張鳳暖，高天舒

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110000）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）屬于分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC），是甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）中最常見的組織學(xué)類型，約占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%～90%［1］，大部分DTC 對(duì)手術(shù)、131I 殘甲消融和TSH 抑制治療反應(yīng)良好，可長(zhǎng)期生存，5 年生存率可達(dá)98%［2］。但是約23%的DTC 患者會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中約1/3 在其自然病程或治療過程中逐漸表現(xiàn)出聚碘能力下降，對(duì)放射性131I 治療不敏感，發(fā)展為放射性碘難治性分化型甲狀腺癌［3］（radioiodine refractory differentiated thyroid cancer， RAIRDTC），是臨床治療的難點(diǎn)，10 年生存率下降至10%［4］。BRAFV600E基因突變是PTC 最常見的突變位點(diǎn)，是RAIR-DTC 形成的重要分子基礎(chǔ)之一［5，6］。BRAF 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑關(guān)鍵激活因子之一，BRAFV600E基因15 號(hào)外顯子上第600 位的氨基酸——纈氨酸（V）突變?yōu)楣劝彼幔‥），導(dǎo)致MAPK 通路持續(xù)激活，刺激PTC 細(xì)胞增殖和RAIR-DTC形成［7］。

甲狀腺癌屬中醫(yī)“石癭”范疇，《三因極一病證方論》“堅(jiān)硬不可移者，名曰石癭?！薄锻饪普凇酚涊d“夫人生癭瘤之癥，非陰陽(yáng)正氣結(jié)腫，乃五臟瘀血、濁氣、痰滯而成?！鼻宕夺t(yī)宗金鑒》言“石癭海藻玉壺湯主之”，海藻玉壺湯（HYD）首見于明·陳實(shí)功《外科正宗》，距今400 余年，是治療癭瘤的名方。海藻玉壺湯由海藻、貝母、陳皮、昆布、青皮、川芎、當(dāng)歸、半夏、連翹、甘草、獨(dú)活、海帶組成，具有化痰軟堅(jiān)、理氣消癭的作用。

研究顯示，PTC 術(shù)后在TSH 抑制治療基礎(chǔ)上加用海藻玉壺湯，能有效改善甲狀腺功能，降低Tg［8］；海藻玉壺湯能顯著抑制實(shí)驗(yàn)性TC 荷瘤小鼠趨化因子受體CXCR4 基因及蛋白表達(dá)減緩腫瘤進(jìn)展［9］。海藻玉壺湯還可通過影響細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡抑制實(shí)驗(yàn)性肝癌增殖［10］，通過降低胸腺淋巴瘤小鼠全血黏度和紅細(xì)胞聚集，緩解痰凝血瘀體征，抑止腫瘤進(jìn)展［11］。以上研究均提示海藻玉壺湯可能從多方面多角度發(fā)揮抗癌作用。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示海藻玉壺湯及其拆方可降低實(shí)驗(yàn)性低碘甲狀腺腫大鼠甲狀腺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)［12，13］，促進(jìn)NIS蛋白表達(dá)［14］，并且富碘中藥與無機(jī)碘的作用存在差異［15］。但是，國(guó)內(nèi)外對(duì)海藻玉壺湯在PTC 中的應(yīng)用研究尚少，因此開展本研究。

本研究選擇PTC 中最常見的致癌基因——BRAFV600E突變驅(qū)動(dòng)的PTC 細(xì)胞系BCPAP 細(xì)胞為研究對(duì)象，通過體外實(shí)驗(yàn)，初步評(píng)估海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖的抑制作用，為深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 細(xì)胞株 人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞BCPAP，人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量190～220 g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥物與試劑

