趙 超， 郭小江， 馮孝傲， 成虹松， 羅小芬， 張峻杰， 程振濤，2*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3. 貴州省草地技術(shù)試驗(yàn)推廣站，貴州 貴陽(yáng) 550025)

近年來(lái)貴州省養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，與此同時(shí)頻繁引種也帶來(lái)某些疫病的流行和感染，其中因長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)引起的呼吸道疾病和蟲(chóng)媒傳染病較為多見(jiàn)。2021年11月24日，貴州省銅仁市某養(yǎng)牛場(chǎng)牛群出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主要特征的疫病，臨床表現(xiàn)精神沉郁、結(jié)膜黃疸、可視黏膜蒼白、體溫升高、嚴(yán)重貧血、四肢無(wú)力、消瘦等。為確診病因，采集病牛的鼻拭子和耳靜脈血作為檢測(cè)病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)病料無(wú)菌操作采集養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病牛的鼻拭子和耳靜脈血各6份(分別編號(hào)1～6)。取新鮮血液制備血推片，自然干燥。剩余血液和鼻拭子樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑柱式DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker(均購(gòu)自天根生物公司)、姬姆薩染液(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 主要儀器PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀(型號(hào)：TC-412，購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：SH-510，購(gòu)自申花科技有限公司)、光學(xué)顯微鏡(購(gòu)自上海締倫光學(xué)儀器有限公司)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45的TU基因(登錄號(hào)：HG520999.1)、牛附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列(登錄號(hào)：AY946266)，分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物。引物序列分別為：牛支原體-P1：5’-TACGGAAGTAGAATTGTGG-3’；牛支原體-P2：5’-GCAAAACTAGATTTTGAC-3’(預(yù)擴(kuò)增片段1 009 bp)。附紅細(xì)胞體-F：5’-GATGGAGATCGCC TCCCTAG-3’；附紅細(xì)胞體-R：5’-GCACCACCTG TCTTACTGATT-3’(預(yù)擴(kuò)增片段412 bp)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 牛支原體核酸檢測(cè)加入適量生理鹽水于鼻拭子離心管中，漩渦震蕩均勻，8 000 r/min離心取上清液，采用柱式DNA提取試劑盒提取總DNA，以此為模板對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 pmol/μL) 各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.6 附紅細(xì)胞體16S rRNA核酸檢測(cè)將牛耳靜脈血反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心取上清液。采用柱式DNA提取試劑盒提取總DNA，以此為模板對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 pmol/μL) 各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性55 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.7 血液檢查6份血推片用甲醇固定，姬姆薩染色2 h，干燥后置于光學(xué)顯微鏡(10×100倍)下觀察。

2 結(jié)果

2.1 牛支原體核酸檢測(cè)結(jié)果由圖1可見(jiàn)：檢測(cè)樣品中1、3、5號(hào)樣品擴(kuò)增出1 009 bp目的條帶，提示樣品中存在牛支原體感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～6：檢測(cè)樣品； +：陽(yáng)性對(duì)照； -：陰性對(duì)照?qǐng)D1 牛支原體PCR檢測(cè)

2.2 附紅細(xì)胞體核酸檢測(cè)結(jié)果由圖2可見(jiàn)：檢測(cè)樣品中1、3號(hào)樣品擴(kuò)增出412 bp目的條帶，提示樣品中存在附紅細(xì)胞體感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～6：檢測(cè)樣品； +：陽(yáng)性對(duì)照； -：陰性對(duì)照?qǐng)D2 附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)

2.3 血液檢查結(jié)果由圖3可見(jiàn)：2份血樣鏡檢可見(jiàn)紅細(xì)胞呈星芒狀，與附紅細(xì)胞體感染特征相符，提示樣品中存在附紅細(xì)胞體感染。

圖3 血推片鏡檢(10×100)

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行牛支原體核酸檢測(cè)、附紅細(xì)胞體核酸檢測(cè)和血液檢查，診斷該場(chǎng)病牛存在牛支原體與附紅細(xì)胞體混合感染。

4 討論

4.1牛支原體感染可引起以壞死性肺炎為主要特征的牛呼吸道疾病[1]，多發(fā)生于秋、冬季節(jié)。附紅細(xì)胞體是寄生于動(dòng)物紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓中的病原微生物，可感染人和多種家畜，引起溶血性黃疸和貧血，導(dǎo)致生產(chǎn)力下降，病牛表現(xiàn)為呼吸急促、消瘦、被毛無(wú)光澤、可視黏膜蒼白或黃疸[2～4]。近年來(lái)，牛(包括豬、羊)支原體和附紅細(xì)胞體混合感染時(shí)有發(fā)生，發(fā)病初期常呈隱性經(jīng)過(guò)，隨著病情的發(fā)展表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀[5]。該場(chǎng)發(fā)病牛存在明顯的呼吸道疾病癥狀和附紅細(xì)胞體感染癥狀，因此為盡快確診病原，采用分子生物學(xué)方法和顯微鏡直接觀察方法對(duì)上述病原進(jìn)行針對(duì)性檢測(cè)。

4.2目前防控這2種疫病主要通過(guò)做好環(huán)境衛(wèi)生消毒工作，殺滅蚊、蠅、蜱、鼠類等傳播媒介。不同種類動(dòng)物嚴(yán)禁混養(yǎng)，實(shí)施全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式。感染病例可使用氟苯尼考注射液0.3 mL/kg體重肌肉注射，每天1次，3天為1個(gè)療程。