張慶勛，鐘震宇，郭青云，何宏軒，白加德

(1.北京麋鹿生態(tài)實驗中心，北京 100076；2.北京生物多樣性保護研究中心，北京 100076；3.中國科學(xué)院動物研究所，北京 100101)

近年來，新發(fā)突發(fā)人獸共患病、動物疫病如新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、寨卡病毒、埃博拉病毒、甲型流感病毒、非洲豬瘟病毒等，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生及獸醫(yī)衛(wèi)生安全[1-2]?？焖佟㈧`敏、特異的檢測方法對于傳染病的防控至關(guān)重要[3-4]。目前動物病原體常見的檢測方法包括基于抗原抗體的免疫學(xué)方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和實時熒光定量PCR方法、基因組測序方法等[5-8]，但是這些方法存在一定的局限性，如非特異性的干擾、耗時、價格高、對設(shè)備的依賴性強等。病原體檢測的最為理想的方法應(yīng)當(dāng)是快速、靈敏、特異、經(jīng)濟實惠、設(shè)備自由且直觀的方法。

CRISPR-Cas系統(tǒng)源自細菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，因其識別和剪切特定DNA或RNA序列的能力而在基因編輯領(lǐng)域得到廣泛研究。除基因編輯功能外，Cas核酸酶(如Cas12和Cas13)在特異識別和結(jié)合靶標(biāo)核酸后，表現(xiàn)出強烈的附屬切割活性，即非特異地切割周圍的RNA或DNA[9]。目前，基于CRISPR-Cas13a的特異高靈敏度酶報告系統(tǒng)(SHERLOCK)[10]以及基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2快速檢測方法(DETECTR)[11]已被開發(fā)出來，并且相關(guān)的SARS-CoV-2檢測試劑盒已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的緊急使用授權(quán)。基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的診斷方法作為新一代的診斷技術(shù)，表現(xiàn)出靈敏度高、特異性好等諸多優(yōu)點，并且可以實現(xiàn)快速即時檢測，在病原體檢測方面具有巨大應(yīng)用前景。作者將對CRISPR-Cas系統(tǒng)類型及其在病原體快速檢測中的最新進展展開論述。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)類型及應(yīng)用

CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌的一種RNA引導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，通過RNA引導(dǎo)Cas核酸酶與特定的核酸序列結(jié)合并切斷該序列，用以抵抗外源DNA或病毒的入侵[12]。CRISPR-Cas系統(tǒng)可分為兩大類、6種型、33種亞型。類別1包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型及16個亞型，主要由多個Cas核酸酶組成的復(fù)合物發(fā)揮作用。與類別1不同，類別2包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型及17個亞型，僅需要1個大的多功能結(jié)合域的Cas核酸酶。其中Cas9存在于所有Ⅱ型系統(tǒng)，Ⅴ型和Ⅵ型CRISPR-Cas系統(tǒng)均包含多種變體，Ⅴ型主要由DNA酶Cas12a、Cas12b和Cas14組成，Ⅵ型包括Cas13a和Cas13b，其只能切割靶標(biāo)RNA序列[13-15]。

在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，CRISPR RNA(crRNA)會與反式激活crRNA(tracrRNA)結(jié)合形成指導(dǎo)RNA(gRNA)，目前的研究已將二者整合為單一向?qū)NA(sgRNA)。Cas9蛋白在sgRNA的協(xié)助下精準(zhǔn)定位到原間隔序列臨近基序(PAM)靶位點，最終完成對雙鏈DNA的精準(zhǔn)切割(圖1)。目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成為強有力的基因編輯工具，廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[16]。在Ⅴ型CRISPR-Cas系統(tǒng)中，tracrRNA能夠干擾Cas12b和Cas12c，但不影響Cas12a。Cas12a在crRNA介導(dǎo)下靶向切割富含T堿基的PAM區(qū)的雙鏈DNA(dsDNA)，同時激活Cas12a的單鏈DNase活性，進而以非特異性的方式切割非靶標(biāo)單鏈DNA(ssDNA)[17]。基于Cas12a的這種特性，CRISPR-Cas12系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于DNA的檢測。與Cas12不同的是，Cas13和Cas14核酸酶crRNA介導(dǎo)下分別靶向切割目標(biāo)單鏈RNA(ssRNA)和ssDNA，核酸酶被激活后通常表現(xiàn)出附屬切割活性，切割非特異性ssRNA和ssDNA(圖1)[18-19]。此外，Cas13和crRNA復(fù)合體切割ssRNA時，不需要tracrRNA和PAM區(qū)，但是其與ssRNA的結(jié)合需要原型間隔序列(即PFS區(qū))[15]。

