吳興勇，李雪苗，劉成利，田 申，王彥雙，厲安洋，朱 僑，夏乾峰

（1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，海南?？?571199）

廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)的類鼻疽伯克霍爾德菌（Burkholderia pseudomallei，B. pseudomallei）是類鼻疽的病原體，海南是我國類鼻疽高發(fā)地區(qū)［1，2］。B. pseudomallei毒力強，致病機制不清楚［3］，從分子層面研究其致病機制十分重要。目前B.pseudomallei的基因編輯技術(shù)還不夠完善，原核生物同源重組基因敲除技術(shù)是研究細菌基因功能的重要手段，以此為基礎(chǔ)研發(fā)高效的基因敲除工具可為提升B.pseudomallei分子研究水平打下基礎(chǔ)。

（p）ppGpp 是細菌應(yīng)對外界各種不良環(huán)境壓力的嚴謹反應(yīng)機制，這種強烈的反應(yīng)是由四磷酸鳥苷（ppGpp）和五磷酸鳥苷（pppGpp）介導(dǎo)營養(yǎng)匱乏脅迫條件下的應(yīng)激信號系統(tǒng)，這種機制也可能促進抗生素耐受性［4，5］。（p）ppGpp 是由GDP 或GTP 通過relA和spoT兩種酶合成，relA起主要合成作用，spoT是一種雙功能酶，同時具有合成酶和水解酶的活性［6］。（p）ppGpp 影響細菌的生長、適應(yīng)、運動、耐受性、毒力以及生物膜的形成和發(fā)育［7］。本研究通過構(gòu)建HNBP001 的ΔrelA缺失菌株來探尋B. pseudomallei更有效且應(yīng)用門檻低的基因敲除方法，并探究其對B. pseudomallei生長、泳動、生物被膜的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)和重組質(zhì)粒構(gòu)建

類鼻疽伯克霍爾德菌HNBP001 由本課題組提供且基因組序列已上傳至NCBI［8］。DH5α 感受態(tài)細胞和S17-1 感受態(tài)細胞均購自北京莊盟國際生物有限公司。除基因敲除轉(zhuǎn)化子篩選用含15%蔗糖（不含NaCl）平板且在室溫進行培養(yǎng)外，其余均于LB 培養(yǎng)基中37 ℃條件下進行培養(yǎng)，根據(jù)需要添加瓊脂和相應(yīng)濃度的抗生素。TPR-pK18mobSacB 重組質(zhì)粒改造由本實驗室劉成利老師構(gòu)建并惠贈。

1.2 主要試劑和儀器

基因組提取試劑盒，天根；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑，OMEGA；PrimeSTAR Max DNA Polymerase ，TaKaRa。限制性內(nèi)切酶（BglⅡ、BamHⅠ、XbalⅠ、HindⅢ）和T4 DNA 連接酶，NEB。 YEAST，OXOID；TRYPTONE，OXOID；蔗糖，西隴科學(xué)；氯化鈉，西隴科學(xué)；50×TAE Buffer，生工；細菌培養(yǎng)皿，biosharp；96 孔板，CELL TER；多功能酶標儀，Biotek；凝膠成像分析系統(tǒng)，君意；A2 生物安全柜，海爾；PCR 擴增儀，eppendorf。

1.3 引物

根據(jù)與NCBI 上的B. pseudomalleiK96243 基因組的序列比對分析確定HNBP001 的relA基因，NCBI 基因坐標位于1 號染色體上的2140463-2142700 （B. pseudomalleiK96243， 2317104-2319341）位置。 并根據(jù)GenBank 中HNBP001（GenBank：CP038806.1）的relA基因序列設(shè)計引物。引物ΔrelA-LF/ΔrelA-LR 與ΔrelA-RF/ΔrelARR，分別用于擴增relA基因的上下游同源臂；引物ΔrelA-VF/ΔrelA-VR 用于驗證relA的基因缺失株。引物TPR-F/ TPR-R 用于擴增TPR 抗性片段。引物序列見表1 所示，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列及酶切位點（酶切位點由下劃線表示）Tab 1 Primer sequence and restriction site（restriction site indicated by underscore）

