楊 勇，葛向陽(yáng)，2，張龍?jiān)?，李燕榮，賈亞偉

(1.江蘇洋河酒廠(chǎng)股份有限公司，江蘇宿遷 223800；2.宿遷學(xué)院，江蘇宿遷 223800)

作為中國(guó)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵蒸餾酒的重要物質(zhì)保障，大曲具有糖化、發(fā)酵、生香等功能，直接決定了酒的風(fēng)格及檔次。俗話(huà)說(shuō)“曲定酒型”“曲乃酒之骨”，作為綿柔特色開(kāi)創(chuàng)者的洋河綿柔型白酒，自然離不開(kāi)制曲。作為一種富含多酶多菌的微生態(tài)制品，制曲過(guò)程中可培養(yǎng)微生物的消長(zhǎng)及生化指標(biāo)的變化規(guī)律已有研究，然而，大量微生物無(wú)法培養(yǎng)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法只能在某一特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，條件單一，難以全面地反映微生物群落的多樣性及其結(jié)構(gòu)組成。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于免培養(yǎng)的高通量測(cè)序技術(shù)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)的解析中。蘇葛等利用高通量測(cè)序技術(shù)在不同大曲等級(jí)判定中進(jìn)行了應(yīng)用，揭示了洋河中高溫大曲獨(dú)特的微生物群落多樣性；吳樹(shù)坤利用高通量測(cè)序比較分析四川不同地區(qū)濃香型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)大曲的微生物多樣性存在差異；李靜心等采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)白酒高溫大曲和中高溫大曲進(jìn)行分析，比較了2 種大曲真菌結(jié)構(gòu)的差異。目前對(duì)于大曲的研究多集中在成品曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，根據(jù)Li對(duì)不同工藝的中、低溫大曲的微生物群落變化的研究，發(fā)現(xiàn)在不同環(huán)境作用下，微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。

本試驗(yàn)以中高溫大曲為研究對(duì)象，首次采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)培菌發(fā)酵幾個(gè)主要階段的細(xì)菌群落進(jìn)行分析，研究各階段優(yōu)勢(shì)微生物的分布、豐度及其演替規(guī)律，為進(jìn)一步剖析制曲發(fā)酵機(jī)理提供可靠的微生物信息。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

大曲樣品：中高溫大曲培養(yǎng)過(guò)程中入房（編號(hào)：RF，發(fā)酵0 d）、并房（編號(hào)：BF，發(fā)酵5 d）、上架（編號(hào)：SJ，發(fā)酵9 d）、大火（編號(hào)：DH，發(fā)酵15 d）、下架（編號(hào)：XJ，發(fā)酵21 d）、出房（編號(hào)：CF，發(fā)酵35 d）時(shí)各個(gè)階段的混合樣，分別粉碎、混勻、裝袋后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

儀器設(shè)備：Novaseq 6000 PE250 平臺(tái)、美國(guó)Bio-Rad Laboratory S1000型PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

使用MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit 進(jìn)行基因組DNA 抽提后，利用Thermo NanoDrop One 檢測(cè)DNA的純度和濃度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳檢測(cè)

以基因組DNA 為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶barcode 的特異引物及TaKaRa Premix Taq? Version 2.0(TaKaRa Biotechnology Co.，Dalian，China)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2.1 引物對(duì)應(yīng)區(qū)域

16S V4 區(qū)引物（515F 和806R）：鑒定細(xì)菌多樣性；擴(kuò)增區(qū)域還包括：16S V3-V4/16S V4-V5；古菌16S V4-V5；功能基因?qū)?yīng)引物等。

1.2.2.2 PCR反應(yīng)體系(表1)

表1 PCR反應(yīng)體系列表

1.2.2.3 PCR 反應(yīng)條件

每個(gè)樣本進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)，并將同一樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合。

1.2.2.4 PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)

用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度和濃度，主帶長(zhǎng)度在正常范圍內(nèi)（例如16S V4：290-310 bp/16S V4-V5：400-450 bp 等）的樣品可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Pooling及切膠純化

