馬明，王玉堂，渠海

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

在體外診斷（in vitro diagnosis,IVD）行業(yè)中免疫診斷是極其重要的一部分，其主要基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，用于檢測(cè)腫瘤、肝炎、病毒、激素等［1-2］。目前我國(guó)的免疫診斷技術(shù)的主流是酶聯(lián)免疫和化學(xué)發(fā)光兩種?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)較酶聯(lián)免疫技術(shù)具有靈敏性高、測(cè)試速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)使得化學(xué)發(fā)光正在取代酶聯(lián)免疫成為更主要的檢測(cè)方法［3-4］。

國(guó)內(nèi)IVD 企業(yè)想要在市場(chǎng)上立足，并逐步替代外國(guó)廠商產(chǎn)品，產(chǎn)品質(zhì)量是這一切的重中之重。在關(guān)于質(zhì)量的一系列指標(biāo)中，如何保證產(chǎn)品能夠在運(yùn)輸、存放、使用過(guò)程的狀態(tài)一致一直是一個(gè)很難解決的問(wèn)題。在磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒中，磁微粒混懸液組分是重要的組分，也是最不容易保持穩(wěn)定性的成分。這是因?yàn)槠洳粌H要保證磁微?；鞈乙涸诖娣胚^(guò)程中的不發(fā)生嚴(yán)重凝集和板結(jié)，也需要防止結(jié)合的抗體或抗原在會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生變化［5］。

磁微粒是由是一種聚苯乙烯包裹的γ-Fe2O3的復(fù)合物，雖然表面進(jìn)行改性帶有羧基和氨基基團(tuán)，但其含量比較少，聚苯乙烯具有很強(qiáng)的疏水作用力，因此磁珠在整個(gè)包被過(guò)程中會(huì)對(duì)蛋白具有很強(qiáng)的吸附性，磁珠與蛋白之間除了化學(xué)連接外還存在弱吸附和多重吸附［6］。這部分吸附雖然可能會(huì)提高信號(hào)值，但在包被后會(huì)對(duì)穩(wěn)定性起到負(fù)面效果，在包被后進(jìn)行實(shí)時(shí)放置和熱加速處理過(guò)程中，弱吸附與多層吸附的抗體會(huì)緩慢脫落，導(dǎo)致其信號(hào)值升高或者降低，從而影響其穩(wěn)定性和精密性。目前針對(duì)磁珠表面非特異性吸附有較多的研究思路，例如可以加入表面活性劑，但表面活性劑有一定的缺點(diǎn)，其易于和蛋白形成膠束且后續(xù)無(wú)法將其除去，因此需要對(duì)不同的表面活性劑進(jìn)行篩選。通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)資料查閱，我們發(fā)現(xiàn)精氨酸在抑制蛋白吸附這方面有一定的效果［7-8］。因此可以通過(guò)精氨酸以及精氨酸復(fù)配表面活性劑將這部分抗體清除以解決磁珠包被后穩(wěn)定性問(wèn)題。本文對(duì)甲胎蛋白（AFP）磁微粒試劑盒中的磁微粒試劑進(jìn)行研究以提出一種可以簡(jiǎn)單提高穩(wěn)定性性能的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 磁微粒（Merck 公司，羧基磁珠，10%質(zhì)量濃度）；包被抗體（鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）（Sigma 公司）；N-羥基丁二酰亞胺（NHS）（Sigma 公司）；磁微粒偶連緩沖液0.1 mol/L pH=7.4 MES 緩沖液；磁微粒保存液：緩沖液0.1 mol/L pH=7.4 PBS 緩沖液含1%牛血清蛋白（BSA）；乙醇胺（Aladdin 公司）；L-精氨酸（L-Arg）（Sigma 公司）；3-［（3-膽酰胺基丙基）二甲基銨基］-1-丙磺酸鹽（CHAPS）（Aladdin 公司）；十二烷基磺酸鈉（SDS）（Sigma 公司）；十二烷基聚氧乙烯（23）醚（BRIJ-35）（Sigma 公司）。

