何 菲，蔣洪久，玉光惠，唐平華

（仁懷醬香白酒科研所，貴州仁懷 564500）

自1979 年輕工業(yè)部主持第三屆全國(guó)評(píng)酒會(huì)以來(lái)，中國(guó)白酒香型歷經(jīng)40 余年的發(fā)展，從最先劃分的醬香、濃香、清香、米香四大基本香型，逐漸衍生出了由其中一種或多種工藝技術(shù)糅合的其他8種獨(dú)特香型。為充分表達(dá)白酒個(gè)性特征，白酒行業(yè)除進(jìn)行一系列色、香、味、格等感官評(píng)價(jià)工作外，還開(kāi)展了大量白酒風(fēng)味特征化合物或主體香味物質(zhì)的研究，普遍認(rèn)同四大酯（乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酸、乳酸乙酯）、四大酸（乙酸、乳酸、己酸、丁酸）、高級(jí)醇（正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇等）等物質(zhì)的香味特征和多組分香味物質(zhì)量比關(guān)系對(duì)白酒風(fēng)味產(chǎn)生的綜合特征貢獻(xiàn)。

隨著色譜技術(shù)推廣和應(yīng)用，大量研究集中對(duì)不同香型白酒中的醇類(lèi)、羰基類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、芳香族類(lèi)、酚類(lèi)、萜烯類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)、氨基酸、無(wú)機(jī)離子等物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和比較分析，這些物質(zhì)既對(duì)白酒產(chǎn)生風(fēng)味貢獻(xiàn)，又蘊(yùn)藏生物活性健康價(jià)值，但也可能存在潛在食品安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，實(shí)驗(yàn)利用GC-MS 對(duì)樣品進(jìn)行Q3-SCAN 定性，參考文獻(xiàn)采購(gòu)色譜對(duì)照品進(jìn)行氣相色譜和離子色譜全譜段定性定量分析，以期探索不同香型白酒中色譜微量成分之間的差異，為白酒香型識(shí)別和感官品評(píng)提供數(shù)據(jù)參考，為白酒微量和痕量物質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)樣品酒樣來(lái)源品酒培訓(xùn)機(jī)構(gòu)香型識(shí)別典型代表酒樣或知名酒企代表酒樣，且同一香型酒樣均來(lái)自不同生產(chǎn)企業(yè)，詳見(jiàn)表1。

表1 不同香型白酒樣品信息

1.1.2 試劑與藥品

乙醇（色譜純），德國(guó)默克股份兩合公司；91 組定性定量色譜標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（純度≥99.5%，包含叔戊醇和乙酸正戊酯2 組內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，15 組分醇類(lèi)物質(zhì)，17 組分羰基類(lèi)物質(zhì)，9 組分酸類(lèi)物質(zhì)，29 組分酯類(lèi)物質(zhì)，6 組分芳香族物質(zhì)，8 組分雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)，4 組分無(wú)機(jī)陰離子，1 組分未作分類(lèi)物質(zhì)），天津西瑪科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Nexis GC-2030 氣相色譜儀，日本SHIMADZU公司；DionexIntegrion HPIC 高壓離子色譜儀，美國(guó)thermo scientific 公司；BS 244S 電子天平（感量：0.0001 g），北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Milli-QAA10 超純水系統(tǒng)，德國(guó)默克密理博公司；MS-X可調(diào)式混勻儀，美國(guó)SCILOGEX 賽洛捷克公司；10～100 μL、100～1000 μL、1～10 mL 移液器，艾德本（中國(guó)）有限公司；10 mL 容量瓶、50 mL 容量瓶、10 mL刻度試管，天津天科玻璃制品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與樣品制備

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液配制：稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品配制高濃度儲(chǔ)備液，配制中間濃度混標(biāo)溶液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)酒樣初測(cè)濃度，配制5 個(gè)合適的曲線(xiàn)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（其中，氣相色譜分析配制76 組分混標(biāo)溶液，高壓離子色譜分析配制13 組分有機(jī)酸酸和無(wú)機(jī)陰離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液）。

氣相色譜分析樣品制備：準(zhǔn)確取5.0 mL待測(cè)酒樣于10 mL 試管中，加入0.1 mL 2%（v/v）叔戊醇和乙酸戊酯2 組分內(nèi)標(biāo)混合溶液，振蕩混勻靜置，穩(wěn)定平衡后，用于GC分析。

離子色譜分析樣品制備：準(zhǔn)確取1.0 mL待測(cè)酒樣于50 mL 容量瓶中，加入二級(jí)去離子水定容，搖晃均勻穩(wěn)定后，用于HPIC分析。

