張權(quán)威，都萌萌，程 明，戴正浩，劉開東，林曉坤，高而尚，秦至莉，趙金山，李和剛

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109；2.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，青島 266100)

羊角是羊的標(biāo)志性特征之一，但并非經(jīng)濟(jì)性狀。在野生情況下，羊角是羊?yàn)榱宋渑?、爭奪地位等進(jìn)行爭斗的重要工具。在現(xiàn)代畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，有角山羊打斗明顯且占有優(yōu)勢地位，飼喂時(shí)搶料嚴(yán)重，而且打斗還會造成流產(chǎn)甚至骨折、乳房撕裂等情況，給飼養(yǎng)管理造成極大的困難，從而增加經(jīng)濟(jì)成本。而無角羊與有角羊相比不僅減少了個(gè)體之間相互爭斗帶來的經(jīng)濟(jì)損失，而且也有利于對家畜的大批量圈養(yǎng)，更利于養(yǎng)殖和管理。因此，培育無角羊品系已經(jīng)成為羊育種發(fā)展的趨勢。

據(jù)報(bào)道，松弛素家族肽受體2(relaxin family peptide receptor 2,RXFP2)是影響綿羊角的有無、大小和角型的主要候選基因[1-4]，關(guān)于綿羊多角性狀的候選基因較多，主要有同源框基因家族D(homeobox gene family D,HOXD)和RXFP2基因等[5-8]。在山羊中同樣存在無角變異，但與綿羊不同的是山羊的無角性狀與間性性狀是緊密連鎖的，稱為無角間性綜合征(polled intersex syndrome，PIS)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于山羊1號染色體上約129 Mb處的11.7 kb缺失，并影響叉頭轉(zhuǎn)錄因子2(fokhead box L2,FOXL2)和PIS區(qū)調(diào)控的第一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(PIS regulated transcript number 1,PISRT1)的轉(zhuǎn)錄造成的[9]。有學(xué)者認(rèn)為間性奶山羊中11.7 kb片段的缺失不是完全的而是部分的[10-11]，其中198 bp替換和108 bp缺失也可能引發(fā)奶山羊的間性[10]。Simon等[12]研究揭示了一種更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異，認(rèn)為間性奶山羊的出現(xiàn)是由于1號染色體上約129 Mb區(qū)域總長度為約10.1 kb的缺失和1個(gè)反向插入的約480 kb大小的重復(fù)片段導(dǎo)致的。盡管目前的研究定位了山羊PIS基因的可能突變區(qū)，但具體作用機(jī)制還不清楚，嚴(yán)重阻礙了無角山羊的品種培育進(jìn)程。因此，本試驗(yàn)以嶗山奶山羊?yàn)檠芯繉ο?，分析嶗山奶山羊PIS基因的遺傳變異特點(diǎn)，為培育嶗山奶山羊無角新品系提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集青島地區(qū)155只嶗山奶山羊全血樣品，其中間性山羊36只，有角公羊9只，有角母羊34只，無角母羊29只，無角公羊47只，用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取血液樣品基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 間性山羊的表型特征分析 根據(jù)36只間性嶗山奶山羊外生殖器的形態(tài)特點(diǎn)，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 本研究涉及的引物共分為3部分：遺傳性別判定引物、PIS區(qū)198 bp替換和108 bp缺失的基因型鑒定引物以及PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定引物。遺傳性別判定引物的設(shè)計(jì)參考性別決定區(qū)Y基因(sex determination region Y,SRY)序列(JN561348)；內(nèi)參引物則根據(jù)GAPDH基因序列(NM_001190390)設(shè)計(jì)。PIS區(qū)198 bp替換和108 bp缺失的基因型鑒定引物PIS wt-1則參考Li等[10]11.7 kb片段變異檢測引物，其驗(yàn)證引物是在PIS區(qū)設(shè)計(jì)1對包含PIS wt-1的引物PIS wt-3；PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定引物則根據(jù)山羊1號染色體PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)特征，結(jié)合NCBI公布的山羊基因組DNA的完整序列信息(RefSeq:NC_030808.1)進(jìn)行設(shè)計(jì)。利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。各鑒定引物在1號染色體上的位置如圖1所示，引物序列信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 PIS基因型鑒定引物在1號染色體上的位置Fig.1 Location of PIS genotype identification primers on chromosome 1