利 用 GeneTools Analysis Software (Version4.03.05.0，SynGene)對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行濃度對(duì)比后，按照等質(zhì)量原則計(jì)算各樣品所需體積，將各PCR 產(chǎn)物進(jìn)行混合。使用E.Z.N.-A.? Gel Extraction Kit(Omega，USA)凝膠回收試劑盒回收PCR 混合產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。

1.2.4 建庫(kù)及測(cè)序

按照NEBNext? Ultra?II DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫(kù)操作。使用Illumina Nova 6000 平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行PE250 測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序有效性分析

圖1 是以richness 指數(shù)來(lái)反映本實(shí)驗(yàn)中不同培養(yǎng)階段大曲樣本的稀釋曲線(xiàn)，richness 指數(shù)常用來(lái)估計(jì)物種豐富度。本實(shí)驗(yàn)對(duì)6 個(gè)不同培養(yǎng)階段的大曲進(jìn)行測(cè)序，由圖1 可以看出，隨著測(cè)序深度的增加，richness 指數(shù)曲線(xiàn)都呈現(xiàn)先增加后逐步趨于平緩的趨勢(shì)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，本實(shí)驗(yàn)各個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)微生物的物種信息。

圖1 大曲培養(yǎng)各階段樣品的richness曲線(xiàn)

2.2 Alpha多樣性分析

OTU 是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為便于分析，通過(guò)歸類(lèi)操作，將序列相似性大于等于97 %分歸為同一OTU。Chao1 和Ace 指數(shù)是用于計(jì)算群落豐度的指數(shù)，其值越大說(shuō)明樣品中物種豐度越高。Simpson 指數(shù)是計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)，其值越大說(shuō)明群落多樣性越低。指數(shù)Coverage 用于表征各樣本文庫(kù)的覆蓋率，反映測(cè)序深度是否能覆蓋整個(gè)微生物群落，是否能代表樣本中所有微生物的真實(shí)情況。

由表2 可知，所有樣品的序列覆蓋度(coverage)均大于0.99，證明本次測(cè)序的結(jié)果能夠真實(shí)的反映所有樣本細(xì)菌微生物的菌群結(jié)構(gòu)。中高溫大曲剛?cè)敕繒r(shí)，細(xì)菌豐度最低、菌群多樣性居中，說(shuō)明通過(guò)自然接種的微生物數(shù)量有限；主發(fā)酵期，營(yíng)養(yǎng)水分充足，環(huán)境適宜，細(xì)菌大量增殖，并房時(shí)細(xì)菌豐度與菌群多樣性都迅速升高，細(xì)菌豐度升至最高；進(jìn)入潮火期，隨著曲心溫度進(jìn)一步升高，常溫細(xì)菌逐漸不適應(yīng)高溫環(huán)境而消亡，耐高溫細(xì)菌進(jìn)一步生長(zhǎng)繁殖，上架時(shí)細(xì)菌豐度開(kāi)始降低但菌群多樣性升高；隨著曲心溫度保持60 ℃左右進(jìn)入大火期，耐熱的芽孢桿菌逐漸開(kāi)始占據(jù)優(yōu)勢(shì)，淘汰大量不耐熱的細(xì)菌，細(xì)菌豐度開(kāi)始升高但菌群多樣性降低；經(jīng)過(guò)大火期的高溫馴化與淘汰，下架時(shí)的細(xì)菌豐度與菌群多樣性都較大火期降低；此后進(jìn)入養(yǎng)曲期，曲心水分進(jìn)一步降低，干燥缺水的環(huán)境逐漸不適合微生物的生長(zhǎng)繁殖，出房時(shí)，細(xì)菌豐度進(jìn)一步降低但菌群多樣性升至最高。

表2 大曲培養(yǎng)各階段樣品細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

2.3 OTU分布Venn分析

對(duì)中高溫大曲不同培養(yǎng)階段獲取的細(xì)菌OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類(lèi)，對(duì)不同樣品之間相對(duì)共有的以及獨(dú)有的OTU 數(shù)進(jìn)行疊加，得出OTU 分布Venn 圖，比較OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。

