張志偉，聶士昊，汪俊卿，王瑞明，張子洋，申作樹，王龍祥，李丕武

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東濟南 250399；2.山東福瑞王酒業(yè)有限公司，山東臨沂 276621）

白酒是世界六大蒸餾酒之一，有12 種香型?！八母邇砷L”的發(fā)酵特點賦予了醬香型白酒獨特的醬香味，其“醬香突出、醇厚綿長”等特點深受廣大消費者的喜愛。白酒釀造本質(zhì)上是各類微生物作用于糧谷后進行的代謝反應(yīng)，南北方環(huán)境差異對酒醅中的微生物影響很大，進而影響白酒風(fēng)味。在對南方醬香酒酒醅微生物研究過程中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌、絲狀真菌、酯化酵母這三類微生物在發(fā)酵過程中多次被檢測到，猜想這些微生物對醬香酒風(fēng)味有重要影響。

白酒釀造過程中微生物種類、數(shù)量是在不斷變化的，現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進步提供了先進檢測方法，例如16S rRNA 和ITS rDNA 檢測提供了細菌和真菌的同源性分析，運用PCR-DGGE 方法可對酒曲細菌多樣性進行分析等。高通量測序目前運用在很多方面，這項技術(shù)可以快速測序幾十萬到上百萬DNA，并且可以檢測含量極低的DNA，目前高通量測序已經(jīng)在發(fā)酵食品的真菌檢測，海水微生物檢測，土壤中微生物檢測和醫(yī)學(xué)上進行應(yīng)用。采用高通量測序技術(shù)對南方醬香型白酒微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)在第四輪次酒醅中主要優(yōu)勢真菌有嗜熱子囊菌屬（）、嗜熱真菌屬（）；堆積發(fā)酵過程中乳酸桿菌屬、埃希氏菌屬（）和芽孢桿菌屬（）為優(yōu)勢細菌；窖池發(fā)酵階段乳酸桿菌屬占絕對主導(dǎo)地位，并且豐度隨著發(fā)酵的進行不斷上升。

運用氣相色譜聞香法（GC-O）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等現(xiàn)代方法對醬香白酒風(fēng)味物質(zhì)進行檢測，發(fā)現(xiàn)己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量突出。四甲基吡嗪不但能賦予醬香酒獨特風(fēng)味，還是中藥材川芎根莖的主要活性成分，具有治療心血管疾病，保護肝臟等作用；乙酸乙酯對甲醛具有抑制作用，可以加快身體里不良物質(zhì)的代謝；己酸乙酯有維護心肺功能的作用；4-甲基愈創(chuàng)木酚等酚類物質(zhì)具有預(yù)防疾病、抗衰老等作用。這些風(fēng)味物質(zhì)的提高不僅有助于北方醬香白酒風(fēng)味的改善，還對消費者有促進健康的積極作用。

通過和北方醬香酒公司進行合作，加入芽孢桿菌、絲狀真菌、酯化酵母3 種微生物，結(jié)合高通量測序和氣相-質(zhì)譜（GC-MS）結(jié)果進一步了解這三類菌對醬酒的風(fēng)味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：酒醅，山東福瑞王酒業(yè)有限公司的第五輪次發(fā)酵結(jié)束時，取上層、中層、下層及三層酒醅混合的4個酒醅樣品；酒樣，對應(yīng)酒醅蒸餾的酒樣。

取樣方法：根據(jù)五點等距取樣方法，在上、中、下層的中心點取樣，保持相同的距離。

微生物：芽孢桿菌、絲狀真菌、酯化酵母，實驗室保存菌種。

LB 培養(yǎng)基：5 %酵母浸粉，10 %蛋白胨，10 %氯化鈉，加去離子水后121 ℃滅菌20 min。

儀器設(shè)備：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），型號GCMS-QP2020，日本島津公司；Hermle 500 mL離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1 強化酒醅制作方法

（1）上述3 種微生物用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，隨后離心沉淀。

（2）制作種子強化大曲：在制作普通大曲的培養(yǎng)過程中，向大曲中添加質(zhì)量10 %的微生物沉淀（50%芽孢桿菌、20%絲狀真菌、30%酯化酵母）。

