梅世慧， 王 娜， 畢文文， 張峻杰， 何廣霞， 曾成容， 周碧君，2，3*， 王開功，2，3， 文 明，2，3

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025； 3. 貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025)

牛支原體(Mycoplasmabovis，MB)是介于細(xì)菌和病毒之間的最小原核生物，是引起牛支原體肺炎的主要病原，以呼吸困難、咳嗽、氣喘等癥狀最為常見[1，2]，還能引起乳腺炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、角膜炎等病癥[3]。牛支原體病呈全球性流行，近年來我國貴州、內(nèi)蒙古、西藏、寧夏等地陸續(xù)出現(xiàn)關(guān)于本病的報道，給養(yǎng)牛業(yè)造成很大的損失[4～6]。2021年7月16日，貴州省黔西南布依族苗族自治州某養(yǎng)牛場牛群出現(xiàn)高熱、咳嗽及死亡病例，臨床癥狀及病理變化疑似牛支原體或其他細(xì)菌感染。為確診病因，采集病死牛肺臟組織進行實驗室檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測病料無菌條件下采集該場病死牛的肺臟組織1份作為檢測病料，用冰袋運輸至實驗室，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)；DL 2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix(均購自TaKaRa公司)；細(xì)菌16S rDNA通用引物、牛支原體TU基因引物[均購自生工生物工程(上海)股份有限公司]；藥敏試紙片、麥康凱培養(yǎng)基、LB瓊脂、營養(yǎng)瓊脂(均購自杭州微生物試劑有限公司)、瓊脂粉(購自索萊寶生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器雙槽梯度PCR儀(型號：T20，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、電泳凝膠成像儀(SYNGENE公司)、臺式高速冷凍離心機(型號：ScanSpeed 1730R，丹麥LABOGENE公司)、OLYM-PUS 生物顯微鏡(型號：CX33，上海普赫光電科技有限公司) 。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌條件下取病死牛肺臟組織接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱培養(yǎng) 24 h，觀察菌落生長情況。挑取單個典型菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱純培養(yǎng)24 h，并接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取純培養(yǎng)的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.4.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的細(xì)菌DNA為模板，使用細(xì)菌16S rDNA通用引物[7](F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC -3’；R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；預(yù)擴增片段1 500 bp)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系 25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA(254.61 ng/μL)2 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸 90 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果進行同源性比對、進化樹分析，并用10種藥敏試紙片對分離菌進行藥物敏感性試驗。

1.5 牛支原體核酸檢測

1.5.1 組織樣品DNA的提取取病死牛肺臟組織1 g 于滅菌研缽中，加入PBS 1 mL研磨制備勻漿，8 000 r/min 離心2 min，提取上清液，用DNA提取試劑盒提取組織總DNA，用于牛支原體核酸檢測。

1.5.2 牛支原體核酸檢測以提取的組織總DNA為模板，采用PCR方法對目的基因(牛支原體TU基因)進行擴增。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物(P1：5’-GCTCAAGCAGGTGA CAACGCAG-3’；P2：5’-TCCAACTGTTCTACCACCTT CACGG-3’；預(yù)擴增片段351 bp；濃度均為10 μmol/L)各1 μL，模板DNA(103.45 ng/μL)2 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取PCR產(chǎn)物8 μL于含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)菌落及菌體特征分離菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長呈半透明、表面光滑、圓形菌落(見圖1)；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長呈微紅色、表面光滑濕潤、邊緣整齊、圓形菌落(見圖2)。革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌(見圖3)。

圖1 鮮血瓊脂培養(yǎng)基生長菌落

圖2 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基生長菌落

圖3 革蘭氏染色鏡檢菌體特征(10×100)

2.1.2 細(xì)菌鑒定及同源性分析分離菌PCR擴增出 1 500 bp目的條帶(見圖4)。應(yīng)用Megline 7.1.0(44)軟件將分離菌株(命名為QX202107株)測序結(jié)果與10株大腸桿菌參考菌株(OK493608.1、MN208117.1、MN208177.1、MN208097.1、KJ477005.1、MN208098.1、MN208215.1、MN208212.1、MN704427.1、MN208129.1)DNA序列進行同源性比對和系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果與10株大腸桿菌的同源性均在98%以上，與KJ477005.1同源性達到99.8%，親緣關(guān)系最近(見圖5、圖6)。

