羅小芬， 郭小江， 趙 超， 張峻杰， 馮孝傲， 成虹松， 程振濤，2*

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省草地技術試驗推廣站，貴州 貴陽 550025)

沙門氏菌(Salmonella)屬于腸桿菌科，沙門氏菌屬的成員，是人和動物的常見病原菌，廣泛存在于大自然中，呈全球性分布[1～4]。其致病性因血清型而異，臨床癥狀也各異，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為嚴重的食源性疾病病原[5～9]。沙門氏菌是家禽的重要病原菌，感染發(fā)病可造成重大經濟損失[10]。2021年9月，六盤水市某養(yǎng)雞場發(fā)生沙門氏菌感染疑似病例，本研究對該場送檢病死雞進行細菌分離鑒定及耐藥性分析，為雞沙門氏菌病的有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測病料無菌采集該場3只(1月齡)病死雞的肝臟、脾臟作為檢測病料。

1.2 主要試劑麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、14種腸桿菌科微量生化鑒定管(均購自杭州微生物試劑有限公司)、革蘭氏染色試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司)、2×TaqPCR Master Mix Ⅱ、DNA提取試劑盒(均購自天根生物公司)、 DL 2 000 DNA Marker(購自大連寶生物工程有限公司)、膠回收試劑盒(購自Omega公司)、10種藥敏紙片(購自西京諾唯微生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器超凈工作臺(購自蘇州凈化設備公司)、多功能梯度PCR儀(型號：VeritiTM96-Well T hermai Cycler，美國ABI公司生產)、臺式高速冷凍離心機(型號：ScanSpeed 1730R，丹麥LABOGENE公司生產)、全溫培養(yǎng)搖床(型號：QYC-2012C，購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.4 細菌分離培養(yǎng)取病死雞的肝臟、脾臟病料，在超凈工作臺內分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h。挑取生長的單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床(170 r/min)37 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)18 h，獲得分離菌純培養(yǎng)物。

1.5 革蘭氏染色鏡檢挑取分離菌純培養(yǎng)物于載玻片上涂抹均勻，酒精燈火焰固定，草酸銨結晶紫染色1 min，蒸餾水沖洗，加碘液覆蓋涂面復染 1 min，水洗，用吸水紙吸干水分，加95%酒精數滴脫色20 s，水洗后沙黃復染，光學顯微鏡(油鏡100×10)下觀察菌體特征。

1.6 生化試驗將分離菌分別接種于14種腸桿菌科生化鑒定管(硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、靛基質、甲基紅、枸櫞酸鹽、尿素、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側金花醇、木膠糖)，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察結果。根據《腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊》(第二代15e系統(tǒng))對結果進行判定。

1.7 分子生物學鑒定參考GenBank數據庫中沙門氏菌16S rDNA序列(登錄號：EF489442)，利用引物設計軟件Primer 5.0設計1對特異引物(Tm值：57 ℃，預擴增片段1 550 bp)。上游引物：5’-AAAATGAGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’；下游引物：5’-CCTTGTTACGACTTCACCCCAATC-3’。按DNA提取試劑盒說明書方法提取分離菌總DNA，構建PCR反應體系(25 μL)：2×TaqPCR Master MixⅡ 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。取PCR擴增產物10 μL電泳并膠回收目的條帶測序，利用DNA Star 7.0軟件對測序結果進行序列分析。

1.8 藥物敏感性試驗采用藥敏紙片法對分離菌進行10種抗菌藥物(鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿莫西林、強力霉素、恩諾沙星、復方新諾明、紅霉素、青霉素、羧芐西林)的敏感性測定。方法：取已分離鑒定菌株接種于營養(yǎng)肉湯5 mL中，37 ℃培養(yǎng)過夜，用移液器吸取菌液滴于普通瓊脂培養(yǎng)基中央，用滅菌L型玻璃棒涂抹均勻，室溫下(25 ℃)放置3～5 min，用無菌鑷子將各抗菌藥物試紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，各試紙片距離相等，37 ℃培養(yǎng)過夜。測量抑菌圈大小(重復3次，取平均值)。根據抑菌圈大小判斷分離菌對各種藥物的敏感程度。判定標準：抑菌圈≥20 mm為高度敏感，10～20 mm 為中度敏感，<10 mm為耐藥。