（3）強化酒醅制作：向酒醅中加入酒醅質(zhì)量0.7%的大曲（10%強化大曲、90%普通大曲）。

1.2.2 酒醅的取樣方法

在第五輪次發(fā)酵結(jié)束后，立即對對照組上層（SC-1）、對照組中層（ZC-1）、對照組下層（XC-1）以及實驗組上層（SC-2）、實驗組中層（ZC-2）、實驗組下層（XC-2）的酒醅進行五點取樣，取500 g 酒醅放入無菌的離心管中，立即存放至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。對每池的酒醅進行混合，對照組三層酒醅混合樣（HH-1）、實驗組三層酒醅混合樣（HH-2）共計8 個酒醅樣送高通量測序。對照組和實驗組各取500 mL蒸餾酒，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 高通量測序測序方法

PCR 擴增細菌使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA G-3′)和806R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)擴增V4 高變區(qū)；真菌使用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3′)和2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增高變區(qū)。30 μL PCR 混合體系中含Tks Gflex DNA Polymerase酶0.6 μL，前引物1 μL（5 pmol/μL），后引物1 μL（5 pmol/μL），2×Gflex PCR Buffer 緩沖液15 μL，模版脫氧核糖核酸（DNA）1 μL，無菌水補足30 μL。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸20 s；共26個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 GC-MS測定條件

表1 氣相升溫程序

表2 氣相參數(shù)

氣相條件：樣品通過InertCap 毛細管柱（膜厚0.25 μm，長度30 m，內(nèi)徑0.25 μm）進行分離。

質(zhì)譜條件：分離后的樣品用質(zhì)譜儀鑒定，質(zhì)譜條件EI：電離源；電子能量：0.1 KV；離子源溫度：230 ℃；掃描范圍：29～500 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌多樣性分析

根據(jù)16S rDNA 測序分析結(jié)果得出細菌多樣性指數(shù)分析。

根據(jù)Shannon、Simpson 指數(shù)顯示實驗組的群落多樣性要高于對照組，Coverage 指數(shù)顯示8 個樣品中序列沒有被檢測出來的可能性很低，此結(jié)果有很高的可信度。

酒醅在第五輪次發(fā)酵結(jié)束后，實驗池和對照池細菌種類均為下層最多，對照組的細菌OTU 數(shù)量關(guān)系為下層=上層＞中層，實驗組的細菌OTU 數(shù)量關(guān)系為下層＞中層＞上層。

圖1 酒醅樣品細菌門水平豐富度

圖2 酒醅樣品細菌屬水平豐富度

對照組的優(yōu)勢菌門是變形菌門，數(shù)量關(guān)系為上層＞中層＞下層，實驗組的優(yōu)勢菌門是厚壁菌門，數(shù)量關(guān)系為中層＞上層＞下層，兩者優(yōu)勢微生物的數(shù)量都是下層最少。對照組優(yōu)勢細菌為變形菌門，醋酸桿菌屬（），芽孢桿菌屬（）；實驗組優(yōu)勢細菌為厚壁菌門，芽孢桿菌屬（）。根據(jù)Shannon 和Simpson 指數(shù)得出實驗組的細菌群落多樣性高于對照組，說明加入的芽孢桿菌在發(fā)酵過程中很好的存在，并發(fā)揮了作用。

表3 酒醅樣品細菌多樣性分析

表4 酒醅樣品真菌多樣性分析

2.2 真菌多樣性分析

酒醅在第五輪次發(fā)酵結(jié)束后，對照組的真菌OTU 數(shù)量關(guān)系為上層=中層＞下層，實驗組的細菌OTU 數(shù)量關(guān)系為下層＞中層＞上層，對照組的情況與胡峰、徐佳等研究一致，實驗組加入的芽孢桿菌對酵母菌形成正向影響，對真菌數(shù)量形成影響，因此實驗組的真菌種類高于對照組，芽孢桿菌促進酯化酵母的生長使得OTU 數(shù)量關(guān)系為下層＞中層＞上層。