海藻玉壺湯湯劑制備：海藻15 g、昆布15 g、海帶7.5 g、浙貝母15 g、半夏15 g、青皮15 g、陳皮15 g、川芎15 g、當(dāng)歸15 g、連翹15 g、甘草15 g、獨(dú)活15 g，購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。以上藥物加水浸泡2 h，煎煮3 次，每次煎煮40 min，合并3 次煎煮液后濃縮成含生藥2 g/mL，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1640 培養(yǎng)基（貨號(hào)：31800-014），購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清（貨號(hào)：04-001-1ACS），購(gòu)自美國(guó)BI；BRAFV600E抑制劑PLX4032（貨號(hào)：HY-12057），購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；KIO3（貨號(hào)：P116291），購(gòu)自中國(guó)Aladdin 公司；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK，貨號(hào)：WL02195），購(gòu)自中國(guó)wanleibio 公司；磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK，貨號(hào)：WLP1512），購(gòu)自中國(guó)wanleibio 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：WLA004），購(gòu)自wanleibio 公司；ECL 發(fā)光液（貨號(hào)：WLA003），購(gòu)自wanleibio 公司；PVDF 膜（貨號(hào)：IPVH00010），購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；MTT（貨號(hào)：KGA311），購(gòu)自美國(guó)凱基。

1.3 含藥血清的制備

40 只健康雌性SD 大鼠，隨機(jī)分為中藥組和空白對(duì)照組，每組20 只。中藥組按體表面積比換算給藥劑量，生藥含量15.5 g/kg，日2 次灌胃；空白對(duì)照組給予等體積去離子水。連續(xù)灌胃1 周，末次給藥后1 h，常規(guī)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min 分離血清，同組樣本混合后，0.22 μm 濾器過濾除菌，56 ℃滅活30～40 min，-80 ℃保存。

1.4 主要儀器設(shè)備

倒置相差顯微鏡（AE31）；酶標(biāo)儀（ELX-800）；雙垂直蛋白電泳儀（DYCZ-24DN）；轉(zhuǎn)移槽（DYCZ-40D）；凝膠成像系統(tǒng)（WD-9413B）。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施

體外實(shí)驗(yàn)分為6 組，A：正常對(duì)照組（人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1+空白血清）；B：模型對(duì)照組（BCPAP 細(xì)胞+空白血清）；C：PLX4032 組（BCPAP 細(xì)胞+空白血清+0.1 μmol/L PLX4032［16］）；D：HYD 組（BCPAP 細(xì)胞+20%HYD 含藥血清）；E：HYD+PLX4032 組（BCPAP 細(xì)胞+20%HYD含藥血清+0.1 μmol/L PLX4032）；F：高碘水組（BCPAP 細(xì)胞+空白血清+13.4 μg/mL KIO3）。

1.6 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Nthy-ori3-1、BCPAP 細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度2×106個(gè)/mL，接種于96孔板，按實(shí)驗(yàn)分組加藥處理，每組設(shè)計(jì)5 個(gè)復(fù)孔，接種后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞分別于培養(yǎng)8、24、72 h，加入50 μL 1×MTT，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去上清，加入150 μL DMSO 溶解細(xì)胞形成的紫色結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在570 nm 處OD 值。

1.7 Western blot 檢測(cè)ERK、pERK

裂解液抽提總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，蛋白樣品20 μL 加入到SDS-PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)印至PDVF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，一抗，4 ℃過夜。TBST 漂洗4 次，加入二抗室溫孵育45 min，TBST 漂洗6 次后，滴加ECL 顯影液，凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖活性的影響

MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖抑制作用隨時(shí)間推移逐漸呈現(xiàn)。8 h 時(shí)各組間增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組在24、72 h 時(shí)BCPAP 細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；24 h 時(shí)，PLX4032 組、20%HYD 組、HYD+PLX4032 組均對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖顯示出抑制趨勢(shì)，但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；72 h 時(shí)，與模型對(duì)照組比較，PLX4032 組、20%HYD 組、HYD+PLX4032 組細(xì)胞增殖活性顯著被抑制（P＜0.05），高碘水組與模型對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與高碘水組比較，PLX4032 組、20%HYD 組、PLX4032+20%HYD 組細(xì)胞增殖活性顯著被抑制（P＜0.05），見表1，不同組別隨時(shí)間變化增殖活性趨勢(shì)見圖1。

圖1 海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖活性的影響Fig 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells

表1 海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖活性的影響（n=5，±s）Tab 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells（n=5，±s）

表1 海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖活性的影響（n=5，±s）Tab 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells（n=5，±s）

注：與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較：△P＜0.05；與高碘水組比較：#P＜0.05。

組別細(xì)胞增殖活性（OD 值）8 h24 h72 h.186±0.0310.252±0.0320.435±0.080 0.638±0.078*0.407±0.067△#0.387±0.045△#0.328±0.032△#0.599±0.046*20.870 0.000正常對(duì)照組模型對(duì)照組PLX4032 組20% HYD 組HYD+PLX4032 組高碘水組FP 0 0.216±0.031 0.206±0.023 0.207±0.021 0.195±0.022 0.211±0.036 0.793 0.565 0.333±0.031*0.292±0.036 0.288±0.033 0.265±0.030 0.315±0.037 4.118 0.008

在抑制BCPAP 細(xì)胞增殖的作用上海藻玉壺湯含藥血清與PLX4032 具有協(xié)同增效作用（F=10.87，P=0.005）。

2.2 海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)的影響

Western Blot 結(jié)果顯示各組間ERK1/2 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但各組間p-ERK1/2 蛋白表達(dá)存在顯著差異（P＜0.05）：與正常對(duì)照組比較，模型組p-ERK1/2 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，PLX4032 組、20%HYD 組、HYD+PLX4032 組p-ERK1/2 蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），高碘水組與模型對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），圖2A 為Western Blot條帶，圖2B 為條帶灰度分析對(duì)比直方圖。

圖2 海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞ERK、p-ERK 蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on the expression of ERK and p-ERK proteins in BCPAP cells

表2 BCPAP 細(xì)胞增殖析因設(shè)計(jì)方差分析（±s）Tab 2 Analysis of variance of factorial design for BCPAP cell proliferation（±s）

表2 BCPAP 細(xì)胞增殖析因設(shè)計(jì)方差分析（±s）Tab 2 Analysis of variance of factorial design for BCPAP cell proliferation（±s）

干預(yù)因素HYD PLX4032 HYD*PLX4032增殖活性0.387±0.045 0.407±0.067 0.328±0.032 F P 40.01 30.90 10.87 0.000 0.000 0.005

3 討論

海藻玉壺湯是治療癭瘤的名方，并在PTC 以及多種癌癥中顯示出抑制癌細(xì)胞增殖，延緩腫瘤進(jìn)展的作用［7-10］。本研究選用帶有BRAFV600E突變遺傳背景的PTC 細(xì)胞系BCPAP 細(xì)胞為研究對(duì)象，使用含藥血清加藥方式給予體外干預(yù)。中藥復(fù)方以含藥血清方式添加至細(xì)胞中，利用了生物體對(duì)中藥復(fù)雜成分的代謝和濾過，能夠反映中藥在機(jī)體內(nèi)經(jīng)消化吸收產(chǎn)生藥效的真實(shí)情況［17，18］。選擇20%海藻玉壺湯含藥血清，以8、24、72 h 作為觀察時(shí)點(diǎn)開展海藻玉壺湯對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖抑制研究。選擇PLX4032 作為陽(yáng)性對(duì)照藥，PLX4032 又名Vemurafenib，是B-Raf 酶抑制劑。海藻玉壺湯為富碘中藥復(fù)方，海藻、昆布、海帶為富碘中藥［19，20］，因此在本研究中特設(shè)置與海藻玉壺湯相同碘含量的KIO3水組作為對(duì)照，用于解釋海藻玉壺湯復(fù)方作用與單純碘劑的差異。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERKs）分為 ERK1 和 ERK2，是MAPK 信號(hào)通路最終效應(yīng)因子，主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)與分化。經(jīng)典的ERK 活化通路由細(xì)胞外不同刺激配體結(jié)合到細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶，激活GTP蛋白，順序激活RAF、MEK，最終磷酸化ERK 蛋白，促使其活化為p-ERK，進(jìn)而易位到細(xì)胞核，磷酸化細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分化。BRAFV600E突變，Raf-MEK-ERK 信號(hào)通路持續(xù)激活，刺激細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，在癌癥發(fā)展中起關(guān)鍵作用［21］。