如圖2 所示，細(xì)菌有19 個(gè)OTU 是中高溫大曲培養(yǎng)各階段所共有的，共有種群數(shù)量的占比達(dá)到23.18%～86.36%。就獨(dú)有的OTU 數(shù)而言，并房階段高達(dá)63，不僅遠(yuǎn)高于共有OTU 數(shù)，也遠(yuǎn)高于其他發(fā)酵階段，充分顯示了主發(fā)酵階段對(duì)菌群多樣性的的重要性；大火階段，獨(dú)有OTU 數(shù)為25；入房階段，獨(dú)有OTU 數(shù)為15；出房、上架與下架階段的獨(dú)有OTU數(shù)較少，相差不大。

圖2 大曲培養(yǎng)各階段OTUs交疊Venn圖

2.4 不同分類(lèi)水平的物種變化

在了解每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種后，由于存在同一個(gè)物種具有多個(gè)不同的OTU 的情況。通過(guò)合并相同物種分類(lèi)的OTU，從門(mén)、綱、目、科、屬不同分類(lèi)水平，統(tǒng)計(jì)平均含量前15 的物種，其余的物種歸于others 中，根據(jù)百分比繪制細(xì)菌的分布柱狀圖，結(jié)果分別見(jiàn)圖3—圖6。

從圖3 中可以看出，在門(mén)與綱水平上，不同培養(yǎng)階段大曲中的細(xì)菌都是以厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌綱為主，占比64%以上，此外還有變形菌門(mén)中的變形菌綱，放線(xiàn)菌門(mén)中的放線(xiàn)菌綱。變形菌綱在入房時(shí)占比達(dá)到35 %，其他門(mén)與綱水平的細(xì)菌都很少，占比小于1 %。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，門(mén)與綱水平的細(xì)菌占比變化趨勢(shì)相同，芽孢桿菌綱所占比例呈先增加、后減少、而后波動(dòng)變化的趨勢(shì)；變形菌綱呈先快速減少后緩慢增加的趨勢(shì)；放線(xiàn)菌綱則主要在大火期出現(xiàn)，占比7 %左右，而后先緩慢減少再緩慢增加。

圖3 大曲培養(yǎng)各階段細(xì)菌在門(mén)與綱水平上的分布變化

目水平上，如圖4 所示，從入房到大火階段，以芽孢桿菌綱中的乳桿菌目為主，此外還有少量的腸桿菌目、芽孢桿菌目、假諾卡氏菌目，其他目水平上的微生物占比都小于1%；乳桿菌目占比在64%～94%范圍之間先增長(zhǎng)后下降，芽孢桿菌目則從入房時(shí)的不足1%緩慢增長(zhǎng)至大火時(shí)的10%；腸桿菌目在入房時(shí)占比35%，而后快速下降，大火時(shí)回升至6%；放線(xiàn)菌綱中的假諾卡氏菌目?jī)H在大火階段出現(xiàn)，占比5 %左右。下架至出房時(shí)，芽孢桿菌綱中的芽孢桿菌目與乳桿菌目變化劇烈，芽孢桿菌目下架時(shí)占比增長(zhǎng)至74%，出房時(shí)又回落至33%；乳桿菌目下架時(shí)下降至16%，出房時(shí)回升至52%；假諾卡氏菌目先下降至2.8%后回升至3.2%；腸桿菌目保持緩慢下降趨勢(shì)，由5.7 %緩慢下降至4.5 %；出房時(shí)還有占比5.3%的放線(xiàn)菌綱未知目。

