張 蒙，陳大寶，李靜雅，趙春春，王 艷，2，蔡 標(biāo)，2，3，周 鵬，2，3

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽合肥 230012；2. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽合肥 230012；3. 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230012）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是以進(jìn)行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的中樞退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、記憶障礙及人格精神異常等［1］，主要病理特征為β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）在神經(jīng)組織中沉積形成的老年斑（senile plaque，SP）、tau 蛋白在細(xì)胞內(nèi)異常磷酸化聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neuro fibrillary tangles，NFTs）以及廣泛的海馬神經(jīng)元丟失［2］。研究證明，在各類型炎癥中，NLRP3 炎癥小體是神經(jīng)退行性疾病中最具特征的，特別是在AD 中［3］。NLRP3 炎性小體的激活導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞中Caspase-1 介導(dǎo)的白介素IL-1β 和IL-18 的生成，可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥作為治療AD 的關(guān)鍵性分子靶標(biāo)［4］。NLRP3 信號(hào)通路作為AD 炎癥反應(yīng)中重要的信號(hào)通路，其下游Caspase-1 和GSDMD 信號(hào)通路同樣可能與AD 的發(fā)生有一定聯(lián)系［5］。

大黃為蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的根莖，別名黃良、火參、膚如、將軍等，具有攻積滯、清濕熱、瀉火、活血、祛瘀、解毒等功效［6，7］。其主要成分包括大黃酚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、番瀉苷等，重要的活性成分是蒽醌類化合物及其衍生物［8］。中醫(yī)認(rèn)為，AD 屬“癡呆”范疇，主要病位在腦，其病因?qū)俦咎摌?biāo)實(shí)，本虛多為腎精虧虛、腦髓失充，標(biāo)實(shí)多涉及痰濁、瘀血，其治療原則可考慮以補(bǔ)腎填精為本兼以活血、化瘀、祛痰［9］。因此，大黃所具備活血、祛瘀的功效能針對(duì)AD 中“腦髓失養(yǎng)、痰濁瘀血”的病機(jī)，從而改善AD患者的認(rèn)知功能。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、保護(hù)腦及心臟等活性，同時(shí)還可以改善大腦記憶功能［10，11］，其有效成分可以通過產(chǎn)生抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激等作用起到治療AD 的效果，為后續(xù)臨床治療AD 提供理論依據(jù)［12］。然而，大黃治療AD 的作用機(jī)制尚不明確，因此，深入探討大黃的作用靶點(diǎn)，采用分子對(duì)接的方法來探討大黃的主要活性成分是否能通過NLRP3/Caspase-1/GSDMD 通路作用于AD，并尋找其潛在活性成分，為后期臨床研究和開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。

分子對(duì)接技術(shù)主要針對(duì)一個(gè)或多個(gè)與靶向疾病相關(guān)的靶蛋白，利用相關(guān)軟件對(duì)中藥復(fù)方庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，根據(jù)對(duì)接后的Vina 評(píng)分結(jié)果，尋找與疾病靶蛋白特異性結(jié)合的候選化合物，從中篩選出具有活性的化合物。該方法提高了化學(xué)活性評(píng)價(jià)的效率，為中藥資源的進(jìn)一步研究提供了新方向［13］。本研究借助分子對(duì)接技術(shù)，將大黃中的主要活性化合物與NLRP3/Caspase-1/GSDMD 炎癥信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，探討大黃治療AD 的相關(guān)作用機(jī)制，為今后中藥防治AD 的研究提供方向和思路。

1 資料與方法

1.1 大黃活性成分篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［14］，以“大黃”為關(guān)鍵詞，檢索大黃的所有化學(xué)成分，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)特征（ADME）對(duì)化學(xué)成分的口服利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug likeness，DL）進(jìn)行篩選，并設(shè)置OB≥30%及DL≥18%作為活性分子的篩選條件，篩選出大黃的活性成分有16 個(gè)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)研究，增加大黃酚（MOL001729）［15，16］、大 黃 素（MOL000472）［17，18］、大 黃 素 甲 醚（MOL000476）、大黃酚葡萄糖苷（MOL002244）、大黃素蒽酮（MOL003353）、覆盆子酮（MOL002287）6個(gè)活性化合物［19，20］，共22 個(gè)有效成分，下載化合物的MOL 格式的結(jié)構(gòu)（表1）。