隨著新的CRISPR-Cas12/Cas13系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及其作用機理的逐步揭示，這些系統(tǒng)實現(xiàn)了更加精準(zhǔn)高效的基因編輯。鑒于CRISPR-Cas12/Cas13在DNA及RNA檢測中的優(yōu)勢，這兩種系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于病原體快速診斷技術(shù)的研究。其中最為經(jīng)典的是基于CRISPR-Cas13a的SHERLOCK以及基于CRISPR-Cas12a的DETECTR，這兩種檢測方法都是利用熒光信號強度來表征檢測結(jié)果[10-11]。簡單來說，首先構(gòu)建FAM及BHQ熒光基團標(biāo)記的非靶標(biāo)ssRNA或dsDNA報告基因；在系統(tǒng)識別了目標(biāo)基因以后，Cas13和Cas12的附屬切割活性被激活，進而切割非靶標(biāo)ssRNA或dsDNA報告基因，最終通過多功能酶標(biāo)儀讀取樣本熒光強度。相較于傳統(tǒng)的檢測方法，CRISPR-Cas系統(tǒng)表現(xiàn)出快速、靈敏度高、特異性好、適用范圍廣等諸多優(yōu)點，在腫瘤、單核苷酸多態(tài)性(SNP)及遺傳病、病原體(病毒、細菌、寄生蟲)、耐藥基因、有機小分子、金屬離子、水質(zhì)、公共衛(wèi)生等檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用(圖1)[20-22]。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)在快速檢測中的應(yīng)用Fig.1 Applications of CRISPR-Cas system in rapid detection

2 CRISPR-Cas病原體快速檢測技術(shù)

2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)在病毒檢測中的研究

CRISPR-Cas系統(tǒng)在新發(fā)突發(fā)傳染病、人獸共患病、動物疫病檢測中得到廣泛的應(yīng)用。Pardee等[23]開發(fā)了一種基于RNA等溫擴增及傳感器相結(jié)合的CRISPR裂解方法，并且成功從血液樣本中檢測具有單核苷酸多態(tài)性差異的美國和非洲寨卡病毒(ZIKA)毒株。Zhang等[24]構(gòu)建了基于CRISPR-Cas9的HPV16/18的檢測及分型方法，該方法首先通過PCR方法進行擴增，而后基于CRISPR-Cas9切割的熒光信號鑒定PCR產(chǎn)物。此外，科研人員通過改造CRISPR-Cas9系統(tǒng)開發(fā)了一種新型蛋白質(zhì)研究技術(shù)(PICASSO)，該方法將經(jīng)修飾、無催化活性的Cas9蛋白(Cas9識別DNA序列但不進行切割)與定制的肽復(fù)合物相連，利用sgRNA引導(dǎo)該復(fù)合物與DNA自組裝，用此方法構(gòu)建的DNA-蛋白質(zhì)微陣列能夠快速識別樣本中的上千種抗體?；谶@種特性，PICASSO成功檢測了新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者的血液中是否存在與病原體蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體[25]。