圖4 大曲培養(yǎng)各階段細(xì)菌在目水平上的分布變化

從科水平看，如圖5 所示，中高溫大曲以乳桿菌科、明串珠菌科、芽孢桿菌科、腸桿菌科、葡萄球菌科為主。入房時(shí)以乳桿菌科、明串珠菌科、腸桿菌科為主，占比分別為46%、18%、35%；并房和上架時(shí)則以明串珠菌科與乳桿菌科為主，其中明串珠菌科先增長(zhǎng)至58 %后緩落至28 %，乳桿菌科則先緩落至34 %后迅速增長(zhǎng)至65 %，此外還出現(xiàn)葡萄球菌科，占比分別為3.4%、2.5%；大火期則以明串珠菌科為主，占比高達(dá)65 %，此外還有乳桿菌科、芽孢桿菌科、腸桿菌科、偽諾卡氏菌科、葡萄球菌科，占比分別為7.5 %、6.1 %、6.0 %、4.8 %、2.4 %；下架時(shí)則以芽孢桿菌科為主，占比高達(dá)72%，此外還有少量的明串珠菌科、腸桿菌科、偽諾卡氏菌科、乳桿菌科，占比分別為13.9%、5.7%、2.8%、2.0%；出房時(shí)微生物趨于均衡，主要以明串珠菌科、乳桿菌科、葡萄球菌科、芽孢桿菌科、腸桿菌科、偽諾卡氏菌科為主，占比分別為29.7 %、21.2 %、12.2 %、7.5%、4.5%、3.2%。

圖5 大曲培養(yǎng)各階段細(xì)菌在科水平上的分布變化

在屬分類(lèi)水平上，結(jié)果如圖6。入房時(shí)以乳桿菌屬、腸桿菌科未知屬、魏斯氏菌屬為主，占比分別為46.11%、35.30%、16.59%；并房和上架時(shí)都以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、葡萄球菌屬為主，并房時(shí)占比分別為27.95%、43.95%、14.33 %、6.35 %、3.42 %，上架時(shí)分別為56.52 %、21.68%、6.78%、8.63%、2.53%；大火期，乳桿菌屬大幅降低至6.84 %，魏斯氏菌屬則大幅增加至62.81 %，此外還有8.68 %的腸桿菌科、5.28 %的芽孢桿菌屬、2.65 %的明串珠菌屬、2.40 %的葡萄球菌屬、4.13%的糖多孢菌屬；下架時(shí)，芽孢桿菌屬占比大幅增長(zhǎng)至71.16 %，魏斯氏菌屬大幅降低至11.46 %，此外還有3.75 %的腸桿菌科、2.46 %的明串珠菌屬、4.06 %的科薩克氏菌屬、2.44 %的糖多孢菌屬；出房時(shí)，各類(lèi)微生物占比趨于均衡，以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、葡萄球菌屬、克羅彭斯特菌屬、高溫放線(xiàn)菌屬為主，占比分別為14.33 %、24.02 %、6.05 %、5.64%、6.92%、12.15%、5.46%、7.10%，此外還有12.44%的腸桿菌科未知屬。

圖6 大曲培養(yǎng)各階段細(xì)菌在屬水平上的分布變化

2.5 OTU系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

在各分類(lèi)水平（門(mén)、綱、目、科、屬及OTU）下，選取總體相對(duì)豐度排在前20 的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合樣本于各分類(lèi)水平下相對(duì)豐度及物種注釋的可信度信息進(jìn)行可視化展示，結(jié)果如圖7 和表3?？梢钥闯觯懈邷卮笄信琶?0 的物種大多為厚壁菌門(mén)芽孢桿菌綱水平下的乳桿菌目與芽孢桿菌目；就科水平而言，大多為乳桿菌目水平下的乳桿菌科與明串珠菌科，芽孢桿菌目水平下的芽孢桿菌科與葡萄球菌科；就屬水平而言，則是乳桿菌科水平下的乳桿菌屬與片球菌屬、明串珠菌科水平下的魏斯氏菌屬與明串珠菌屬、芽孢桿菌科水平下的芽孢桿菌屬、葡萄球菌科水平下的葡萄球菌屬。排名前10 的物種還有一個(gè)是變形菌門(mén)γ-變形菌綱腸桿菌目腸桿菌科。此外，由圖7 可以看出，中高溫大曲的細(xì)菌物種在培養(yǎng)各階段明顯不同，受生物與非生物因素的驅(qū)動(dòng)，最終趨向于物種更加豐富、占比更加均衡。