表1 大黃的主要化學(xué)成分Tab 1 The main chemical components of Radix et Rhizoma Rhei

1.2 靶點(diǎn)篩選

以“NLRP3”、“Caspase-1”“GSDMD”為關(guān)鍵詞，從蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB（http：//www1.rcsb.org/）［21］檢索出AD 相關(guān)蛋白靶點(diǎn)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確定最佳靶點(diǎn)為6npy［22］、1rwx［23］、5wqt［24］，并下載其pdb 格式三維結(jié)構(gòu)。

1.3 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

以根據(jù)條件篩選出的大黃活性成分為配體，通過PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)查找的蛋白靶點(diǎn)為受體，通過CBDOCK 網(wǎng)站（http：//clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php）進(jìn)行分子對(duì)接［25］。分別得到每個(gè)化合物與3 個(gè)靶點(diǎn)的對(duì)接得分值（Vina score），Vina score 是用Vina 程序以相應(yīng)的口袋參數(shù)對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接所得到復(fù)合物的得分，得分值越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。另外，考慮到結(jié)合位點(diǎn)盡量一致，以NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的抑制劑MCC950、ML132、LDC7559 與相應(yīng)的靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果為陽(yáng)性參照，篩選出對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

分子對(duì)接結(jié)果顯示，大黃的主要化學(xué)成分均與NLRP3、Caspase-1、GSDMD 靶點(diǎn)具有較好結(jié)合。其中，大黃化學(xué)成分與NLRP3 蛋白靶點(diǎn)結(jié)合親和力較高的前3 位是β-胡蘿卜素氧化物、β-谷甾醇、大黃素甲醚雙葡萄糖苷。見表2、圖1。

圖1 大黃活性成分與NLRP3 靶點(diǎn)對(duì)接示意圖Fig 1 Schematic diagram of active ingredients of Radix et Rhizoma Rhei docking with NLRP3

表2 大黃主要化學(xué)成分與NLRP3 蛋白靶點(diǎn)的對(duì)接情況Tab 2 The docking results of the main chemical components of Radix et Rhizoma Rhei with the NLRP3

與Caspase-1 蛋白靶點(diǎn)結(jié)合親和力前3 位為β-胡蘿卜素氧化物、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚雙葡萄糖苷。見表3、圖2。

表3 大黃主要化學(xué)成分與Caspase-1 蛋白靶點(diǎn)的對(duì)接情況Tab 3 The docking results of the main chemical components of Radix et Rhizoma Rhei with the Caspase-1

圖2 大黃活性成分與Caspase-1 靶點(diǎn)對(duì)接示意圖Fig 2 Schematic diagram of active ingredients of Radix et Rhizoma Rhei docking with Caspase-1

與GSDMD 蛋白靶點(diǎn)結(jié)合親和力前3 位為β-胡蘿卜素氧化物、大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。見表4、圖3。

圖3 大黃活性成分與GSDMD 靶點(diǎn)對(duì)接示意圖Fig 3 Schematic diagram of active ingredients of Radix et Rhizoma Rhei docking with GSDMD

表4 大黃主要化學(xué)成分與GSDMD 蛋白靶點(diǎn)的對(duì)接情況Tab 4 The docking results of the main chemical components of Radix et Rhizoma Rhei with the GSDMD

綜上所述，大黃主要化學(xué)成分與AD 相關(guān)NLRP3、Caspase-1、GSDMD 靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果中，均有β-胡蘿卜素氧化物和大黃素甲醚雙葡萄糖苷，說明其可能是潛在活性成分，其中，結(jié)合效果最佳的是β-胡蘿卜素氧化物，與NLRP3、Caspase-1、GSDMD 靶點(diǎn)的Vina 得分最低，分別為-11.9、-9.0、-7.6，結(jié)合效果均優(yōu)于特異性抑制劑。