1.1.2 主要儀器 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀AutoLumo A2000 Plus（安圖生物）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器材有限公司）；振蕩器（TOPSCIEN 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 磁微粒試劑包被方法 在4 mL 玻璃瓶中分別加入0.1 mL 10%質(zhì)量濃度羧基磁珠，1 mL 偶連緩沖液，震蕩混勻5 min 后磁吸分離并重復(fù)3 遍進(jìn)行清洗，而后分別加入0.3 mL 0.1 mol/L EDC 溶液與0.3 mL 0.1 mol/L NHS 溶液（注：以偶連緩沖液進(jìn)行溶解），室溫震蕩反應(yīng)1 h；洗2 次后加入0.9 mL 磁微粒偶聯(lián)緩沖液和0.6 mg AFP 抗體，并室溫震蕩反應(yīng)2 h。最后加入乙醇胺60 μL 繼續(xù)反應(yīng)30 min，使用磁微粒保存液磁分離清洗3 次后定容至9 mL，2～8℃儲(chǔ)存。

1.2.2 磁微粒試劑穩(wěn)定性洗脫處理方法 對(duì)測(cè)試磁微?；鞈乙哼M(jìn)行磁分離后加入等體積的洗脫液，而后對(duì)洗脫條件進(jìn)行調(diào)整，而后采用磁微粒保存液進(jìn)行3 次清洗后重新定容到初始濃度。洗脫條件為：①采用超聲清洗（15 min）與振蕩器震蕩（15 min）；②震蕩時(shí)間對(duì)比；③震蕩溫度對(duì)比；④精氨酸與CHAPS 復(fù)配對(duì)比；⑤精氨酸與BRIJ-35復(fù)配對(duì)比；⑥精氨酸與SDS 復(fù)配對(duì)比。

1.2.3 測(cè)試模式 由機(jī)器按照上機(jī)文件進(jìn)行測(cè)試，每次加入25 μL 校準(zhǔn)品（濃度值為0 μIU/mL、10 μIU/mL、50 μIU/mL、100 μIU/mL、500 μIU/mL、1 000 μIU/mL）、50 μL 樣品稀釋液、20 μL 磁珠混懸液和100 μL 酶結(jié)合物以及100 μL 底物。具體過(guò)程使用A2000plus 儀器進(jìn)行檢測(cè)，除磁珠混懸液其余均使用該公司在售試劑盒內(nèi)組分。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo) 目前IVD 行業(yè)對(duì)化學(xué)發(fā)光試劑盒的穩(wěn)定性的共識(shí)為在37℃下放置7 d 約等于試劑條件下在2～8℃下存放8～12 個(gè)月，而針對(duì)這一情況本文更進(jìn)一步選擇在37℃下放置10 d 來(lái)考察穩(wěn)定性情況，計(jì)算濃度點(diǎn)發(fā)光值下降率（ROD）（%）=ABS（RLU37℃10d/RLU2～8℃-1）×100%，ROD均值為校準(zhǔn)品各值的平均值，目前業(yè)內(nèi)公認(rèn)ROD值小于10%為合格標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 洗脫方式對(duì)磁微?；鞈乙悍€(wěn)定性影響的結(jié)果

通過(guò)對(duì)比不同洗脫方式，我們發(fā)現(xiàn)超聲洗脫雖然與震蕩洗脫對(duì)于穩(wěn)定性的影響類(lèi)似，但是不論其熱加速后還是熱加速前的信號(hào)值均低于震蕩洗脫，并且長(zhǎng)時(shí)間的超聲并放置一段時(shí)候后容易出現(xiàn)磁微粒凝集，因此可以選擇震蕩洗脫進(jìn)行進(jìn)一步研究。采用15%L-Arg 使用不同洗脫方式對(duì)AFP 項(xiàng)目磁微?；鞈乙旱挠绊懭绫? 所示。

表1 磁微粒混懸液采用不同洗脫方式穩(wěn)定性結(jié)果比較

2.2 洗脫時(shí)間對(duì)磁微?；鞈乙悍€(wěn)定性影響的結(jié)果

洗脫時(shí)間的長(zhǎng)短影響者洗脫效果，對(duì)洗脫15 min 與洗脫12 h 進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)震蕩洗脫12 h，其磁珠混懸的ROD 為10%，基本合格。見(jiàn)表2。