1.2.2 儀器分析方法條件

氣相色譜條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；升溫程序：起始溫度28 ℃，保持12 min，以7.0 ℃/min 升溫至50 ℃，以3.5 ℃/min 升溫至95 ℃，以3.0 ℃/min 升溫至125 ℃，保持8 min，以1.5 ℃/min升溫至145 ℃，以8.0 ℃/min升溫至240 ℃，保持8 min，總時(shí)間80.21 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；FID檢測(cè)器溫度250 ℃（氫氣H流量32.0 mL/min，純度≥99.999 %；干燥空氣Air 流量200.0 mL/min；尾吹氣流量24.0 mL/min）；載氣流速0.5 mL/min（氮?dú)釴，純度≥99.999 %）；載流模式為恒流；分流進(jìn)樣（分流比，45∶1）；進(jìn)樣量1 μL。

高壓離子色譜條件：DionexIonPac AS11-HC 4×250 mm 陰離子色譜柱（配AG11-HC 4×50 mm色譜保護(hù)柱，柱溫箱溫度30 ℃）；EGC 500 KOH 淋洗液自動(dòng)發(fā)生器；AERS 4 mm 自循環(huán)抑制器，抑制電流104 mA；流速：多步梯度類(lèi)型，0～40 min流速1.0 mL/min，40～47 min 流速0.8 mL/min，47～50 min 流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量25.0 μL，稀釋因子50.0；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器，檢測(cè)池溫度35 ℃；KOH淋洗液梯度洗脫程序，詳見(jiàn)表2。

表2 KOH淋洗液梯度洗脫程序

1.2.3 定性定量計(jì)算方法

配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并結(jié)合樣品酒樣，逐一進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，得到儀器分析方法條件，再利用單體標(biāo)準(zhǔn)溶液逐一對(duì)保留時(shí)間定性，或進(jìn)行同類(lèi)屬性化合物分類(lèi)分段保留時(shí)間定性。

根據(jù)預(yù)測(cè)樣品酒樣濃度，配制5 個(gè)合適濃度梯度系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，氣相色譜分析樣品加入內(nèi)標(biāo)，以待測(cè)組分與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比為橫坐標(biāo)，以峰面積比為縱坐標(biāo)，建立內(nèi)標(biāo)法校準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量濃度計(jì)算；高壓離子色譜分析，以待測(cè)組分濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，建立外標(biāo)法校準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量濃度計(jì)算（樣品濃度需換算稀釋倍數(shù)）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SIMCA 14.1 進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis,PLSDA），利用IBM SPSS Statistics 25.0 進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香型白酒分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)根據(jù)氣相色譜和離子色譜分析方法，測(cè)定得到不同香型白酒中15 組分醇類(lèi)物質(zhì)，17 組分羰基類(lèi)物質(zhì)，9 組分酸類(lèi)物質(zhì)，29 組分酯類(lèi)物質(zhì)，6 組分芳香族物質(zhì)，8 組分雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)，4 組分無(wú)機(jī)陰離子，1組分未作分類(lèi)物質(zhì)（詳見(jiàn)表3）。

表3 不同香型白酒香味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 （mg/L）

續(xù)表3 不同香型白酒香味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 （mg/L）

不同香型白酒微量物質(zhì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，醇類(lèi)物質(zhì)總量醬香＞米香＞清香＞濃香；羰基類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)和微量物質(zhì)總量高低順序相同，醬香＞濃香＞清香＞米香；芳香族和無(wú)機(jī)陰離子物質(zhì)總量高低順序相同，米香＞醬香＞清香＞濃香。排序中米香和清香型白酒出現(xiàn)跳位，醬香和濃香型白酒排位順序保持一致。同一香型白酒微量物質(zhì)統(tǒng)計(jì)顯示，醬香和濃香型白酒各物質(zhì)總量占比趨勢(shì)相同，酯類(lèi)＞酸類(lèi)＞醇類(lèi)＞羰基類(lèi)＞雜環(huán)類(lèi)＞無(wú)機(jī)陰離子＞芳香族；清香和米香型白酒各類(lèi)物質(zhì)總量占比趨勢(shì)相同，酯類(lèi)＞酸類(lèi)＞醇類(lèi)＞羰基類(lèi)＞無(wú)機(jī)陰離子＞芳香族＞雜環(huán)類(lèi)，在雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)和無(wú)機(jī)陰離子占比排序上存在差異。