本研究顯示BCPAP 細(xì)胞增殖活性明顯高于正常甲狀腺細(xì)胞，海藻玉壺湯含藥血清干預(yù)后，BCPAP 細(xì)胞增殖活性被顯著抑制。對(duì)MAPK 通路上ERK 蛋白表達(dá)的分析顯示，BCPAP 細(xì)胞與正常甲狀腺細(xì)胞中ERK 蛋白表達(dá)無差異，而p-ERK 蛋白表達(dá)顯著增加，海藻玉壺湯含藥血清干預(yù)后，p-ERK蛋白表達(dá)降低，但仍高于正常甲狀腺細(xì)胞組，其療效與PLX4032 相當(dāng)。提示海藻玉壺湯抑制BCPAP細(xì)胞增殖的作用可能通過抑制ERK 蛋白磷酸化實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活力和功能最基本、最重要的機(jī)制，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起至關(guān)重要的作用［22］。研究顯示來源于海藻、連翹的槲皮素，來源于青皮、陳皮的川陳皮素和來源于半夏的黃芩素，是海藻玉壺湯的重要活性成分，與PTC 核心靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合力，可能對(duì)PTC 具有直接的治療作用［23］。槲皮素可以提高H9C2 細(xì)胞p-MAPK 和p-ERK1/2 磷酸化水平［24］，Raf 和MEK 蛋白激酶是槲皮素化學(xué)預(yù)防作用的直接分子靶標(biāo)［25］。黃芩素可顯著降低甲狀腺未分化癌細(xì)胞p-ERK/ERK 比值［26］。川陳皮素與順鉑聯(lián)用可以有效降低甲狀腺未分化癌細(xì)胞活力［27］，與索拉非尼有強(qiáng)協(xié)同作用［28］。海藻玉壺湯與PLX4032 合用，有協(xié)同增效作用，海藻玉壺湯能否緩解PLX4032 耐藥性值得深入研究。

海藻玉壺湯是富碘中藥復(fù)方［19，20］，一直以來，碘對(duì)甲狀腺癌的影響存在較大爭(zhēng)議。大多數(shù)的研究表明碘缺乏是甲狀腺腫瘤啟動(dòng)和促進(jìn)因素［29］，糾正碘缺乏癥可能會(huì)使甲狀腺癌亞型向惡性程度降低的方向轉(zhuǎn)變［30，31］，但不會(huì)影響甲狀腺癌的總體風(fēng)險(xiǎn)［32］。碘過量作為甲狀腺癌的危險(xiǎn)因素證據(jù)不足［33］，有限的病例研究提示碘攝入量增加是甲狀腺癌的保護(hù)因素［34］，富含碘的食物可能對(duì)甲狀腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)起保護(hù)作用［32，35］。本研究結(jié)果顯示，與海藻玉壺湯煎劑具有相同碘含量的高碘水組并無抑制BCPAP 細(xì)胞增殖和ERK 磷酸化的作用，提示海藻玉壺湯含藥血清抑制BCPAP 細(xì)胞增殖可能與富含碘無關(guān)；高碘水組呈現(xiàn)出與模型組相似的增殖狀態(tài)，無過度增殖發(fā)生，這在一定程度支持海藻玉壺湯中所含劑量碘不是甲狀腺癌的危險(xiǎn)因素。

海藻玉壺湯含藥血清對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能是通過抑制ERK1/2 蛋白磷酸化這一蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程抑制BCPAP 細(xì)胞增殖；海藻玉壺湯含藥血清可能具有協(xié)助增強(qiáng)PLX4032 療效的作用。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張鳳暖：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)實(shí)施及執(zhí)筆；高天舒：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、審校。

文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突，該研究未涉及任何廠家或其他經(jīng)濟(jì)組織直接或間接經(jīng)濟(jì)或利益贊助。