圖3 酒醅樣品真菌屬水平多樣性分析

實驗組優(yōu)勢真菌為子囊菌門，酵母屬（），畢赤酵母屬（）。對照組優(yōu)勢真菌為子囊菌門，酵母屬（），曲霉屬（）。由此可見，加入的酯化酵母和絲狀真菌在發(fā)酵過程中得到保存。

強化酒醅中加入微生物對風(fēng)味物質(zhì)的影響，目前已經(jīng)有了一些研究成果。芽孢桿菌形成復(fù)雜多樣的酶系（蛋白酶、淀粉酶等），代謝物質(zhì)乙偶姻在發(fā)酵過程與氨形成醬香酒特征性物質(zhì)2,3,5,6-四甲基吡嗪；酯化酵母在白酒發(fā)酵過程中主要有酒化和酯化的作用，酯化酵母在醪液中生成醛、酯、醇、酸等物質(zhì)，對乙酸乙酯的含量有提高作用；絲狀真菌主要是利用糖化力分解蛋白質(zhì)、淀粉，提供給其他微生物利用，形成酯類、醛類物質(zhì)，對酸堿平衡有積極作用。

2.3 GC-MS結(jié)果分析

通過GC-MS處理對照池和實驗池的蒸餾酒樣品，結(jié)果見圖4。

圖4 風(fēng)味物質(zhì)含量對比圖

白酒中乙醇和水占總量的98 %～99 %，但白酒的風(fēng)味主要由1%～2%的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生。GCMS 結(jié)果顯示，實驗組共檢測出59 種風(fēng)味物質(zhì)（酯類25 種、醇類17 種、醛類4 種、酸類6 種、酮類1種、其他6 種），對照組共檢測出58 種風(fēng)味物質(zhì)（酯類21 種、醇類17 種、醛類5 種、酸類5 種、酮類1種、其他9 種）。由圖4 可知，實驗組的乳酸乙酯（12.03 g/L）、己酸乙酯（1.32 g/L）、乙酸（4.57 g/L）、乙酸乙酯（8.12 g/L）、1-丙醇（0.90 g/L）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（0.01 g/L）、甲酸乙酯（0.15 g/L）含量要高于對照組的乳酸乙酯（9.85 g/L）、己酸乙酯（0.90 g/L）、乙酸（3.65 g/L）、乙酸乙酯（6.75 g/L）、1-丙醇（0.76 g/L）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（0.008 g/L）、甲酸乙酯（未檢測出）；糠醛的含量實驗組（0.32 g/L）低于對照組（0.34 g/L）。乙酸乙酯具有抗腫瘤、保護肝臟等作用；乙酸具有殺菌,幫助消化，降血脂等功能；2,3,5,6-四甲基吡嗪有擴張血管，抑制血栓形成，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)免疫等作用；糠醛對人體有損害肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等有害作用。根據(jù)氣質(zhì)結(jié)果可以看到有益的風(fēng)味物質(zhì)在增加而糠醛等有害物質(zhì)在減少，說明強化酒醅釀造的白酒對人體更加有益。

3 結(jié)論

通過上述結(jié)果可以得出加入酯化酵母、絲狀真菌、芽孢桿菌的加強酒醅，使醬香酒的風(fēng)味物質(zhì)種類更加豐富多樣，可以有效提高乳酸乙酯、己酸乙酯、乙酸、2,3,5,6-四甲基吡嗪、甲酸乙酯等有益物質(zhì)的含量，尤其是醬香酒獨特風(fēng)味物質(zhì)2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量由0.008 g/L 提高到了0.01 g/L，使北方醬香酒醬香味更加醇厚，有助于改善北方醬香型白酒風(fēng)味。

本研究證明，對北方醬香酒酒醅加入上述3 種微生物后有利于提高北方醬香酒的醬香風(fēng)味，有助于提高白酒的有益風(fēng)味物質(zhì)的含量，降低有害物質(zhì)的含量。目前對醬香酒發(fā)酵微生物研究主要集中于這3 種微生物，很多有益微生物的作用有待研究，希望將來能在微生物方面對北方醬香酒風(fēng)味進行改善。