2.2 不同香型白酒香味物質(zhì)差異比較

為進(jìn)一步比較各香味物質(zhì)濃度含量在不同香型白酒之間的差異，對(duì)分析測(cè)定的醇類(lèi)、羰基類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、芳香族、雜環(huán)類(lèi)、無(wú)機(jī)陰離子等89 組香味物質(zhì)含量進(jìn)行PLS-DA分析。

通過(guò)PLS-DA 模型[R2X(cum)=0.603,R2Y(cum)=0.918,Q2(cum)=0.829]可將不同香型白酒有效區(qū)分，模型解釋變量(R2Y)接近1，預(yù)測(cè)能力(Q2)大于0.5，且經(jīng)過(guò)200 次置換驗(yàn)證Q2 回歸線(xiàn)截距為負(fù)值（醬香-0.377，濃香-0.327，清香-0.345，米香-0.41），說(shuō)明模型無(wú)過(guò)擬合現(xiàn)象，可用于不同白酒香型分類(lèi)差異剖析，R2X[1]、R2X[2]、R2X[3]因子得分二維和三維散點(diǎn)圖如圖1所示。

圖1 不同香型白酒微量物質(zhì)含量PLS-DA分析

PLS-DA 變量重要因子（Variable Importance for the Projection，VIP）表征了分類(lèi)過(guò)程中各個(gè)變量的重要性，通常VIP 值大于1 的變量在不同樣本組之間的區(qū)分中起重要作用。通過(guò)VIP 值篩選出29 個(gè)差異標(biāo)記物，ANOVA 分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這些物質(zhì)含量在不同香型之間是否具有顯著差異（P＜0.05），最終確定28 個(gè)白酒香型差異標(biāo)記物（詳見(jiàn)表4）。

表4 基于PLS-DA 篩選不同香型白酒差異標(biāo)記物

統(tǒng)計(jì)PLS-DA 篩選差異標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)酯類(lèi)物質(zhì)有豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯、丁二酸二乙酯、亞油酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、油酸乙酯、庚酸乙酯12 個(gè)組分，醇類(lèi)物質(zhì)有甲醇、異戊醇、正辛醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、正己醇、仲戊醇、2,3-丁二醇（內(nèi)消旋）7 個(gè)組分；芳香族物質(zhì)有β-苯乙醇、苯甲醛2 個(gè)組分；酸類(lèi)物質(zhì)有異戊酸、丁酸、乳酸、己酸4 個(gè)組分；羰基類(lèi)物質(zhì)有3-乙氧基-1-丙醇、3-羥基-2-丁酮2個(gè)組分；無(wú)機(jī)陰離子有PO1個(gè)組分。

結(jié)合表3 各香型白酒濃度含量分析，VIP 值大于1 的28 種差異標(biāo)記物中醬香型白酒中含量相對(duì)其他香型較高的有苯甲醛、2,3-丁二醇(內(nèi)消旋)、3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-羥基-2-丁酮、亞油酸乙酯、油酸乙酯、乳酸等；濃香型白酒中含量相對(duì)其他香型較高的有仲戊醇、正己醇、正辛醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、丁酸、異戊酸、己酸等；清香型白酒中含量相對(duì)其他香型較高的有丁二酸二乙酯，其余差異標(biāo)記物相對(duì)其他香型白酒較低；米香型白酒中含量相對(duì)其他香型較高的有β-苯乙醇、異戊醇、3-乙氧基-1-丙醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、亞油酸乙酯、PO等。

3 結(jié)論

本研究采用實(shí)驗(yàn)室常用的氣相色譜儀和離子色譜儀測(cè)定4 大香型白酒中微量物質(zhì)組分的精確含量，并全面解析不同香型白酒之間的差異?？傮w上醬香和濃香型白酒擁有大量的酯類(lèi)、酸類(lèi)物質(zhì)，且醬香型白酒含有較高的羰基類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)；清香和米香型白酒微量物質(zhì)種類(lèi)和含量相對(duì)較為簡(jiǎn)單，但米香型白酒中含有較高的芳香族和無(wú)機(jī)陰離子物質(zhì)，清香型白酒則表現(xiàn)較為平常單一。研究進(jìn)一步利用偏最小二乘回歸分析法篩選出28 種差異特征標(biāo)記物，主要代表有β-苯乙醇、苯甲醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇、正己醇、正辛醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、丁酸、異戊酸、己酸、乳酸等，在不同香型白酒中貢獻(xiàn)了不同程度的香氣和口味特征。本研究建立的氣相色譜法和離子色譜法可在生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)一步推廣運(yùn)用，差異特征標(biāo)記物也可用于白酒香型品評(píng)評(píng)價(jià)。