表2 磁微?；鞈乙翰煌瑫r(shí)間穩(wěn)定性結(jié)果比較

2.3 洗脫溫度對(duì)磁微?；鞈乙悍€(wěn)定性影響的結(jié)果

由于與表1、2 所使用的不是同一批包被好的磁微?；鞈乙?，所以可以發(fā)現(xiàn)其冷藏放置的初始值并不相同，而采用37℃震蕩的結(jié)果與常溫震蕩結(jié)果相當(dāng)。且放置一段時(shí)間后上機(jī)混勻出現(xiàn)小顆粒凝集，所以根據(jù)以上條件，可以將洗脫工藝確定為采用振蕩器常溫震蕩過(guò)夜洗滌的方式進(jìn)行洗脫，可以有效提高穩(wěn)定性。以室溫和37℃烘箱進(jìn)行洗脫對(duì)比，結(jié)果如表3 所示。

表3 磁微?；鞈乙翰煌瑴囟确€(wěn)定性結(jié)果比較

2.4 精氨酸復(fù)配表面活性劑對(duì)磁微?；鞈乙悍€(wěn)定性影響的結(jié)果

為了控制非特異性吸附同時(shí)增加洗脫效果，本文選擇了CHAPS、SDS、BRIJ-35 與L-Arg 進(jìn)行復(fù)配測(cè)試，結(jié)果如表4 所示。

依據(jù)表4 的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過(guò)4 種洗脫液洗脫之后5%SDS+15%L-Arg 信號(hào)值最高，而5%CHAPS+15%L-Arg 信號(hào)值最低；但經(jīng)過(guò)10 d 37℃的熱加速放置，發(fā)現(xiàn)5%SDS+15%L-Arg 信號(hào)值降幅較大，即使觀察其信號(hào)值也較低，因此其效果較差，而5%CHAPS+15%L-Arg 熱加速前后變化較小，為以上幾種方案中的最優(yōu)方案。

表4 L-Arg 復(fù)配不同表面活性劑穩(wěn)定性結(jié)果比較

2.5 精氨酸復(fù)配表面活性劑用量對(duì)磁微?；鞈乙悍€(wěn)定性影響的結(jié)果

根據(jù)表4 的分析除了可以得到5%CHAPS+15%L-Arg 具有較為優(yōu)秀的結(jié)果之外，也可以得到5%BRIJ-35+15%L-Arg 信號(hào)值與之相當(dāng)，同時(shí)BRIJ-35 成本較低，可以降低總體的成本，因此針對(duì)其調(diào)控濃度。

如表5 所示，提高了BRIJ-35 的復(fù)配比例，可以發(fā)現(xiàn)其可以提高穩(wěn)定性，但是當(dāng)提高到30%時(shí)雖然ROD 均值較低，但是觀察數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)其校準(zhǔn)品低值信號(hào)值降低而高值提升，說(shuō)明其可能引起了基質(zhì)效應(yīng)。

表5 不同濃度BRIJ-35 穩(wěn)定性結(jié)果比較

3 討論

通過(guò)使用洗脫，可以在不調(diào)整包被工藝與保存液的成分的情況下提高磁微?；鞈乙旱姆€(wěn)定性：采用15%精氨酸與5%CHAPS［9］進(jìn)行復(fù)配對(duì)磁微?；鞈乙哼M(jìn)行等體積置換后，在振蕩器上震蕩反應(yīng)12 h，而后用磁微粒保存液進(jìn)行清洗3 次后重新定容；如果為了降低成本還可以用BRIJ-35 進(jìn)行替換，但是為了達(dá)到同樣的效果需要進(jìn)行調(diào)控。

在包被抗體的過(guò)程中，除了一部分抗體通過(guò)化學(xué)連接在微球表面，還有一部分抗體會(huì)非特異性吸附于微球表面，這部分非特異性吸附的抗體不僅僅會(huì)在存放過(guò)程中脫落，其脫落后的位點(diǎn)還可能吸附其他物質(zhì)從而影響后續(xù)檢測(cè)的進(jìn)行。而精氨酸不僅可以抑制疏水作用［10］，還因其離子特性能對(duì)靜電相互作用產(chǎn)生影響。而且對(duì)精氨酸的結(jié)構(gòu)研究可以推測(cè)部分與聚苯乙烯顆粒芳香側(cè)鏈結(jié)合的抗體可以被精氨酸競(jìng)爭(zhēng)性相互作用而導(dǎo)致有效解吸［11］。

綜上所述，使用精氨酸可以顯著抑制抗體在磁微粒表面吸附。而表面活性劑如CHAPS 可以增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之間的相互作用，BRIJ-35 本身也具有類(lèi)似作用，這使這兩種表面活性劑成為一種適合復(fù)配的試劑。