Cas13a是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個靶向ssRNA的核酸酶，并且Cas13a附屬切割活性也僅針對ssRNA。Gootenberg等[26]開發(fā)出基于CRISPR-Cas13a的SHERLOCK系統(tǒng)后，首先將其運用于ZIKA和登革熱病毒(DENV)的檢測中，該方法的檢測靈敏度達到阿摩爾(aM)級別。為了進一步擴展該方法的應(yīng)用，研究人員對該方法進行了優(yōu)化，建立了SHERLOCKv2系統(tǒng)。此方法利用CRISPR Ⅲ類效應(yīng)器核酸酶Csm6來提高不同細菌種類Cas13酶的附帶切割活性，增加其檢測靈敏性；同時依托FAM-生物素系統(tǒng)建立了側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l，適用于現(xiàn)場的核酸可視化快速檢測方法[27]。為了使檢測過程更加便捷，研究者將SHERLOCK與一種對未提取的診斷樣品進行加熱來消除核酸酶的方法(HUDSON)聯(lián)用，免去了核酸提取的步驟，實現(xiàn)了對DENV、埃博拉病毒、拉沙病毒的快速檢測[28-29]。之后，研究人員在原有的技術(shù)基礎(chǔ)上建立了STOPCovid.V2法，通過磁珠優(yōu)化RNA的提取，不僅縮短RNA提取時間，同時提高了方法的檢測靈敏度，在臨床樣本的檢測中，該方法能夠達到93.1%的靈敏度和98.5%的特異性，并且陽性樣本只需15～45 min即可獲得檢測結(jié)果[10]，目前該方法已經(jīng)通過FDA批準(zhǔn)授權(quán)使用。此外，多項研究將CRISPR-Cas13a用于SARS-CoV-2、Epstein-Barr病毒(EBV)、乙肝病毒(HBV)、BK多瘤病毒/巨細胞病毒(BKV/HCMV)、禽流感病毒(AIV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、白斑綜合癥病毒(WSSV)、犬細小病毒(CPV)、非洲豬瘟病毒(ASFV)等病毒的快速檢測技術(shù)研發(fā)[30-37](表1)。

CRISPR-Cas12是一種強大的基因編輯系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)毛螺旋菌科細菌(Lb)的Cas12a能夠在crRNA的介導(dǎo)下靶向切割dsDNA或ssDNA，并且觸發(fā)附屬非特異性切割ssDNA熒光報告基因的能力。Chen等[38]利用LbCas12a與RPA聯(lián)用建立了適用于DNA檢測的DETECTR系統(tǒng)，該系統(tǒng)被首先運用于人乳頭瘤病毒(HPV)的檢測，能夠有效檢測出臨床的高危亞型HPV16/18。在基于Cas12a建立JEV檢測方法HOLMERS的基礎(chǔ)上[39]，Li等[40]利用Cas12b與LAMP反應(yīng)聯(lián)用構(gòu)建了HOLMERSv2方法，該方法利用依賴RNA的DNA聚合酶，去除了逆轉(zhuǎn)錄的過程，使JEV的檢測更加便利。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cas12a/b能夠同時檢測DNA和RNA靶標(biāo)，基于Cas12a/b系統(tǒng)與多種核酸擴增方法(如RT-RPA/RT-LAMP等)聯(lián)用開發(fā)出了SARS-CoV-2、ASFV、PB-19/CPV等病毒的檢測方法[41-46]。

2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌檢測中的研究

目前，在細菌快速檢測方法研究中最常用的是CRISPR-Cas9/12/13系統(tǒng)。Wang等[47]將CRISPR-Cas9與側(cè)向?qū)游龇ㄏ嘟Y(jié)合，構(gòu)建了稱為CASLFA的檢測方法，該方法能夠在非實驗室條件下以100%的準(zhǔn)確性檢測單核李斯特菌、轉(zhuǎn)基因生物、ASFV等。此外，研究人員開發(fā)了一種基于Cas9切口酶擴增的方法(Cas9nAR)，與側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l相結(jié)合，可以作為鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌的雙重檢測系統(tǒng)[48]。Li等[49]利用CRISPR-Cas12a與電化學(xué)信號相結(jié)合，開展了食品中單核李斯特菌的快速及現(xiàn)場檢測?；贑RISPR-Cas12a、RPA、熒光信號檢測等方法，Wang等[50]建立了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7的快速檢測方法-OCTOPUS，該方法能夠在50 min內(nèi)實現(xiàn)阿摩爾(aM)級的核酸檢測。除了CRISPR-Cas12a-RPA以外，CRISPR-Cas12b-LAMP也適用于結(jié)核分支桿菌檢測方法的開發(fā)[51-52]。越來越多的研究證明，CRISPR-Cas12/13系統(tǒng)能夠被廣泛應(yīng)用于細菌快速、靈敏的現(xiàn)場檢測，如副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、海洋創(chuàng)傷弧菌、空腸彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌等(表1)[53-58]。

