高新雨 倪嘉成 白寧寧 張 菁 高瓊媚 李華婷 楊 穎 方啟晨

隨著人民物質(zhì)生活水平的提高，2型糖尿病患病率逐年增高[1]。胰島素分泌缺陷和胰島素敏感性減低是2型糖尿病發(fā)病的重要病理生理機制，其中胰島β細(xì)胞功能障礙為糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。胰島是分布于胰外分泌部腺泡間的一種內(nèi)分泌細(xì)胞團，高度血管化是其主要特征之一。胰島毛細(xì)血管為胰島提供充足的營養(yǎng)和氧氣，完善的血管功能維持對胰島存活和功能發(fā)揮起著極其重要的作用[3]。HtrA1(high temperature requirement protease A1)是一種在生物體各種組織中普遍存在的具有分泌特性的絲氨酸蛋白酶[4]，近年的研究發(fā)現(xiàn)其參與血管結(jié)構(gòu)[5]及新生調(diào)控[6]。鑒于胰島血供對胰島功能維持的重要性，推測HtrA1缺失可能會對胰島功能產(chǎn)生影響。本研究旨在探討HtrA1基因敲除是否會影響小鼠胰島功能及糖代謝。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物飼養(yǎng) C57BL/6J背景的HtrA1基因敲除小鼠購自日本Chio Oka教授實驗室(Nara Institute of Science and Technology)，于上海駿實實業(yè)有限公司無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級動物房中進行繁殖培育。小鼠自由飲水和飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～24 ℃，維持12 h亮暗交替周期。本研究中涉及的動物實驗均已通過上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動物福利與倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理號為2017-0159)。

1.1.2 基因鑒定 小鼠2周齡時，提取鼠尾基因組DNA進行基因鑒定，提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。HtrA1基因鑒定PCR引物序列：野生型(wild type，WT)上游引物為5’-ACG CTC CTG TCT TTG CTA CT-3’，下游引物為5’-TGT GCA CGC CGT CGT ACT GT-3’；HtrA1基因敲除型上游引物為5’-AAT GGG CTG ACC GCT TCC TCG TGC TT-3’，下游引物為5’-TGT GCA CGC CGT CGT ACT GT-3’。PCR產(chǎn)物片段長度分別為299bp和665bp。

1.2 小鼠實驗 取6周齡雄性野生型小鼠(WT小鼠)和HtrA1基因敲除小鼠(KO小鼠)，按照同窩隨機對照原則分組，分別給予高脂飲食(脂肪占總熱量的60%，貨號為D1233，由美國Research Diets公司提供)或普脂飲食(脂肪占總熱量的5%，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供)。記錄喂養(yǎng)16周(22周齡小鼠)時，普脂飲食組及高脂飲食組WT小鼠(均為6只)、KO小鼠(均為5只)的體重，以及喂養(yǎng)期間攝食量，以觀察HtrA1基因敲除對小鼠體重的影響。

1.3 腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT) 18周齡(普脂或高脂喂養(yǎng)12周)小鼠(普脂飲食組WT、KO小鼠各7只，高脂飲食WT小鼠6只、KO小鼠7只)禁食、不禁水12 h后，腹腔內(nèi)注射葡萄糖(2 g/kg，上海信誼金朱藥業(yè)有限公司)，分別于空腹及注射后10、20、30、45、60、90、120 min取尾靜脈血，應(yīng)用ACCU-CHEK Performa血糖儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]檢測血糖水平。

1.4 葡萄糖刺激胰島素分泌(glucose stimulates insulin secretion，GSIS)試驗 18周齡(普脂或高脂喂養(yǎng)12周)小鼠(WT小鼠、KO小鼠各5只)禁食、不禁水12 h后，采集空腹尾靜脈血，采用ELISA法(ELISA試劑盒由香港大學(xué)提供)檢測空腹胰島素水平。進一步對21周齡(高脂喂養(yǎng)15周)小鼠(WT小鼠、KO小鼠各4只)進行GSIS試驗，小鼠禁食、不禁水12 h后，腹腔內(nèi)注射葡萄糖(3 g/kg，上海信誼金朱藥業(yè)有限公司)，分別于空腹及注射后15、30 min時行小鼠尾尖采血，分離血漿凍存。采用ELISA法(ELISA試劑盒由香港大學(xué)提供)檢測胰島素水平。