表3 大曲培養(yǎng)各階段豐度排名前10的物種

圖7 大曲培養(yǎng)各階段細(xì)菌OTU進(jìn)化關(guān)系

2.6 群落分布特征

通過(guò)PCoA 主坐標(biāo)分析與豐度聚類(lèi)熱圖研究中高溫制曲各階段細(xì)菌群落分布特征，結(jié)果如圖8和圖9所示。

結(jié)合圖8 和圖9 可知，大曲發(fā)酵各個(gè)階段細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)均存在一定差異，PCoA 分析顯示分布于四個(gè)象限，通過(guò)豐度聚類(lèi)熱圖可將物種變化趨勢(shì)的類(lèi)型分為五類(lèi)。入房階段位于第一象限，上架階段位于第二象限，以乳桿菌屬、腸桿菌科、片球菌屬、鏈球菌屬構(gòu)成的菌群（Ⅰ）主要在入房和上架階段；并房階段位于第三象限，以明串珠菌屬、假單胞菌屬為代表的菌群（Ⅱ）主要在并房階段；大火階段與出房階段在第三象限，二者距離較近，其中以魏斯氏菌屬、醋酸桿菌屬、糖多孢菌屬、鏈霉菌屬為代表的菌群（Ⅲ）主要在大火階段，以海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、乳球菌屬、高溫放線(xiàn)菌屬為代表的菌群（Ⅴ）主要在出房階段；下架階段位于第四象限，以芽孢桿菌屬和科薩克氏菌屬構(gòu)成的菌群（Ⅳ）主要在下架階段。從圖9 也可以看出，變化趨勢(shì)相似的菌群在進(jìn)化關(guān)系上遺傳距離也較為接近。

圖8 大曲培養(yǎng)各階段細(xì)菌主坐標(biāo)分析圖

圖9 大曲培養(yǎng)各階段細(xì)菌群落豐度聚類(lèi)熱圖

由圖8 可知，不同發(fā)酵階段樣品分布較為分散，其中入房、下架與其他階段距離較遠(yuǎn)，表明這兩個(gè)階段的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異較大。因此，可將中高溫大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替分為四個(gè)階段：（1）大曲剛?cè)敕繒r(shí)，細(xì)菌群落主要來(lái)自于原輔料及環(huán)境中網(wǎng)羅的微生物；（2）并房至大火階段，伴隨溫濕度等環(huán)境因子的變化，大曲中水分營(yíng)養(yǎng)充足，微生物結(jié)構(gòu)不斷進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整；（3）下架后，經(jīng)過(guò)高溫的長(zhǎng)期馴化，大量不耐熱的微生物被淘汰，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化巨大；（4）隨著品溫等環(huán)境漸趨溫和，微生物利用曲心殘留的水分和營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，細(xì)菌多樣性增加。

2.7 細(xì)菌群落與理化因子關(guān)聯(lián)分析

理化因子關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)：二維排序軸RDA1和RDA2 解釋種群與理化的累計(jì)變化率分別為58.3 %和21.52 %，兩軸和為79.82 %（圖10），說(shuō)明RDA1 和RDA2 能較好地反映大曲細(xì)菌群落與理化因子之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。各理化因子與群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性大小依次為酸度、水分、酯化力、糖化力、發(fā)酵力，其中酸度和水分與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性較大，發(fā)酵力與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性較小，說(shuō)明細(xì)菌群落主要受大曲酸度與水分的影響，發(fā)酵力則與細(xì)菌基本無(wú)關(guān)聯(lián)性。就主要優(yōu)勢(shì)屬看，水分和糖化力與乳桿菌屬、腸桿菌正相關(guān)，說(shuō)明這兩個(gè)菌屬對(duì)大曲水分和糖化力有較大影響；酸度則與魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬和葡萄球菌屬正相關(guān)，以葡萄球菌屬表現(xiàn)尤為顯著；酯化力與芽孢桿菌屬、科薩克氏菌屬、糖多孢菌屬、放線(xiàn)菌綱正相關(guān)，尤以放線(xiàn)菌綱表現(xiàn)尤為顯著。

