蔡 萌，朱曉艷，王夢(mèng)玲，劉子豪，熊本海，楊 亮

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最重要的疾病之一，給全球牧場(chǎng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。乳房炎造成奶牛產(chǎn)奶量顯著下降、乳品質(zhì)量下降、獸醫(yī)護(hù)理成本增加及過早淘汰的損失約占總經(jīng)濟(jì)損失的70%[2]。乳房炎通常由微生物感染引起，按乳房癥狀及乳汁變化分為臨床型和亞臨床型乳房炎，臨床型乳房炎的主要癥狀表現(xiàn)為乳房患處出現(xiàn)不同程度的充血、腫脹、手感溫?zé)岚橛刑弁?，乳汁變黃、質(zhì)地變稠、偶有乳凝塊等[3]。亞臨床型乳房炎一般沒有明顯的臨床癥狀，肉眼無法看出異常，但是產(chǎn)奶量出現(xiàn)下降且乳中病原菌、膿球、白細(xì)胞含量增加而乳脂、蛋白質(zhì)、乳糖、鉀、鈣、鎂、磷、鐵和鋅含量下降[4]。相對(duì)于臨床型乳房炎，亞臨床型乳房炎更難治療，潛在危害更大。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)是乳腺感染時(shí)的第一道防線，是抵御病原微生物入侵的天然屏障，可以啟動(dòng)機(jī)體對(duì)病原微生物最早的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答，并協(xié)調(diào)后續(xù)免疫分子、免疫細(xì)胞應(yīng)答等[5]。金黃色葡萄球菌(以下簡(jiǎn)稱金葡菌)、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌等是乳房炎的主要致病菌。其中，金葡菌是最常見且最重要的病原菌之一[6]。由于金葡菌的抵抗力及其逃避固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)的能力，經(jīng)常引起亞臨床乳房炎和慢性乳房炎[7]。金葡菌可以黏附侵入BMEC誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成，阻止胞內(nèi)細(xì)菌清除，從而導(dǎo)致持續(xù)感染并引起慢性疾病[8-10]。

外泌體是一種直徑大小在30～150 nm之間的納米級(jí)小囊泡，它可以特異性地包裹一些蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸或miRNA等物質(zhì)。外泌體具有生物活性，能夠被受體細(xì)胞吸收，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞[11]。不同細(xì)胞來源的外泌體在免疫調(diào)節(jié)中起著不同的作用[12]。外泌體的來源非常廣泛，幾乎所有類型的細(xì)胞均可分泌，如凋亡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞等[13-17]。外泌體普遍存在于各種體液中，如血清、血漿、尿液和母乳等[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，母乳中富含外泌體，但其來源不能確定，可能來源于BMEC、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，甚至來源于身體其他可以通過血液循環(huán)到達(dá)母乳的細(xì)胞[21-22]。外泌體與許多生理病理學(xué)功能有關(guān)，如信號(hào)傳導(dǎo)、免疫和感染等[17]。外泌體可以直接將病原體相關(guān)分子從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，從而影響感染進(jìn)程。結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞釋放的外泌體，可將分枝桿菌蛋白、脂質(zhì)和核酸等傳遞給幼稚巨噬細(xì)胞，從而激活或抑制免疫反應(yīng)[17]。在黏附侵襲性大腸桿菌感染腸上皮細(xì)胞后，細(xì)胞分泌的外泌體可以將特定的miRNA(如miR-30c和miR-130a)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，從而抑制自噬介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌清除過程[23-24]。上述研究證實(shí)感染細(xì)胞釋放的外泌體參與宿主對(duì)病原感染的免疫反應(yīng)。牛奶衍生的外泌體含有大量與乳腺和免疫相關(guān)的miRNA。試驗(yàn)性或臨床性金葡菌感染導(dǎo)致的奶牛乳房炎會(huì)引起牛奶中外泌體miRNA表達(dá)譜的差異，差異miRNA包括miR-142-5p、miR-223、miR-223、miR-378和miR-185[25-27]。然而，BMEC感染乳房炎病原菌金葡菌與細(xì)胞釋放外泌體之間的關(guān)系仍然未知。本研究將探究不同金葡菌與BMEC數(shù)量比值(MOI)和處理后無外泌體培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外泌體總濃度的影響，并對(duì)金葡菌誘導(dǎo)BMEC釋放的外泌體進(jìn)行分離和鑒定，旨在確立一套金葡菌誘導(dǎo)BMEC釋放外泌體的細(xì)胞模型，為進(jìn)一步探究其在感染進(jìn)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T細(xì)胞系)及金葡菌均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所智慧畜牧業(yè)團(tuán)隊(duì)保存。