1.5 胰島分離及GSIS試驗 為進一步證實HtrA1基因敲除對胰島細(xì)胞的影響，分離小鼠胰島在細(xì)胞水平行GSIS試驗，采用頸椎脫臼法處死普脂飲食組小鼠(WT小鼠、KO小鼠各3只)，于膽總管近端緩慢注入0.25 mg/mL膠原酶(美國Sigma公司)溶液5 mL，使胰腺充分膨脹后迅速將其摘除，置于體式顯微鏡下挑取胰島，以10個胰島細(xì)胞/孔接種于24孔板，棕櫚酸0.5 mmol/L(美國Sigma公司)處理24 h后，以含2.8 mmol/L葡萄糖的Kerbs-Ringer緩沖液(KRB平衡液)饑餓處理1 h，棄培養(yǎng)基，PBS液洗滌2次，加入含有2.8 mmol/L、20 mmol/L葡萄糖的KRB平衡液(上海信誼金朱藥業(yè)有限公司)孵育1 h，收集上清液，測定胰島素水平。

1.6 胰腺組織免疫熒光染色 取22周齡(高脂喂養(yǎng)16周)小鼠胰腺組織(WT小鼠、KO小鼠各3只)，以4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋等處理后行組織切片。將胰腺切片與鼠抗胰島素一抗(1∶200稀釋，武漢賽維爾生物科技有限公司)、兔抗胰高血糖素一抗(1∶200稀釋，武漢賽維爾生物科技有限公司)于4 ℃孵育過夜，之后與連接熒光基團的488-山羊抗小鼠二抗(1∶400稀釋，武漢賽維爾生物科技有限公司)、CY3-山羊抗兔二抗(1∶400稀釋，武漢賽維爾生物科技有限公司)孵育進行胰島素(綠色)和胰高血糖素(紅色)免疫熒光雙染。將胰腺切片與鼠抗胰島素一抗(1∶200稀釋，武漢賽維爾生物科技有限公司)和兔抗CD31一抗(1∶200稀釋，武漢賽維爾生物科技有限公司)于4 ℃孵育過夜，之后與連接熒光基團的488-山羊抗小鼠二抗(1∶400稀釋，武漢賽維爾生物科技有限公司)和CY3-山羊抗兔二抗(1∶400稀釋，武漢賽維爾生物科技有限公司)孵育進行胰島素(綠色)和CD31(紅色)免疫熒光雙染。應(yīng)用Zeiss Axio-Imager熒光顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)攝片，采集物鏡(×20)下圖像。應(yīng)用ZEN 2.0軟件(德國卡爾蔡司公司)參照Pysz等[7]的方法對胰島中CD31水平進行定量，比較胰島中CD31的平均熒光強度，以熒光密度與胰島面積之比表示。

2 結(jié) 果

2.1 兩組KO小鼠與WT小鼠的體重和喂養(yǎng)期間攝食量比較 高脂飲食組WT和KO小鼠的體重分別為(44.27±3.29)、(43.34±3.14) g，攝食量分別為(19.33±1.36)、(19.43±1.36) g；普脂飲食組WT和KO小鼠的體重分別為(31.45±2.24)、(29.54±1.67) g，攝食量分別為(24.49±5.01)、(21.50±3.07) g。高脂飲食組或普脂飲食組的KO與WT小鼠的體重和攝食量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。