圖10 理化因子與細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬的RDA分析

3 總結(jié)與展望

3.1 總結(jié)

本研究首次采用高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)大曲培養(yǎng)各階段細(xì)菌不同分類(lèi)水平的組成與豐度進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，中高溫大曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、葡萄球菌屬，都屬于厚壁菌門(mén)芽孢桿菌綱水平下乳桿菌目與芽孢桿菌目的細(xì)菌種屬，此外還有變形菌門(mén)γ-變形菌綱腸桿菌目腸桿菌科。這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落在張會(huì)敏、張倩、譚崇堯、王濤等的研究結(jié)果中也有所報(bào)道，種類(lèi)和豐度有明顯差異，這是由于大曲是開(kāi)放式生產(chǎn)、自然接種，原料、環(huán)境、工藝對(duì)大曲微生物區(qū)系均有直接影響。

各類(lèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的分布和豐度在發(fā)酵各階段具有明顯區(qū)別。大曲剛?cè)敕繒r(shí)，細(xì)菌豐度最低，菌群多樣性居中，種類(lèi)以乳桿菌屬、腸桿菌科、魏斯氏菌屬為主；并房后，菌群多樣性提高，豐度升至最高，種類(lèi)以魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬為主；上架后，豐度開(kāi)始降低但菌群多樣性繼續(xù)升高，種類(lèi)以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬為主；大火中期，豐度開(kāi)始升高但菌群多樣性降低，種類(lèi)以魏斯氏菌屬為主；下架后，菌群多樣性降至最低，豐度也降低，芽孢桿菌屬占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，兼有一定占比的魏斯氏菌屬；出房后，豐度進(jìn)一步降低但菌群多樣性升至最高，以魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌科為主，還有占比5%以上的高溫放線(xiàn)菌屬、片球菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、克羅彭斯特菌屬，物種最趨豐富，占比更趨均衡。

此外，本研究還首次采用Venn 圖分析比較不同發(fā)酵階段OTU 數(shù)目組成相似性及重疊情況，從物種和樣本兩個(gè)層面對(duì)不同發(fā)酵階段OTU 進(jìn)行聚類(lèi)并繪制熱圖，選取總體相對(duì)豐度排在前20 的序列構(gòu)建了OTU 進(jìn)化圖，并通過(guò)PCoA 對(duì)不同發(fā)酵階段微生物結(jié)構(gòu)的相似性與差異性進(jìn)行了分析。結(jié)合大曲理化因子的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果表明酸度和水分與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性較大，細(xì)菌種屬對(duì)大曲酶活也有一定的影響。

3.2 展望

高通量測(cè)序技術(shù)可以全面反映樣本中微生物的物種組成及豐度，為充分認(rèn)識(shí)不可培養(yǎng)微生物并從完整的群落水平上研究微生物活動(dòng)提供了可能，已成為微生物宏基因組學(xué)研究中的重要手段。高通量測(cè)序技術(shù)是以微生物DNA 作為檢測(cè)基礎(chǔ)，無(wú)法區(qū)分死菌與活菌，需要結(jié)合傳統(tǒng)純培養(yǎng)鑒定方法進(jìn)行補(bǔ)充。

本試驗(yàn)僅對(duì)中高溫大曲中的細(xì)菌群落演替進(jìn)行了分析，需要結(jié)合真菌群落來(lái)分析中高溫大曲中微生物的演替規(guī)律，并結(jié)合眾多生物與非生物因素進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，如溫度、濕度、氧氣、門(mén)窗管控等，以全面準(zhǔn)確地研究中高溫大曲微生態(tài)演變的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力。