1.4 pK18mobSacB 質(zhì)粒改造

以課題組田申老師惠贈的質(zhì)粒為模板，根據(jù)制造商提供的序列，設(shè)計含BglⅡ酶切位點的一對引物TPR-F/TPR-R，使用TaKaRa 高保真酶擴增其含啟動子的TPR 抗性片段。將擴增的基因產(chǎn)物進行純化后分別使用限制性內(nèi)切酶BglⅡ?qū)PR 抗性片段及pK18mobSacB 質(zhì)粒分別進行單酶切，酶切產(chǎn)物純化后經(jīng)T4 DNA 連接酶進行連接。連接后轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞擴增質(zhì)粒，TPR 抗性進行對應(yīng)抗生素篩選后提取質(zhì)粒，酶切進行驗證，將改造質(zhì)粒命名為TPR-pK18mobSacB。PCR 擴增條件：98 ℃變性10 s、59 ℃退火5 s、72 ℃延伸10 s，30 個循環(huán)。

1.5 缺失株構(gòu)建

敲除載體的構(gòu)建同pK18mobSacB 質(zhì)粒改造方法，以HNBP001 的基因組為模板，引物ΔrelA-LF/ΔrelA-LR 和ΔrelA-RF/ΔrelA-RR 分別擴增待敲除目的基因relA的上下游同源臂（L，R），經(jīng)酶切酶連將其連接至TPR-pK18mobSacB 上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，經(jīng)含甲氧芐啶的培養(yǎng)基進行篩選，挑取單克隆于含有甲氧芐啶的液體培養(yǎng)基進行擴增，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后進行酶切驗證，將酶切驗證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。取測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化S17-1 感受態(tài)細胞，S17-1 感受態(tài)細胞具有天然的壯觀霉素、鏈霉素和甲氧芐啶抗性，必須使用卡那霉素進行轉(zhuǎn)化子的篩選。挑取含卡那霉素抗性的單菌落以及用無抗LB 培養(yǎng)的HNBP001 新鮮單菌落分別用LB 液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

一般在生長14～16 h 后，菌液達到轉(zhuǎn)化所需的濃度。利用兩個滅菌的1.5 mL 離心管各收集1 mL菌液，5 400 g 離心5 min，利用500 mL 的LB 清洗菌體，并最終使用500 mL 的LB 對菌體重懸，各取100 μL 混合于一個新的1.5 mL 離心管中。取20 μL 混合的菌液滴加在滅過菌的濾膜上，37℃培養(yǎng)箱，正置培養(yǎng)4～5 h。在濾紙上菌液處滴加20 μL LB 培養(yǎng)基，對菌體進行重懸，全量吸取后與180 μL LB 充分混勻。取100 μL 菌液涂布含甲氧芐啶和慶大霉素（B. pseudomallei菌株具有天然慶大霉素抗性）雙抗板涂布培養(yǎng)進行篩選。對于接合成功的菌落進行第二輪篩選在含15% 蔗糖（不含NaCl）平板中進行，以促進載體的丟失。使用各自的驗證引物，通過PCR 驗證來確定缺失株的獲得。PCR 擴增條件：98 ℃變性10 s、68 ℃退火5 s、72 ℃延伸10 s，30 個循環(huán)。

1.6 生長曲線測定

挑取新鮮LB 培養(yǎng)基中生長的HNBP001 及其ΔrelA缺失株單菌落，在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。菌液均用LB 液體培養(yǎng)基稀釋至OD600=0.05，取稀釋好的200 μL 菌液至96 孔板，每個樣本3個復(fù)孔，在多功能酶標儀（Biotek）中37 ℃180 r/min軌道振蕩培養(yǎng)48 h，連續(xù)動態(tài)每間隔2 h 自動測定1次OD600nm 的吸光度。

1.7 生物被膜測定

同生長曲線測定方法將菌液均一化至OD600=0.1。結(jié)晶紫染色法參考文獻的方法［9］：取稀釋好的200 μL 菌液至96 孔板，3 個復(fù)孔培養(yǎng)48 h 后小心去除上清液，然后96 孔板用200 μL 1×PBS 洗滌3 次，晾干后200 μL 1%結(jié)晶紫染色30 min；再用200 μL 1×PBS 洗滌2 次，晾干后用200 μL 30%乙酸孵育20 min，OD600測吸光度。玻璃試管觀察法：分別取稀釋好的2 mL 菌液于玻璃試管中，培養(yǎng)48 h 后觀察。