2.1.3 藥物敏感性藥敏試驗結(jié)果顯示：該分離菌對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛高度敏感，對卡那霉素、哌拉西林中度敏感，對新霉素、頭孢哌酮、米諾環(huán)素、慶大霉素、紅霉素耐藥(見表1)。

2.2 牛支原體核酸檢測結(jié)果病死牛肺臟組織經(jīng)PCR擴增出351 bp目的條帶(見圖7)，表明其肺臟組織中存在牛支原體感染。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1：分離菌圖4 分離菌16S rDNA PCR檢測結(jié)果

圖5 分離菌(QX202107株)與10株大腸桿菌同源性比對結(jié)果

圖6 分離菌(QX202107株)與10株大腸桿菌系統(tǒng)進化樹分析

表1 分離菌藥敏試驗結(jié)果

M：DL 2 000 DNA Marker； +：陽性對照； -：陰性對照； 1：肺臟組織圖7 牛支原體PCR檢測結(jié)果

3 結(jié)論

通過細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定、牛支原體核酸檢測，診斷牛場病例為牛支原體與大腸桿菌混合感染；分離的大腸桿菌對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛高度敏感，可使用該類藥物進行治療。

4 討論

4.1牛支原體是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合征、中耳炎、結(jié)膜炎和關(guān)節(jié)炎綜合征以及生殖系統(tǒng)疾病的重要病原之一[8，9]。相關(guān)報道顯示，美國的牛支原體感染率高達70%，歐洲25%～33%的牛肺炎癥狀與牛支原體有關(guān)；我國自2008年首次報道該病后，陸續(xù)有14個省(區(qū))檢測到牛支原體病原，并造成很大的經(jīng)濟損失[10～12]。牛支原體病應(yīng)用抗生素治療效果差，現(xiàn)階段尚無有效的藥物進行防治[13]。近年來雖然有關(guān)于牛支原體弱毒疫苗、滅活疫苗及亞單位疫苗的相關(guān)研究，但尚無有效的牛支原體疫苗可作為商業(yè)推廣應(yīng)用[14]。牛支原體病要以預(yù)防為主，其發(fā)病原因主要與應(yīng)激和環(huán)境衛(wèi)生有關(guān)[15]。因此平時要注重圈舍的環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒、清理糞便和墊草。此外，養(yǎng)殖場應(yīng)盡量堅持“自繁自養(yǎng)”的原則，如必須從外地引入種牛，應(yīng)在運輸時做好飼喂和管理工作，減少應(yīng)激反應(yīng)[16]。

4.2牛支原體病可繼發(fā)或并發(fā)多種細(xì)菌、病毒感染，從而引發(fā)以呼吸道癥狀為主的綜合癥候群[17]。如：仝曉丹等[18]報道黑龍江省某牛場的牛副流感3型病毒與牛支原體混合感染；王方國等[19]對西藏那曲地區(qū)牦牛呼吸道疾病綜合征5種細(xì)菌病原的感染情況調(diào)查結(jié)果顯示，牛支原體可與多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌混合感染；吳翠蘭等[20]對廣西地區(qū)2016—2017年牛呼吸道疾病綜合征病原學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)牛呼吸道疾病主要以牛支原體、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌引發(fā)的混合感染為主。貴州省近年來養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，關(guān)于本病的報道也陸續(xù)出現(xiàn)，且大多為牛支原體與其他病原的混合感染。如：藺俐仲等[21]發(fā)現(xiàn)貴州牛支原體與巴氏桿菌發(fā)生混合感染；徐春志等[22]、尹德晶等[15]發(fā)現(xiàn)貴州牛支原體與附紅細(xì)胞體混合感染。此次黔西南布依族苗族自治州某養(yǎng)牛場發(fā)生牛支原體與大腸桿菌混合感染，原因可能為病牛感染支原體后抵抗力下降，繼發(fā)大腸桿菌感染。大腸桿菌屬于條件性致病菌，防制的關(guān)鍵在于加強飼養(yǎng)管理，在養(yǎng)殖過程中做好各個環(huán)節(jié)的衛(wèi)生消毒[23]。此外，大腸桿菌存在不同程度的耐藥性，所以在臨床治療中應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果進行用藥。