3 討論

NLRP3 是一種核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族蛋白，是一種細(xì)胞內(nèi)傳感器，可檢測(cè)各種微生物基序、內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)和環(huán)境刺激物，從而導(dǎo)致NLRP3 炎性體的形成和激活［26］。在各種類型的炎性小體中，NLRP3 炎性小體在神經(jīng)退行性疾病中，尤其是在AD 中最具特征。有研究發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中沉默Caspase-1 和抑制GSDMD 的表達(dá)后，小鼠皮層和海馬中Caspase-1 表達(dá)降低，細(xì)胞焦亡減少，同時(shí)改善了小鼠的認(rèn)知功能，提示NLRP3/caspase-1 途徑介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與AD 的發(fā)病有關(guān)；同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Aβ 誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元中NLRP3/caspase-1 途徑表達(dá)的增加會(huì)使皮層神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞焦亡。Aβ 的沉積和錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集會(huì)激活NLRP3-ASC-pro-Caspase-1 炎性小體，繼而激活Caspase-1，促進(jìn)炎癥因子IL-1β 和IL-18的分泌，引發(fā)細(xì)胞焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，致使神經(jīng)元丟失，最終引發(fā)AD［27-30］。因此，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥，NLRP3 炎性體可能是AD 的關(guān)鍵治療分子靶標(biāo)。

目前，中藥因具有作用平穩(wěn)、毒副作用小、耐受性高、多組分、多靶點(diǎn)、多途徑起效的特點(diǎn)，尤其是在慢性炎癥方面發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但是由于受到各方面條件的限制，關(guān)于抗炎藥物及其作用機(jī)制方面的研究面臨困難。分子對(duì)接技術(shù)在中藥活性成分的虛擬篩選和確定作用靶標(biāo)等方面已成功運(yùn)用。通過對(duì)接中藥活性成分與信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)，篩選出與特定靶點(diǎn)結(jié)合緊密的活性成分，從而構(gòu)建了藥物-疾病-靶點(diǎn)之間的關(guān)系［31］。然而，分子對(duì)接技術(shù)在中藥領(lǐng)域的研究思路和方法仍存在一定的局限性，對(duì)接得分最低的化合物也未必是最佳的配體，需要與其他方法相結(jié)合，或者進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究運(yùn)用分子對(duì)接進(jìn)行分析，借助TCMSP可知中藥大黃中22 種主要活性成分，對(duì)NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合，體現(xiàn)了中藥復(fù)方“多成分-多靶點(diǎn)”的作用特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃中的主要活性成分中，其與NLRP3 蛋白靶點(diǎn)結(jié)合親和力較強(qiáng)的10 個(gè)化合物中，最優(yōu)化合物是β-胡蘿卜素氧化物，其次是蒽醌類化合物，主要包含7 個(gè)蒽醌化合物，分別為大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚葡萄糖苷、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素蒽酮。與Caspase-1 蛋白靶點(diǎn)結(jié)合親和力最強(qiáng)的是β-胡蘿卜素氧化物，其他排名靠前的蒽醌類化合物有大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素、大黃素蒽酮、番瀉苷E_qt、番瀉苷D_qt 和大黃酸。與GSDMD 蛋白靶點(diǎn)結(jié)合親和力最強(qiáng)為β-胡蘿卜素氧化物，其他化合物以蒽醌類化合物為主，主要有大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃素-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚、番瀉苷E_qt 和大黃素。由此說明，大黃可能通過作用于NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，為揭示大黃防治AD 的抗炎作用機(jī)制提供理論依據(jù)。除此之外，大黃中與NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號(hào)通路中的三個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合最強(qiáng)的化合物是β-胡蘿卜素氧化物，其次是蒽醌類化合物為主，說明β-胡蘿卜素氧化物和蒽醌類化合物有望作為單體或者先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后參與AD 的治療，為后期進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及深入研究大黃防治AD的抗炎機(jī)制提供科學(xué)假設(shè)和理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張蒙：課題實(shí)施及撰寫全文；陳大寶：課題實(shí)施，圖片編輯；李靜雅：課題實(shí)施，圖片編輯；趙春春：課題實(shí)施，圖片編輯；王艷：修改論文；蔡標(biāo)：修改論文、課題來源；周鵬：課題設(shè)計(jì)、修改論文、課題來源。