2 結果

2.1 培養(yǎng)菌落及菌體特征從肝臟病料中共分離培養(yǎng)出3株菌落，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、白色半透明、濕潤光滑、邊緣整齊(見圖1)；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、隆起、無色透明(見圖2)。革蘭氏染色鏡檢可見紅色(革蘭氏陰性)、大小均勻、兩端鈍圓、無莢膜、無芽孢的短桿菌(見圖3)。

1號菌落 2號菌落 3號菌落圖1 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長菌落

1號菌落 2號菌落 3號菌落圖2 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基生長菌落

1號菌 2號菌 3號菌圖3 分離菌革蘭氏染色鏡檢(100×10)

2.2 生化特性3株分離菌的硫化氫、甲基紅、枸櫞酸鹽、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、山梨醇、木膠糖試驗結果均為陽性，苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、靛基質、尿素、棉子糖、側金花醇試驗均為陰性，與沙門氏菌的生化特性相符。

2.3 分子生物學鑒定結果由圖4可見：3株分離菌均擴增出1 550 bp目的條帶。將3株細菌的16S rDNA序列與GenBank中的沙門氏菌[FORC88(CP029029.1)、PNCS014875(CP039610.1)、大腸桿菌[4116S(MK621250.1)、7616S(MK621269.1)、2516S(MK621240.1)、3216S(MK621245.1)]、葡萄球菌[MPU99(AB353073.1)、O82(CPO38819.1)、WCUH29(CPO39156.1)、aureus 16S(KX863493.1)]、巴氏桿菌[RCAD0259(CP014157.1)、FCf15(CP038871.1)、FCf76(CP038874.1)]的16S rDNA基因進行系統(tǒng)進化樹分析，結果3株分離菌與沙門氏菌的親緣關系最近，與巴氏桿菌的親緣關系最遠(見圖5)。最終鑒定3株分離菌均為沙門氏菌。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1～3：分離菌株； -：陰性對照圖4 分離菌16S rDNA PCR產物擴增結果

2.4 藥敏試驗結果由表1可見：3株分離菌均對阿莫西林、紅霉素、青霉素耐藥；對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、強力霉素中度敏感；對恩諾沙星、復方新諾明、羧芐西林高度敏感。

●為3株分離菌圖5 分離菌株系統(tǒng)進化樹分析

表1 3株分離菌藥敏試驗結果

3 結論

本試驗臨床分離的3株細菌經鑒定為沙門氏菌，表明雞場存在沙門氏菌感染，可選取高度敏感藥物恩諾沙星、復方新諾明、羧芐西林進行治療。

4 討論

4.1沙門氏菌的檢測方法有細菌分離培養(yǎng)、分子生物學和免疫學檢測等[11，12]，其中《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》(GB 4789.4—2010)是我國目前規(guī)定的標準檢測方法。根據沙門氏菌的培養(yǎng)及生化特性，該方法包含前增菌、增菌、分離、生化試驗和血清學鑒定等5個步驟[13，14]。如：宋欣媛等在昆明地區(qū)運用傳統(tǒng)的檢測方法從發(fā)病雞的肝臟和脾臟中分離出沙門氏菌[15]。史瑞雅[16]等運用普通PCR方法從病禽的肝臟和腎臟中檢測出沙門氏菌?？紤]到敏感藥物的篩選工作，本試驗采用經典方法與分子生物學方法鑒定發(fā)病雞場病例的沙門氏菌感染株，鑒定更為準確，并為后續(xù)防治工作奠定了基礎。

4.2本試驗對3株沙門氏菌的藥敏試驗結果與黃凱等[17]、王曉藝等[18]的研究結果相符，但與張步嫻等[19]分離的雞源沙門氏菌耐藥性不盡相同，表明沙門氏菌的耐藥性存在地域差異。根據此次藥敏試驗結果，可優(yōu)先使用恩諾沙星等高度敏感藥物防治該養(yǎng)雞場的沙門氏菌病。