1.2 主要試劑及儀器

LB肉湯、瓊脂粉均購(gòu)自博奧星生物公司；CHROMagar培養(yǎng)基購(gòu)自科瑪嘉公司；胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗(青霉素、鏈霉素)均購(gòu)自Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、PBS均購(gòu)自HyClone公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自Tanon公司；慶大霉素、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購(gòu)自索萊寶科技有限公司。BCA試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；兔抗CD9、CD81、TSG101單克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司。

主要儀器有超速離心機(jī)(Optima XE-90，貝克曼庫(kù)爾特公司)；透射電子顯微鏡(HT7700，日立公司)；掃描電子顯微鏡(LSM 900，蔡司公司)。

1.3 無外泌體胎牛血清的制備

將胎牛血清于4 ℃、110 000×g離心18 h，去除外泌體。緩慢收集上層血清，避免擾動(dòng)底部的沉淀，收集的上層血清即為無外泌體血清，在細(xì)胞間無菌超凈臺(tái)中使用0.22 μm濾器過濾后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 建立金葡菌處理BMEC模型

1.4.1 準(zhǔn)備菌株 使用LB肉湯復(fù)蘇金葡萄菌株，使用CHROMagar培養(yǎng)基純化菌株，取直徑1 mm單菌落增菌4 h，4 ℃保存待用。

1.4.2 準(zhǔn)備細(xì)胞 細(xì)胞接種至T75細(xì)胞瓶中，每組15瓶，待細(xì)胞匯合度達(dá)到85%后做攻菌處理,此時(shí)每瓶約含2.3×106個(gè)細(xì)胞。

1.4.3 金葡菌處理BMEC 攻菌前更換細(xì)胞培養(yǎng)基為感染培養(yǎng)基(含5%無外泌體血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，無雙抗)。MOI=1組加入金葡菌2.3×106/瓶；MOI=10組加入金葡菌2.3×107/瓶，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。同時(shí)以未處理細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.4.4 收集細(xì)胞上清 攻菌結(jié)束后徹底棄掉感染培養(yǎng)基，PBS清洗多次，以保證清洗掉未黏附的細(xì)菌。更換無外泌體培養(yǎng)基(含10%無外泌體血清、含1%雙抗、200 μg/mL慶大霉素)。將攻菌后的細(xì)胞分別培養(yǎng)9、12、24 h，收集細(xì)胞上清并用0.22 μm濾器過濾。

1.5 金葡菌處理BMEC后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將細(xì)胞爬片提前置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板底部，然后進(jìn)行細(xì)胞接種培養(yǎng)。PBS清洗細(xì)胞并壓碎細(xì)胞爬片。將細(xì)胞爬片碎片放入到4 ℃預(yù)冷的3%戊二醛中，4 ℃過夜固定。棄掉固定劑后，用PBS清洗細(xì)胞爬片碎片2次，每次10 min，加入預(yù)冷的1%鋨酸4 ℃固定1 h，再次清洗細(xì)胞爬片碎片。脫水，干燥。使用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.6 外泌體的分離純化及鑒定

1.6.1 外泌體分離純化 將收集的上清于4 ℃、110 000×g離心90 min，緩慢不徹底棄上清，避免擾動(dòng)底部的沉淀，使用PBS重懸沉淀、再次離心，用PBS清洗外泌體。向外泌體沉淀中加入200 μL PBS重懸，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，徹底吹勻后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 外泌體形態(tài)觀察 取10 μL外泌體懸液滴在封口膜上，將銅網(wǎng)膜面置于外泌體懸滴上保持3 min，再置于蒸餾水懸滴上，保持1 min，然后置于醋酸雙氧鈾懸滴上，保持5 min。膜面朝上標(biāo)記好樣品名稱置于平皿中，室溫干燥，保持潔凈。待銅網(wǎng)干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)并拍照。

1.6.3 外泌體粒徑分析 取外泌體20 μL，PBS稀釋5 000倍，通過粒徑分析儀(Zeta View，Particle Metrix)實(shí)時(shí)對(duì)懸浮液中50～1 000 nm直徑范圍內(nèi)特定的外泌體等小囊泡進(jìn)行逐個(gè)直接成像和觀察，最后通過軟件Zeta view 8.04.02計(jì)算外泌體粒徑分布。

1.6.4 外泌體標(biāo)記蛋白CD9、CD81、TSG101的鑒定 每組取外泌體10 μL，使用RIPA裂解液提取總蛋白；總蛋白通過15% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜置于5% BSA中37 ℃封閉1 h；1×PBST緩沖液洗滌2次，每次10 min。加入兔抗CD9(1∶500稀釋)、CD81(1∶500稀釋)、TSG101(1∶500稀釋)，4 ℃過夜。1×PBST緩沖液洗滌2次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的抗兔IgG(H+L)(1∶5 000稀釋)，37 ℃反應(yīng)50 min；1×PBST緩沖液洗滌2次，每次10 min。ECL顯影，根據(jù)蛋白大小調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，保存圖像備用。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行非參數(shù)分析(Kruskal-Wallis)，考察不同MOI及處理后培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)外泌體總蛋白濃度的影響。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 金葡菌處理BMEC后細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