表1 引物信息

1.2.3 遺傳性別鑒定 PCR擴(kuò)增SRY和GAPDH基因片段，通過檢測2個(gè)特異性片段的有無確定155只山羊的遺傳學(xué)性別。2個(gè)特異性片段(379、579 bp)同時(shí)存在則為雄性，只存在579 bp則為雌性。PCR擴(kuò)增體系25 μL：1.1×Golden Star Super PCR Mix 22 μL，DNA 1 μL，上、下游引物(SRY-F/R、GAPDH-F/R)各1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.4 PIS區(qū)198 bp替換和108 bp缺失的基因型鑒定 利用PIS wt-1檢測有角、無角和間性山羊，分析間性山羊在129 427 003～129 427 905 bp區(qū)域是否存在198 bp替換和108 bp缺失；同時(shí)利用PIS wt-3驗(yàn)證山羊PIS區(qū)是否存在不完全缺失。PCR擴(kuò)增體系10 μL：1.1×Golden Star Super PCR Mix 8.8 μL，DNA 0.4 μL，上、下游引物(PIS wt-1-F/R、PIS wt-3-F/R)各0.4 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.5 PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定 PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定具體涉及3對引物(PIS wt-2-F/R、PIS var-1-F/R、PIS var-2-F/R)，通過檢測3個(gè)特異性片段的有無來確定155只山羊的PIS基因型。擴(kuò)增PIS var-1和PIS var-2片段是為了驗(yàn)證山羊PIS基因的缺失類型。不同基因型山羊的擴(kuò)增片段組合如表2所示。PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序同1.2.3。

表2 3種PIS生殖缺陷基因型的片段大小

2 結(jié) 果

2.1 間性山羊的表型特征分析

按照間性山羊外生殖器的形態(tài)特點(diǎn)可將其分為3種類型：①大陰蒂雄性假間性有17只，其陰戶縮小且陰蒂增大而突出陰戶之外，性腺為睪丸組織；②擬雌性假間性有12只，其陰蒂增大，狀如陰莖，陰戶縮小嚴(yán)重且與肛門之間的距離增大;③短陰莖間性有7只，其外表為雄性，但陰莖發(fā)育不全，內(nèi)部有兩性生殖管道與睪丸。

2.2 遺傳性別鑒定

由圖2可知，正常母羊的擴(kuò)增產(chǎn)物只有1條579 bp條帶，正常公羊的擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)具有579和379 bp 2條帶。間性山羊中只檢測出579 bp條帶，并未檢測到379 bp條帶，說明間性山羊的性染色體為XX。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，有角母羊；3，有角公羊；4、5，無角母羊；6，無角公羊；7～9，間性山羊M,DL2000 DNA Marker;1 and 2,Horned ewes;3,Horned rams;4 and 5,Hornless ewes;6,Hornless rams;7-9,Intersex goats圖2 遺傳性別判定結(jié)果電泳圖Fig.2 Electrophoretic diagram of genetic sex determination results

2.3 PIS區(qū)198 bp替換和108 bp缺失的基因型鑒定

利用PIS wt-1檢測無角山羊(圖3A)和有角山羊(圖3B)都顯示出903和713 bp條帶，而間性山羊只顯示出713 bp條帶(圖3B)。利用PIS wt-3檢測間性山羊時(shí)并未檢測出1 438 bp條帶(圖4)，說明在1號染色體129 427 003～129 427 905 bp區(qū)域并不存在198 bp替換和108 bp缺失。

①A,無角山羊檢測結(jié)果；B，有角和間性山羊檢測結(jié)果。②M，DL2000 DNA Marker；1～8，無角山羊；9，有角山羊；10～16，間性山羊①A,Test results of hornless goats;B,Horned and intersex goats test results.②M,DL2000 DNA Marker；1-8,Hornless goats;9,Horned goats;10-16,Intersex goats圖3 引物PIS wt-1的PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection results of primer PIS wt-1

