譚 昊，聶建光，杜艷紅，陳思佳，李 曉，李婷婷，李斯邁

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

白酒在中國(guó)歷史文化中源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，隨著歷史發(fā)展衍生出不同生產(chǎn)工藝的白酒。北京紅星作為二鍋頭的始創(chuàng)者，傳承二鍋頭釀造工藝的同時(shí)不斷探索與創(chuàng)新，多年來(lái)憑借獨(dú)特的風(fēng)格受到廣大消費(fèi)者的青睞。

白酒中風(fēng)味物質(zhì)含量?jī)H占1 %～2 %，但在中國(guó)白酒這個(gè)奇妙又復(fù)雜的系統(tǒng)中，微量的風(fēng)味物質(zhì)在白酒風(fēng)味構(gòu)成方面起著決定性作用。在研究白酒風(fēng)味物質(zhì)時(shí)，對(duì)酒樣中微量揮發(fā)性成分濃縮或分離等預(yù)處理極為重要，常用的酒液預(yù)處理方法包括液液萃取法（liquid liquid extraction，LLE）、固相萃取法（solid phase extraction，SPE）、固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME），包括頂空固相微萃取法（headspace-SPME，HSSPME）、蒸餾萃取法（simultaneous distillation and extraction，SDE）等。HS-SPME 無(wú)需溶劑且易操作，簡(jiǎn)單快速，較適用于提取揮發(fā)性成分。全二維氣相色譜（GC×GC）是近幾年開發(fā)出的一種多維度色譜分離技術(shù)，具有分辨率高、靈敏度高、峰容量大等特點(diǎn)，與飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS）聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)樣品中復(fù)雜揮發(fā)性成分的分離與鑒定。

楊波等采用HS-SPME 前處理方式，通過(guò)GC×GC-TOF-MS 在汾酒典型酒樣中共鑒定出602種揮發(fā)性物質(zhì)；程偉等采用HS-SPME-GC×GCTOF-MS 在馥合香酒中鑒定出341 種揮發(fā)性化物質(zhì)。本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 在紅星清香型白酒中鑒定出849 種揮發(fā)性組分，確定了6 個(gè)不同檔次的紅星清香型白酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分，解析不同酒體架構(gòu)白酒的風(fēng)味特征。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：本研究所用樣品均由北京紅星股份有限公司提供；

試劑及耗材：氯化鈉（分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；Dicret-8超純水機(jī)（Millipore，美國(guó)）。

儀器設(shè)備：DVB/CAR/PDMS 固相微萃取三相頭（50/30μm×1cm，Bellefonte，美國(guó)）；8890A 氣相色譜儀（Agilent，美國(guó)）；Pegasus BT 4D 質(zhì)譜儀（LECO，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HS-SPME法提取樣品中揮發(fā)性組分

參照He X 等的試驗(yàn)方法并進(jìn)行優(yōu)化，取適量樣品于15 mL 離心管中，用飽和氯化鈉水溶液將樣本中乙醇濃度稀釋到10%vol，精確移取5 mL 稀釋后的酒樣于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中；將轉(zhuǎn)移后的樣本在50 ℃條件下，孵育10 min；吸附樣本前，SPME萃取頭在270 ℃條件下，老化10 min；將老化后的SPME 萃取頭轉(zhuǎn)移至孵育室，50 ℃條件下，吸附樣本30 min；吸附結(jié)束后，將SPME 萃取頭轉(zhuǎn)移至GC進(jìn)樣口，250 ℃條件下，脫附5 min；進(jìn)樣后，SPME萃取頭在270 ℃條件下，老化10 min。

1.2.2 GC×GC-TOF-MS技術(shù)解析揮發(fā)性組分

色譜條件：一維色譜柱：DB-Heavy Wax（30 m×250 μm×0.5 μm）（Agilent,USA），二維色譜柱Rxi-5Sil MS（2 m×150 μm×0.15 μm）（Restek，USA）。一維色譜柱和二維色譜柱之間通過(guò)四噴口雙級(jí)熱調(diào)制器串聯(lián)，傳輸溫度為240 ℃；高純氦氣作為載氣，恒定流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；一維色譜柱升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟葹?0 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升至250 ℃，保持5 min；二維色譜柱的溫度設(shè)置全程比一維色譜柱高5 ℃，調(diào)制器溫度始終高于二維色譜柱柱溫15 ℃，調(diào)制周期為4.0 s。進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為250 ℃，采集速率為200 spectra/s，電子轟擊源為70 eV，檢測(cè)器電壓為1984 V，質(zhì)譜掃描范圍為m/z 35～550。