2.2 兩組KO小鼠與WT小鼠IPGTT結(jié)果比較 普脂飲食組KO小鼠糖負(fù)荷10、20、120 min時的血糖水平顯著高于同組WT小鼠(P值均<0.05)，空腹血糖及糖負(fù)荷后30、45、60、90 min時的血糖水平與同組WT小鼠的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。高脂飲食組KO小鼠糖負(fù)荷10、20、30、45 min時血糖水平均顯著高于同組WT小鼠(P值均<0.05)，空腹血糖及糖負(fù)荷后60、90、120 min時血糖水平與同組WT小鼠的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 高脂飲食組和普脂飲食組WT小鼠與KO小鼠糖負(fù)荷各時間點血糖水平的比較

2.3 KO小鼠與WT小鼠空腹胰島素水平和GSIS試驗結(jié)果比較 18周齡高脂飲食組KO小鼠和WT小鼠的空腹胰島素水平分別為(0.58±0.05)、(1.34±0.21) mmol/L，普脂飲食組的空腹胰島素水平分別為(0.53±0.08)、(0.51±0.04) mmol/L，普脂飲食組WT小鼠與KO小鼠空腹胰島素水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高脂飲食組KO小鼠空腹胰島素水平顯著低于WT小鼠(P<0.05)。21周齡高脂飲食組空腹及注射葡萄糖后15 min時KO小鼠的胰島素水平均顯著低于WT小鼠(P值均<0.05)，KO小鼠與WT小鼠注射葡萄糖后30 min時胰島素水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 高脂飲食組WT小鼠與KO小鼠空腹和注射后15、30 min時胰島素水平的比較

2.4 KO小鼠與WT小鼠胰島細(xì)胞GSIS試驗結(jié)果比較 高糖刺激(20 mmol/L葡萄糖)后，KO小鼠和WT小鼠胰島細(xì)胞的胰島素分泌水平分別增高為相應(yīng)基礎(chǔ)水平(2.8 mmol/L葡萄糖)的(3.36±0.24)、(5.90±1.53)倍，經(jīng)高糖刺激的KO小鼠胰島細(xì)胞的胰島素分泌能力顯著低于WT小鼠(P<0.05)。

2.5 高脂飲食組WT小鼠與KO小鼠免疫熒光染色結(jié)果比較 高脂飲食組小鼠胰島組織胰島素、胰高血糖素染色結(jié)果顯示，KO小鼠與WT小鼠間胰島結(jié)構(gòu)完整性及胰高血糖素表達均無明顯差異。見圖1。 高脂飲食組KO小鼠與WT小鼠胰島內(nèi)CD31平均熒光強度分別為(1.71±1.07)、(3.28±1.59) AU，高脂飲食組KO小鼠胰島內(nèi)CD31表達水平顯著低于同組WT小鼠(P<0.05)。見圖2。

A WT小鼠胰島組織胰島素 B WT小鼠胰島組織胰高血糖素 C WT小鼠胰島組織胰島素與胰高血糖素Merge圖像 D KO小鼠胰島組織胰島素 E KO小鼠胰島組織胰高血糖素 F KO小鼠胰島組織胰島素與胰高血糖素Merge圖像圖1 WT小鼠與KO小鼠胰島組織胰島素和胰高血糖素免疫熒光雙染(×200)

A WT小鼠胰島組織CD31 B WT小鼠胰島組織胰島素 C WT小鼠胰島組織CD31與胰島素Merge圖像 D KO小鼠胰島組織CD31 E KO小鼠胰島組織胰島素 F KO小鼠胰島組織CD31與胰島素Merge圖像圖2 WT小鼠與KO小鼠胰島組織胰島素和CD31免疫熒光雙染(×200)