2.4 PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，有角山羊只有214 bp片段(圖5A、5B)，其基因型為野生型純合子，并沒有發(fā)生10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)，說明有角山羊并不會出現(xiàn)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異；而間性山羊不僅檢測出了下游斷點(diǎn)的680 bp片段(圖5A)，還檢測出了上游斷點(diǎn)的271 bp片段(圖5B)，其基因型為缺失突變純合子，同時(shí)發(fā)生了10.1 kb的雙缺失和480 kb的雙重復(fù)。在檢測中發(fā)現(xiàn)10只基因型為雙缺失的純合子無角公羊(表3)，其余無角山羊同時(shí)具有214 bp片段以及下游斷點(diǎn)的680 bp片段和上游斷點(diǎn)的271 bp片段(圖5A、5B)，其基因型為突變雜合子，突變基因包含10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)。

M，DL2000 DNA Marker；1～3，有角山羊；4～6，無角山羊；7～9，間性山羊。下同M，DL2000 DNA Marker;1-3,Horned goats;4-6,Hornless goats;7-9,Intersex goats. The same as below圖4 引物PIS wt-3的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 PCR validation results of primer PIS wt-3

A，引物PIS wt-2和PIS var-2的PCR結(jié)果；B，引物PIS var-1的PCR結(jié)果A,The PCR results of primers PIS wt-2 and PIS var-2;B,The PCR results of primer PIS var-1圖5 嶗山奶山羊的2個(gè)結(jié)構(gòu)變異PCR檢測結(jié)果Fig.5 PCR detection results of two structural variations in Laoshan dairy goats

表3 嶗山奶山羊群體PIS生殖缺陷基因型檢測結(jié)果

3 討 論

在山羊中，無角性狀是顯性性狀，而與其緊密連鎖的間性性狀則是隱性性狀，間性山羊表現(xiàn)出一定的發(fā)育障礙和卵巢畸形，無法應(yīng)用于育種。盡管在20年前Pailhoux等[9]就已經(jīng)明確了造成山羊雌性性別反轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象的原因，但是在此后的研究中卻發(fā)現(xiàn)間性山羊的出現(xiàn)并不是簡單的11.7 kb的純合缺失[10-11,13]。而最近的一項(xiàng)研究中使用長讀測序技術(shù)精準(zhǔn)地將PIS缺失區(qū)的長度從11.7 kb縮短至10 159 bp，而且原位于1號染色體150 334 286～150 818 098 bp的約480 kb的重復(fù)序列反向插入到PIS缺失區(qū)的位置中[12]，這種變異在中國唐山奶山羊和金堂黑山羊中也得到了印證[14-15]。本研究結(jié)果表明間性嶗山奶山羊的PIS區(qū)是完全缺失的，且符合10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)插入這一變異特征。另外，在1號染色體129 427 003～129 427 905 bp區(qū)域并不存在198 bp的替換和108 bp的缺失，這與198 bp替換和108 bp缺失也可能引發(fā)山羊間性性狀的結(jié)論并不相同[10]。對155只嶗山奶山羊進(jìn)行基因分型時(shí)發(fā)現(xiàn)所有有角山羊等位基因都是純合的，沒有缺失和重復(fù)；而間性山羊等位基因的缺失和重復(fù)都是純合的，這與先前大部分報(bào)道的結(jié)果一致[12,14-15]，但是與個(gè)別研究結(jié)果不同[10-11]。而在檢測的無角公羊中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因型都是雜合的，只有10只等位基因?yàn)榧兒闲偷碾p缺失無角公羊，與預(yù)期結(jié)果一致。以上結(jié)果證實(shí)了突變雜合子無角母羊是可育的，而間性性狀僅發(fā)生在突變純合子母羊中[16-17]。