通過掃描電鏡觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)(圖1)。由圖1A可知，空白對(duì)照組BMEC形態(tài)飽滿、結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)橢圓形，表面微絨毛排列有序。金葡菌呈典型圓球狀，處理BMEC 3 h后，大量黏附在細(xì)胞膜表面；MOI=1和MOI=10組BMEC表面微絨毛均消失，細(xì)胞骨架萎縮、凹陷，后者細(xì)胞受損程度更嚴(yán)重(圖1B和圖1C)。

A，空白對(duì)照組；B，MOI=1；C，MOI=10。圖2同A，Control group;B,MOI=1；C,MOI=10. The same as fig.2圖1 不同處理組BMEC表面超微結(jié)構(gòu)觀察(2 000×)Fig.1 Ultrastructural observation of BMEC surface in different processing group (2 000×)

2.2 外泌體形態(tài)學(xué)分析

采用透射電鏡觀察BMEC外泌體的形態(tài)(圖2)。由圖2可知，各組外泌體均為大小類似、形態(tài)一致的小囊泡，直徑在100～150 nm之間，均可見明顯雙層膜、中間凹陷的茶托樣結(jié)構(gòu)，各組形態(tài)無明顯差異。其中，MOI=10組(圖2C)外泌體密度大于MOI=1組(圖2B)，且兩組均大于空白對(duì)照組(圖2A)。

圖2 不同處理組BMEC釋放的外泌體形態(tài)觀察(50 000×)Fig.2 Morphological observation of exosomes released by BMEC in different processing group (50 000×)

2.3 外泌體總蛋白濃度分析

由圖3可知，在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，MOI=10時(shí)細(xì)胞上清外泌體總蛋白濃度高于其他2組，但各組間差異不顯著(P>0.05)。感染后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，空白對(duì)照組及MOI=1、MOI=10攻菌組細(xì)胞上清外泌體總蛋白濃度均值分別為499.65、611.75和781.68 μg/mL，其中以MOI=10組獲取的外泌體總蛋白濃度最高。

根據(jù)外泌體總蛋白濃度結(jié)果，確定攻菌量MOI=10和攻菌后培養(yǎng)時(shí)間為12 h。后續(xù)外泌體鑒定只保留空白對(duì)照組和MOI=10組。

圖3 各處理組不同培養(yǎng)時(shí)間BMEC上清中外泌體總蛋白濃度Fig.3 Concentration of exosome protein from BMEC supernatant in each treatment group at different cultured time

2.4 外泌體粒徑分析和CD9、CD81、TSG101蛋白鑒定

使用納米顆粒追蹤分析技術(shù)確定外泌體大小，外泌體大小均一，無明顯差異(圖4)。其中，空白對(duì)照組平均粒徑112 nm,粒徑在40～185 nm 范圍的顆粒數(shù)占總顆粒數(shù)的96.62%(圖4A)；MOI=10組平均粒徑116 nm，粒徑在40～185 nm 范圍的顆粒數(shù)占總顆粒數(shù)的97.73%(圖4B)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和MOI=10組外泌體標(biāo)記蛋白CD9、CD81、TSG101表達(dá)均呈陽(yáng)性(圖4C)。

A、B,分別為空白對(duì)照組和MOI=10組外泌體粒徑分析;C，Western blotting檢測(cè)結(jié)果A and B，The detection results of control group，MOI=10；C，Western blotting detection rusults圖4 外泌體納米顆粒追蹤分析和標(biāo)記蛋白表達(dá)Fig.4 Nanoparticle tracking analysis and labeled protein expression of exosomes