2.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)在寄生蟲檢測中的研究

隨著CRISPR-Cas系統(tǒng)在病毒、細菌等病原體檢測中的廣泛應(yīng)用，研究人員開始探究此方法用于寄生蟲病的檢測。Lee等[59]首先通過SHERLOCK檢測平臺建立了惡性瘧原蟲(即鐮刀瘧原蟲)的診斷方法，同時該方法能夠鑒別惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲。同時這種方法優(yōu)化了核酸提取過程，能夠在60 min內(nèi)檢測出每毫升血液中的2個瘧原蟲，符合了WHO建議的檢測靈敏度?；贑RISPR-Cas12系統(tǒng)，Yu等[60]建立了另外一種原蟲(微小隱孢子蟲Ⅱd亞型)的快速檢測方法，該方法與其他亞型的微小隱孢子蟲無交叉反應(yīng)，表明其特異性較好。此外，CRISPR-Cas12系統(tǒng)也被用于弓形蟲的檢測方法開發(fā)，該方法的靈敏性能夠達到飛摩爾(fM)級別(表1)[61]。

2.4 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的病原體高通量及多重檢測

CRISPR-Cas系統(tǒng)與微流控技術(shù)的結(jié)合，可以使多個樣本或多個病原體的同時檢測成為可能。Qin等[62]建立了一種基于CRISPR-Cas13a與自動化微流控POC技術(shù)聯(lián)用的病原體核酸檢測方法，該方法可以在無需核酸擴增的條件下，實現(xiàn)數(shù)十個樣本中埃博拉病毒的高通量檢測。此外，Ackerman等[63]開發(fā)了一種基于核酸多重評估的組合排列反應(yīng)(CARMEN)，將CARMEN與Cas13a、微孔陣列結(jié)合形成一種多通道檢測方法。CARMEN-Cas13方法能夠?qū)?69種人類病毒同時運行4 500次的測試，同時該平臺還能夠區(qū)分多種亞型的流感病毒和完成數(shù)十種耐藥HIV病毒毒株的鑒定。

3 CRISPR-Cas病原體檢測技術(shù)研究中的關(guān)鍵問題

3.1 靶標(biāo)基因的序列保守性

對于Cas12，在crRNA設(shè)計時，需要考慮的問題主要是PAM區(qū)以及與crRNA互補的靶標(biāo)基因的保守性，這是開發(fā)CRISPR-Cas12檢測方法成功與否的關(guān)鍵[55]。研究顯示，crRNA靶向區(qū)的堿基錯配顯著影響Cas核酸酶的切割效率[64]。這種特性也表明了Cas12方法的高特異性，但是同時也存在一定的問題，如較短的靶標(biāo)序列或者存在堿基錯配時，高度保守序列的篩選難度增加，可能影響其檢測效率。在空腸彎曲桿菌CRISPR-Cas12b快速檢測方法開發(fā)時，研究人員分析了1 037條空腸彎曲桿菌的全基因組序列，鑒定出了1條20 bp長度的序列在1 024條空腸彎曲桿菌的全基因組中高度保守，并且是空腸彎曲桿菌所特有的[56]。同時，為了擺脫該方法對于PAM區(qū)的依賴，研究人員設(shè)計了2種方案：一是通過PCR外源引入PAM區(qū)改進HOLMES法[39]；二是設(shè)計2條不具有PAM區(qū)特性的crRNA，增加反應(yīng)的檢測靈敏性[65]。對于Cas13a，其crRNA設(shè)計需要涉及PFS區(qū)，然而Cas13a的這種局限很容易消除，比如選擇PFS區(qū)非依賴性的LwaCas13a[26]。然而，對于易突變的RNA病毒，一旦產(chǎn)生突變將會影響CRISPR-Cas的檢測效率。Liu等[66]利用LbuCas13a、化學(xué)修飾的RNA激活劑與TtCsm6結(jié)合，開發(fā)了一種免擴增快速實現(xiàn)核酸檢測的方法(FIND-IT)，其靈敏度和準(zhǔn)確性和實時熒光定量PCR方法一致或更優(yōu)。該方法將TtCsm6與包含8種不同crRNA的LbuCas13a效應(yīng)子相結(jié)合，不僅可以最大程度地覆蓋多種病毒的突變體，同時也避免了核酸擴增步驟。