目前，推測山羊1號染色體129 Mb處的10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)至少影響FOXL2、PISRT1、鉀離子通道15(potassium inwardly rectifying clannel subfamily J member 15，KCNJ15)和ETS轉(zhuǎn)錄因子(ETS transcription factor，ERG)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響了山羊的性別分化過程。FOXL2基因是哺乳動(dòng)物的雌性性別決定基因[18-19]，具有阻止睪丸形成的功能[20]，其缺失可上調(diào)SRY轉(zhuǎn)錄因子9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)的表達(dá)[21]；研究證明，PIS區(qū)的缺失和480 kb的重復(fù)不僅影響FOXL2基因的轉(zhuǎn)錄[9]，還可導(dǎo)致FOXL2基因下游出現(xiàn)幾個(gè)特定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[14]；在對來自山羊、綿羊和鹿的221個(gè)轉(zhuǎn)錄組的分析中發(fā)現(xiàn)FOXL2基因是一種與角的發(fā)育有關(guān)的基因[22]。PISRT1基因是一種睪丸抑制因子，可抑制SOX9基因的表達(dá)[23]；在間性山羊的性腺中PISRT1基因表達(dá)下降、SOX9基因表達(dá)增加[9]，且其基因多態(tài)性與間性山羊存在緊密聯(lián)系[24]。因此，可將PISRT1基因作為調(diào)控山羊間性性狀的候選基因。480 kb重復(fù)片段包含KCNJ15和ERG基因，而這2種基因的額外拷貝可能在角和性腺發(fā)育中起重要作用。KCNJ15基因在卵泡上皮細(xì)胞中高表達(dá)[25]，說明KCNJ15基因可能參與卵巢功能的發(fā)育。ERG基因不僅是一種致癌基因[26]，還參與生物體的骨骼發(fā)育[27]。以上這些基因可能在角的發(fā)育和生長代謝方面具有潛在的調(diào)節(jié)作用，并且與間性山羊的出現(xiàn)密切相關(guān)。

牛的無角性狀受多個(gè)復(fù)等位基因的控制且不同品種個(gè)體間存在差異已被證實(shí)[28-31]。綿羊的角性狀至少受2個(gè)基因位點(diǎn)的調(diào)控也已經(jīng)被證實(shí)[3-4,7-8]，但是山羊的無角性狀和間性性狀的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)仍不清楚。盡管對間性山羊和正常山羊的PIS變異區(qū)域進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)了顯著的染色體結(jié)構(gòu)差異，但是依然沒有強(qiáng)有力的證明PIS變異區(qū)域的這些序列是如何相互影響的[14]。FOXL2基因功能的喪失導(dǎo)致雌性山羊胎兒出現(xiàn)性反轉(zhuǎn)[19]，而在間性山羊性腺中轉(zhuǎn)基因表達(dá)PISRT1基因并不能逆轉(zhuǎn)山羊的間性性狀[32]；另外，在480 kb處發(fā)現(xiàn)14個(gè)與山羊角型性狀完全相關(guān)的SNPs位點(diǎn)[15]。據(jù)此推斷，山羊的無角顯性基因可能位于480 kb上，而間性山羊的出現(xiàn)是由于10.1 kb的缺失影響了FOXL2基因的轉(zhuǎn)錄造成的，二者緊密連鎖，其雙突變導(dǎo)致山羊出現(xiàn)間性性狀且僅發(fā)生在雌性山羊中，雜合突變僅表現(xiàn)為無角。雖然目前的研究依然沒有解釋清楚無角性狀和間性性狀的作用機(jī)制，但是明確了在間性山羊中10.1 kb的缺失是完全的，并且在嶗山奶山羊中10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)雙突變結(jié)合遺傳學(xué)性別鑒定可以作為診斷間性山羊的依據(jù)。

4 結(jié) 論

間性山羊的出現(xiàn)是由于1號染色體下游129 Mb區(qū)域總長度約10.1 kb的完全缺失和1個(gè)反向插入的約480 kb大小的重復(fù)片段導(dǎo)致，且間性性狀僅發(fā)生在純合子母羊中，而公羊的純合缺失并不會出現(xiàn)間性性狀。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示山羊無角性狀的遺傳機(jī)制以及培育嶗山奶山羊無角新品系提供重要參考。