3 討 論

乳房炎幾乎總是由病原微生物引起的一種奶牛乳房炎癥。它嚴(yán)重?fù)p害了奶牛養(yǎng)殖和乳制品行業(yè)。當(dāng)BMEC細(xì)胞等受到細(xì)菌毒素的刺激后，會(huì)分泌大量的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，進(jìn)而引起乳房炎。乳房炎不僅造成產(chǎn)奶量下降，還降低了乳品質(zhì)，甚至危害人體健康，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。乳腺是奶牛防御疾病的第一道防線，BMEC不僅是抵御外來病原微生物入侵的天然屏障，還可以啟動(dòng)機(jī)體對(duì)病原微生物最早的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答[5]。外泌體通過旁分泌途徑在細(xì)胞之間進(jìn)行交流，其攜帶的物質(zhì)是啟動(dòng)通信的開關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌以MOI=10處理BMEC 3 h后，繼續(xù)無外泌體培養(yǎng)細(xì)胞12 h收集上清，利用超速離心法快速獲得大量的外泌體。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，囊泡顆粒具有外泌體典型雙層膜中間凹陷的茶托樣結(jié)構(gòu)，各組樣品整體均一性良好。CD9、CD81和TSG101 蛋白為典型的外泌體標(biāo)記蛋白，其主要涉及到了外泌體的生物發(fā)生過程。CD9、CD81是參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易宄蓡T，TSG101是轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選(ESCRT)復(fù)合體相關(guān)的蛋白，而ESCRT復(fù)合體是膜形成和斷裂的驅(qū)動(dòng)器[29]。Western blotting結(jié)果顯示，本研究分離的囊泡顆粒表達(dá)外泌體表面標(biāo)志物CD9、CD81和TSG101，進(jìn)一步證明了透射電鏡觀察到的囊泡狀物質(zhì)為外泌體。粒徑分析結(jié)果顯示，細(xì)胞上清中的空白對(duì)照組外泌體平均粒徑約112 nm，MOI=10組外泌體平均粒徑約116 nm，兩組外泌體粒徑范圍在40～185 nm占比高達(dá)95%以上，符合外泌體定義大小。

相同培養(yǎng)條件下，與MOI=1相比，MOI=10能刺激BMEC釋放更高濃度的外泌體。如克羅恩病患者的回腸黏膜中存在高流行的黏附侵襲性大腸桿菌。從表型上觀察，大腸桿菌可以通過與受體細(xì)胞的結(jié)合來增加腸上皮的通透性，進(jìn)而促進(jìn)其在巨噬細(xì)胞中存活和增殖。大腸桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)可以誘導(dǎo)細(xì)胞分泌更高濃度的外泌體[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同MOI時(shí)，繼續(xù)無外泌體培養(yǎng)12 h，可收集分離的外泌體總量最多。推測(cè)原因是金葡菌侵染細(xì)胞后定植在胞內(nèi)，培養(yǎng)24 h比12 h會(huì)導(dǎo)致更多的細(xì)胞死亡、凋亡，且破碎的細(xì)胞會(huì)釋放酶類物質(zhì)，胞內(nèi)細(xì)菌也會(huì)逃出細(xì)胞，這些都有可能會(huì)破壞上清中外泌體囊膜的完整性，進(jìn)而影響外泌體的總量。已有研究報(bào)道，脂多糖可以刺激奶牛BMEC產(chǎn)生外泌體，引起外泌體中的miRNA差異變化[31-32]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)刺激牛BMEC產(chǎn)生外泌體通過激活p38-MAPK通路抑制牛巨噬細(xì)胞的增殖，并可能干擾奶牛的免疫力[33]。本研究檢測(cè)不同MOI處理和培養(yǎng)時(shí)間的外泌體總量蛋白濃度，結(jié)果無顯著差異，這可能與奶牛乳腺的天然免疫機(jī)制有關(guān)。據(jù)報(bào)道，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌可引起奶牛乳腺較為緩慢或中等程度的免疫反應(yīng)[34]，與金葡菌有關(guān)的乳房炎引起的先天免疫反應(yīng)非常緩慢甚至不可察覺[35]。這種情況下外泌體總量無顯著差異，但外泌體功能可能存在一定的差異。自噬是一種參與清除入侵的病原微生物的生物過程，自噬體吞噬病原體并與溶酶體融合以發(fā)揮降解作用[36]。然而，一些細(xì)菌通過干擾自噬來逃避自噬降解機(jī)制，從而為自身的生存創(chuàng)造了有利條件。黏附侵襲性大腸桿菌感染腸上皮細(xì)胞后，細(xì)胞分泌的外泌體可以將特定的miRNA(如miR-30c和miR-130a)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，從而抑制自噬介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌清除過程[30,37]。外泌體也與攜帶成孔α-毒素的金葡菌的致病性密切相關(guān)[38]。上述研究證實(shí)細(xì)菌感染會(huì)促使細(xì)胞釋放外泌體，但細(xì)菌侵入BMEC時(shí)自噬是否參與了細(xì)菌感染機(jī)制有待進(jìn)一步研究。今后將進(jìn)一步研究細(xì)菌感染對(duì)細(xì)胞釋放的外泌體攜帶物質(zhì)組成及功能的影響。

4 結(jié) 論

本研究從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征等方面證實(shí)試驗(yàn)獲得的分離物為外泌體；MOI=10時(shí)，金葡菌處理細(xì)胞3 h后繼續(xù)無外泌體培養(yǎng)12 h，收獲的細(xì)胞上清中外泌體蛋白含量最高。本研究可為金葡菌誘導(dǎo)BMEC釋放外泌體的后續(xù)研究提供參考。