1.8 泳動性測定

同生長曲線測定方法將菌液均一化至OD600=0.1，分別吸取2 μL 菌液至0.3%瓊脂LB 培養(yǎng)基中正置培養(yǎng)，3 個重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察并測量細菌泳動圈的直徑。

1.9 實驗數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 9.0 版本軟件及配對t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建TPR-pK18mobSacB 載體質(zhì)粒

為了提高HNBP001 菌株基因敲除效率，通過BglⅡ單酶切位點將甲氧芐啶抗性片段插入自殺性質(zhì)粒pK18mobSacB，pK18mobSacB 質(zhì)粒圖譜如圖1A 所示，改造后含TPR 抗性片段的TPRpK18mobSacB 質(zhì)粒如圖1B 所示。構(gòu)建成功的TPR-pK18mobSacB 重組質(zhì)粒使用BglⅡ限制性內(nèi)切酶進行酶切驗證，酶切條帶大小結(jié)果正確，如圖1C 所示，并進行測序，結(jié)果表明TPR-pK18mob-SacB 載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 質(zhì)粒圖譜及TPR-pK18mobSacB 酶切驗證電泳圖Fig 1 Plasmid profile and electrophoresis of TPR-pK18mobSacB digestion verification

2.2 構(gòu)建ΔrelA 重組載體質(zhì)粒

為了構(gòu)建HNBP001 的ΔrelA缺失株，先PCR擴增relA基因上下游同源臂（L，R），再通過酶切酶連插入TPR-pK18mobSacB 載體質(zhì)粒，使用TPR 抗性進行篩選，如圖2A 所示。將構(gòu)建成功的ΔrelA重組載體質(zhì)粒BamH Ⅰ、Hind Ⅲ進行酶切驗證，重組載體質(zhì)粒酶切驗證條帶大小符合預(yù)期，結(jié)果表明重組載體質(zhì)粒構(gòu)建成功，如圖2B 所示，紅色箭頭指示條帶為連接的上下臂。

2.3 構(gòu)建ΔrelA 缺失株

同源重組構(gòu)建ΔrelA缺失株的方法如圖2A 所示。將重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化S17-1 感受態(tài)細胞與HNBP001 進行接合，第一輪篩選用雙抗甲氧芐啶和慶大霉素進行轉(zhuǎn)化子篩選，第二輪篩選用15%蔗糖板進行篩選，獲得丟失重組載體質(zhì)粒的缺失菌株。缺失株用驗證引物relA-VF/relA-VR 對其進行驗證，通過正確的條帶大小進行確定，如圖2C 所示。

圖2 同源重組模式圖及relA 缺失株電泳圖Fig 2 Homologous recombination pattern and electrophoresis results of mutant

2.4 敲除relA 對HNBP001 生長的影響

細菌生長代謝在適應(yīng)外界環(huán)境脅迫中起著重要作用，當細菌遭遇不良環(huán)境（如抗生素、紫外線、溫度等）時，細菌為了生存，會通過降低生長速度來適應(yīng)逆境生存。為了探究relA是否對HNBP001 生長產(chǎn)生影響，通過比較HNBP001 野生株及其ΔrelA缺失菌株在營養(yǎng)豐富的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 的生長情況，如圖3A 所示。OD600nm 濁度測量顯示，HNBP001 與ΔrelA缺失菌株在對數(shù)期8 h 左右前生長速度無明顯區(qū)別，此后ΔrelA缺失菌株生長速度均低于HNBP001。結(jié)果表明，當ΔrelA缺失時，（p）ppGpp 合成水平降低，從而抑制細菌的生長。有研究發(fā)現(xiàn)（p）ppGpp 水平的升高和降低都能顯著抑制大腸桿菌的生長，增加（p）ppGpp 水平會限制核糖體的合成，而降低（p）ppGpp 水平會限制代謝蛋白的表達［10］。

圖3 生長曲線及泳動性Fig 3 Growth curve and motility

2.5 relA 對HNBP001 泳動性的影響

已有文獻研究表明（p）ppGpp 會調(diào)控鞭毛的合成，細菌通過鞭毛實現(xiàn)其運動性［7］。通過比較野生株及其ΔrelA缺失菌株在0.3%軟瓊脂LB 半固體培養(yǎng)基中24 h 的泳動性，觀察到ΔrelA缺失株泳動性低于HNBP001，如圖3B 和C 所示。表明relA基因缺失可抑制HNBP001 泳動性。