2 結(jié)果與分析

2.1 采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 技術(shù)鑒定紅星清香型白酒中揮發(fā)性組分特征

為了能更全面的分析紅星清香型白酒中的揮發(fā)性組分，本研究采用了靈敏度較高的GC×GCTOF-MS 技術(shù)，圖1 和圖2 為6 種酒樣中典型酒樣經(jīng)HS-SPME處理的一維總離子流色譜圖和二維總離子流色譜圖。從圖1 和圖2 可看出，GC-TOFMS 檢出的色譜峰大多數(shù)未達(dá)到基線分離，GC×GC-TOF-MS 檢出的所有組分基本完全分離，本研究采用GC×GC-TOF-MS 檢測(cè)方法能夠較全面、準(zhǔn)確的分析酒樣中的揮發(fā)性化合物。

圖1 典型酒樣一維總離子流色譜圖（1D-TIC）

圖2 典型酒樣二維總離子流色譜圖（2D-TIC）

通過(guò)對(duì)6 種酒樣的色譜峰定性，共鑒定出揮發(fā)性化合物849 種。如圖3 所示，共檢出酯類化合物181 種，主要包括以乙酯為主的直鏈酯、支鏈酯、羥基酯、不飽和酯等；醛酮類化合物129 種，主要為飽和及不飽和脂肪醛類和酮類，環(huán)酮以及縮醛類化合物；醇類105 種，主要為直鏈醇、支鏈醇、2-醇、3-醇、4-醇、不飽和醇、多元醇等；有機(jī)酸類27 種，主要為飽和及不飽和脂肪酸；芳香族化合物148 種，包括單環(huán)和多環(huán)的芳香烴、芳香酯、芳香醇、芳香醛、芳香縮醛、芳香酮、芳香醚等；萜烯類化合物49種，主要為單萜、倍半萜和二萜，包含萜烯、萜烯醇和萜烯氧化物等；呋喃類化合物48 種，主要包括糠基酯、糠基醛和糠基酮等；酚類化合物19 種，主要為一元酚和二元酚；醚類化合物13 種；內(nèi)酯類化合物5 種；含氮化合物35種，包含吡嗪類物質(zhì)；含硫化合物16 種，主要為硫醚類和含硫雜環(huán)化合物；其他化合物74種。

如圖3 所示，6 種紅星白酒在揮發(fā)性化合物特征上較相似，但是不同的酒樣揮發(fā)性化合物組成不同，所呈現(xiàn)的酒體風(fēng)格及風(fēng)味也有差異，高檔產(chǎn)品JY、WX 含氮化合物種類高于低檔產(chǎn)品DR、LP 與中檔產(chǎn)品LH、QH。紅星清香型白酒中每類化合物占比如圖4 所示，可看出紅星清香型白酒揮發(fā)性化合物中酯類化合物含量最高，其次是芳香類化合物、醛酮類化合物、醇類化合物，酸類化合物含量較低，與清香型白酒的揮發(fā)性化合物研究結(jié)果基本相符[11]。

圖3 6種紅星清香型白酒中各類揮發(fā)性化合物數(shù)量

圖4 紅星清香型白酒中各類揮發(fā)性化合物占比

2.2 揮發(fā)性化合物的主成分分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）將代謝物變量按一定的權(quán)重通過(guò)線性組合后產(chǎn)生新的特征變量，通過(guò)主要新變量（主成分）對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類，去除重復(fù)性差的樣本（離群樣本）和異常樣本（在置信區(qū)間外的樣本）。各個(gè)樣品在各個(gè)主成分的得分就是其在計(jì)算的數(shù)學(xué)模型中的空間坐標(biāo)，直觀地反映了各個(gè)樣品在數(shù)學(xué)模型空間中的分布情況。從PCA 得分圖可觀察樣品的聚集、離散程度，樣品分布點(diǎn)越靠近，說(shuō)明這些樣品中所含有的化合物組成和濃度越接近，即風(fēng)味越相似；反之，樣品點(diǎn)越遠(yuǎn)離，差異越大，風(fēng)味差異越大。

