詳見表2。

表2 13批軟棗獼猴桃中熊果酸含量測(cè)定

3 討論

3.1 波長(zhǎng)選擇

考察210、230、280、254、320 nm波長(zhǎng)下的各色譜峰，210 nm波長(zhǎng)檢測(cè)到的色譜峰信息較全面，且各色譜峰的峰形及分離度較好，因此最終選擇210 nm作為軟棗獼猴桃UPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相選擇

嘗試選擇乙腈-水、甲醇-水2種流動(dòng)相進(jìn)行UPLC梯度洗脫分析，結(jié)果顯示，甲醇-水所得色譜峰較多，但部分峰的峰形、分離度較差，乙腈-水所得峰形、主要成分分離度較好，故選擇乙腈-水作為軟棗獼猴桃UPLC分析測(cè)定的流動(dòng)相。

3.3 采集的13個(gè)不同批次的軟棗獼猴桃雖有差異，但相似度均≥0.88，可作為軟棗獼猴桃的質(zhì)量控制方法。以熊果酸含量為指標(biāo)，測(cè)定13批樣品中熊果酸的平均含量為0.0864mg/g，RSD值小于3%。

綜上所述，本文采用UPLC特征指紋圖譜分析方法初步建立了滿藥軟棗獼猴桃質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)有關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)一步研究開發(fā)滿藥軟棗獼猴桃有一定參考作用。