2.6 relA 對HNBP001 生物被膜形成的影響

生物被膜與細菌的耐藥密切相關(guān)，作為一個全局性的調(diào)控因子，已經(jīng)有許多研究表明（p）ppGpp 可以參與調(diào)控細菌的生物膜形成［11］。如圖4A 所示，在培養(yǎng)48 h 后，觀察到ΔrelA缺失株氣液界面生物被膜比HNBP001 薄且相對松散。結(jié)果表明在缺失relA基因后其生物被膜形成下降且變得更脆弱。結(jié)晶紫染色法觀察到在氣液界面出現(xiàn)一個明顯的結(jié)晶紫染色環(huán)，如圖4B 所示；定量測量結(jié)果如圖4 C 所示，ΔrelA缺失株生物被膜低于HNBP001。表明relA基因缺失對HNBP001 的生物被膜形成具有抑制作用。

圖4 生物被膜Fig 4 Biofilm

3 討論

類鼻疽是一類嚴重潛在的致命性疾病，其復(fù)雜的臨床表現(xiàn)和對許多抗生素的耐藥性嚴重威脅人類生命健康，迄今為止還沒有獲得臨床應(yīng)用的疫苗［12，13］。本課題組通過對蔗糖致死質(zhì)粒pK18mob-SacB 的改造，提高B. pseudomallei基因敲除的效率，兩周左右即可獲得所需的基因缺失菌株。整個基因敲除實驗所需的試劑和儀器要求不高，可廣泛應(yīng)用于研究B. pseudomallei的實驗室。本研究對嚴謹反應(yīng)信號分子（p）ppGpp 合成相關(guān)基因relA進行敲除驗證該方法，以及對其生物學(xué)表型進行測定。

嚴謹反應(yīng)是一種應(yīng)激信號系統(tǒng)，是原核生物應(yīng)對不良生存環(huán)境的一種適應(yīng)機制，使得細菌可以在營養(yǎng)饑餓和其他脅迫的條件下生存，包括抗生素的壓力［14］。（p）ppGpp 信號可能是B. pseudomallei毒力基因表達和脅迫適應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個重要組成部分，其缺失突變體可能是一種有希望的減毒活疫苗候選［15］。細菌在遭遇逆境時，為了生存會產(chǎn)生更耐受該環(huán)境的耐受菌，其可通過降低生長速度、運動以及增加生物膜的形成來應(yīng)對外界的不利環(huán)境［16］。

在抗生素作用下，生長緩慢的耐受菌由于基礎(chǔ)代謝活性的降低，可以避免抗生素的刺激和殺死作用［17］。發(fā)現(xiàn)ΔrelA缺失菌株對數(shù)中晚期和穩(wěn)定期均低于野生株。這與缺失relA基因后（p）ppGpp 水平降低會限制代謝蛋白的表達有關(guān)［10］。（p）ppGpp 合成酶基因參與調(diào)節(jié)溶藻弧菌的運動［18］。結(jié)果顯示，當ΔrelA缺失時泳動性降低，這可能與細菌鞭毛合成需要（p）ppGpp 參與有關(guān)［18］。生物被膜的形成是細菌在敵對環(huán)境或體內(nèi)感染過程中生存的重要策略。生物被膜與細菌的耐藥密切相關(guān)，作為一個全局性的調(diào)控因子，已經(jīng)有許多研究表明（p）ppGpp 可以參與調(diào)控細菌的生物膜形成［11］。與HNBP001 相比，ΔrelA缺失菌株生物被膜形成量下降。

綜上所述，本課題組改造的TPR-pK18mob-SacB 為B. pseudomallei基因功能的研究提供了有利的工具。在relA基因功能的表征中，發(fā)現(xiàn)敲除relA基因會抑制HNBP001 的生長、泳動和生物被膜的形成，為進一步研究relA基因的相關(guān)機制奠定了基礎(chǔ)。

作者貢獻度說明：

吳興勇：課題的設(shè)計與實驗，撰寫論文；夏乾峰：課題設(shè)計及文章進行審校；李雪苗：論文的修訂；劉成利、田申為本課題組老師，參與實驗指導(dǎo)與評估；王彥雙、厲安洋、朱僑為本課題組成員，參與了實驗。

文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。