由圖5 可知，在第一主成分和第二主成分的得分圖上各酒樣的組內(nèi)平行性較好；6 種不同檔次的紅星清香型白酒可以得到較為清晰的區(qū)分，低檔產(chǎn)品DR與LP的揮發(fā)性化合物構(gòu)成較為相似，中檔產(chǎn)品LH 與QH 的揮發(fā)性化合物構(gòu)成較為相似，高檔產(chǎn)品JY與WX的揮發(fā)性化合物構(gòu)成較為相似。

圖5 6種紅星清香型白酒揮發(fā)性組分在第一主成分和第二主成分上的二維得分圖

2.3 揮發(fā)性化合物正交偏最小二乘回歸分析（OPLS-DA）

正交-偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)為偏最小二乘回歸法（PLS-DA）的擴(kuò)展。相比于PLSDA，該方法可以在不降低模型預(yù)測(cè)能力的前提下，有效減少模型的復(fù)雜性和增強(qiáng)模型的解釋能力，從而最大程度詮釋組間差異。

為進(jìn)一步篩選導(dǎo)致各酒樣組間差異的揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘回歸分析，共篩選出VIP 值＞1 的物質(zhì)358 種，詳情如表1 所示。通過(guò)OPLS-DA 去除與分組變量無(wú)關(guān)的數(shù)據(jù)后，如圖6 所示，由橫坐標(biāo)的主成分得分將6 種紅星清香型白酒分為了6 組，6 種不同檔次的紅星清香型白酒得到更為清晰的區(qū)分，整體與PCA 結(jié)論基本一致，即低檔產(chǎn)品DR 和LP 兩組距離較近，中檔產(chǎn)品LH與QH 兩組距離較近，高檔產(chǎn)品JY 與WX 兩組距離較近，但更精準(zhǔn)。

表1 VIP值＞1的揮發(fā)性組分

圖6 6種紅星清香型白酒揮發(fā)性組分OPLS-DA得分圖

2.4 風(fēng)味組學(xué)分析

基于檢測(cè)物質(zhì)與感官風(fēng)味之間的關(guān)聯(lián)性建立關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖7 所示。從紅星清香型白酒849種揮發(fā)性成分中確證了62 種揮發(fā)性化合物對(duì)木香、青草香、清香、果香、藥香、甜香、柑橘香、花香等10 種香氣具有明顯貢獻(xiàn)，包括酯類6 種、醛酮類29種、芳香族類3 種、醇類14 種、萜類7 種、醚類1 種、含硫化合物1 種、烷烴類1 種。為紅星清香型白酒產(chǎn)品風(fēng)味特色的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖7 風(fēng)味組學(xué)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖

3 結(jié)論

本研究通過(guò)結(jié)合HS-SPME 與GC×GC-TOFMS技術(shù)鑒定出紅星清香型白酒中的揮發(fā)性化合物849種，其中酯類化合物含量最高，其次是芳香類化合物、醛酮類化合物、醇類化合物；確證了62 種對(duì)紅星清香白酒香氣貢獻(xiàn)度高的揮發(fā)性化合物。運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，可以看出紅星清香白酒的6種不同檔次酒樣落在不同區(qū)域，可以清晰分隔，與檔次吻合，其中低檔產(chǎn)品DR 和LP 差異較小，中檔產(chǎn)品LH 與QH 差異較小，高檔產(chǎn)品JY 與WX 差異較小，高檔產(chǎn)品JY 與WX 吡嗪類物質(zhì)含量豐富。本研究為紅星清香型白酒的風(fēng)味組分剖析、特征挖掘與產(chǎn)品品質(zhì)相關(guān)性的研究等提供依據(jù)，但對(duì)紅星清香型白酒中各類風(fēng)味物質(zhì)風(fēng)味的協(xié)同作用還有待深入研究。