3 討 論

HtrA1基因編碼一個由480個氨基酸組成的多肽，相對分子質(zhì)量約為50 000 Da[8]，最初在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[9]，廣泛存在于各種微生物和哺乳動物體內(nèi)，人與小鼠間高度同源，在大多數(shù)組織中均有表達[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，HtrA1參與血管結(jié)構(gòu)和新生的調(diào)控。2006年Dewan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，HtrA1啟動子變異致HtrA1基因表達上調(diào)與年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病密切相關(guān)，其特點為色素上皮層下血管新生活躍。2011年Jones等[6]研究發(fā)現(xiàn)，HtrA1 轉(zhuǎn)基因過表達小鼠視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達明顯上調(diào)，并表現(xiàn)出脈絡(luò)膜新生血管形成活躍。相反，Hasan等[12]報道HtrA1基因敲除導(dǎo)致母鼠血管重構(gòu)缺陷，引起胎盤發(fā)育不良和胚胎子宮內(nèi)生長遲緩，最終可能引發(fā)先兆子癇；CARASIL病是一種人類缺血性腦小血管疾病，其主要的發(fā)病原因是HtrA1基因突變導(dǎo)致蛋白功能低下，引發(fā)血管結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致[13]。以上研究結(jié)果提示，缺乏或者過量的HtrA1均可導(dǎo)致血管生成異常，而適宜水平的HtrA1對正常血管的生長發(fā)育及功能維持是必需的。另有研究[14]發(fā)現(xiàn)，HtrA1基因缺失導(dǎo)致血管生成減少伴VEGF表達下調(diào)。VEGF又稱血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖、血管形成等作用[15]。CD31又稱為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)，在內(nèi)皮細(xì)胞間連接處高表達[16]，為微血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物[17]，參與調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接穩(wěn)定性及完整性[18]。以往研究[19]發(fā)現(xiàn)，糖尿病胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損主要表現(xiàn)為線粒體超微結(jié)構(gòu)異常及CD31表達異常。研究[20]證實，胰島細(xì)胞功能紊亂是糖尿病進展的根本機制,胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞參與構(gòu)成的胰島微循環(huán)對于維持胰島β細(xì)胞功能至關(guān)重要[21-22]。因此，HtrA1基因可能通過VEGF調(diào)控胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞影響胰島細(xì)胞功能，進而影響全身糖代謝。

本研究IPGTT結(jié)果顯示，普脂飲食組KO小鼠糖負(fù)荷10、20、120 min時的血糖水平顯著高于同組WT小鼠，高脂飲食組KO小鼠糖負(fù)荷10、20、30、45 min時的血糖水平均顯著高于同組WT小鼠；GSIS試驗結(jié)果顯示，高脂飲食組空腹、注射葡萄糖后15 min時KO小鼠的胰島素水平顯著低于WT小鼠，經(jīng)高糖刺激的KO小鼠胰島細(xì)胞的胰島素分泌能力顯著低于WT小鼠。上述結(jié)果顯示，HtrA1基因敲除損害小鼠葡萄糖耐量，且降低高脂喂養(yǎng)條件下基礎(chǔ)胰島素水平和葡萄糖刺激下胰島素分泌，表明HtrA1基因敲除損害了小鼠胰島功能。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食組KO小鼠胰島內(nèi)CD31表達水平顯著低于同組WT小鼠，提示HtrA1基因可能通過VEGF調(diào)控胰島細(xì)胞血管微循環(huán)，直接影響胰島細(xì)胞功能，進而影響全身糖代謝。然而，HtrA1基因是否通過VEGF和(或)其他因素調(diào)控胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞影響胰島功能、調(diào)控的具體機制，以及HtrA1基因?qū)σ葝u微循環(huán)的影響是否同樣存在于人類尚需進一步研究。由于HtrA1基因參與組織血管功能的調(diào)控，除外胰腺組織外，HtrA1基因敲除可能會影響其他血供豐富組織，尤其是胰島素作用靶組織的功能，尚待進一步研究探討。

綜上所述，HtrA1作為一種絲氨酸蛋白酶，其可能通過調(diào)控胰島微循環(huán)參與調(diào)控胰島細(xì)胞功能及全身的糖代謝。HtrA1基因敲除可導(dǎo)致小鼠機體糖代謝紊亂及胰島功能異常，其機制可能與胰島細(xì)胞血管功能有關(guān)。本研究結(jié)果為深入了解HtrA1在胰島功能中的作用，探討糖尿病預(yù)防新靶點開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。