3.2 靶標(biāo)基因的富集與擴增

為了優(yōu)化CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢出下限，經(jīng)常與核酸擴增方法聯(lián)用，比如重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RPA/RT-RPA)、重組酶介導(dǎo)的擴增技術(shù)(RAA/RT-RAA)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP/RT-LAMP)、PCR或RT-PCR等(表1)。如在海洋創(chuàng)傷弧菌的檢測中，RAA與CRISPR-Cas12a聯(lián)用方法的檢測靈敏性顯著高于單獨使用CRISPR-Cas12a的檢測方法[55]。在上述的核酸擴增方法中，LAMP屬于60～65 ℃等溫擴增，但易受氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽性；RAA和RPA需要25～42 ℃反應(yīng)，研發(fā)價格高于LAMP；而PCR需要依賴設(shè)備且擴增時間長于其他方法[1]。因此，在病原體檢測技術(shù)開發(fā)中，目前最為常用的核酸擴增方法主要是RPA/RAA以及LAMP。

為了進一步縮短反應(yīng)時間，研究人員開發(fā)了一系列不需要核酸擴增的方法。Fozouni等[67]通過設(shè)計多個靶向SARS-CoV-2的crRNA建立了不需要核酸擴增的CRISPR-Cas13a檢測方法，該方法可直接用于臨床樣本的檢測，其檢測靈敏性可達100拷貝/μL。除了利用多個crRNA，Nguyen等[68]通過改造修飾單個crRNA如在3′-端和5′-端添加不同長度的ssDNA、ssRNA及硫代磷酸化的ssDNA，可能增加CRISPR-Cas12a的檢測靈敏性。

3.3 終信號的讀取方式

目前，在基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的病原體檢測技術(shù)研究中最為常用的終信號讀取方式包括：熒光信號、比色信號、電化學(xué)信號和側(cè)向?qū)游龇治?表1)。最具代表性的SHERLOCK和DETECTR方法采用的是基于熒光信號的讀取方式[10-11]，在這種信號讀取的基礎(chǔ)上，更多的研究開發(fā)出了利用LED藍光燈、微流控技術(shù)、手機、側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l等讀取終信號[54,62,67,69]。比色信號是一種基于金納米顆粒的可視化分析方法，其能夠通過顏色變化判斷檢測結(jié)果。Hu等[70]基于CRISPR-Cas12a構(gòu)建了一種磁珠下拉輔助的比色分析法，稱之為M-CDC。這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)對ASFV等病原的特異性檢測，同時這種比色法可廣泛應(yīng)用于熒光檢測或側(cè)向?qū)游龇治觥ｋ娀瘜W(xué)信號用于核酸檢測的優(yōu)勢主要是簡單、價格低廉、特異性高等。目前，基于電化學(xué)信號的CRISPR-Cas檢測方法研究主要集中在HPV、人細小病毒(PB-19)、單核李斯特菌等[46,49]。

4 展 望

CRISPR-Cas系統(tǒng)作為新一代的可擴展性診斷技術(shù)，開創(chuàng)了分子診斷的新時代。該系統(tǒng)表現(xiàn)出靈敏度高、特異性好、價格低廉、操作簡單，并且可以實現(xiàn)快速即時檢測，在病原體檢測方面展示出巨大的應(yīng)用潛力。基于SHERLOCK、DETECTR方法的SARS-CoV-2檢測試劑盒在美國相繼獲批，同年中國研發(fā)的基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的SARS-CoV-2檢測試劑盒也獲批上市。迄今為止，在超過數(shù)十種人畜共患病和動物病原體中已開展了SHERLOCK、DETECTR及其相應(yīng)的優(yōu)化方法的研究。盡管CRISPR-Cas系統(tǒng)具有多種優(yōu)勢，其未來的發(fā)展仍面臨多種挑戰(zhàn)。如開展臨床樣本的大規(guī)模驗證，利用測序或多種成熟的方法來確證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；在不犧牲檢測靈敏性的條件下，開發(fā)臨床樣本的預(yù)處理方法、設(shè)計多條crRNA等，優(yōu)化或免除核酸的提取及擴增；CRISPR-Cas系統(tǒng)在更多病原體檢測方面的臨床應(yīng)用；建立基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的定制型高通量檢測或多病原檢測方法；更多新的Cas同源基因或CRISPR新方法的研發(fā)；CRISPR-Cas系統(tǒng)與自動化、人工智能等多學(xué)科的交叉。隨著研究的進一步深入，未來CRISPR-Cas系統(tǒng)將會在病原體檢測等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，并成為強有力的新一代檢測工具。