汪菁峰 李福海 沈冬麗 宋 昱 韓雪婷 周京敏 葛均波

心力衰竭是各類心臟疾病的嚴(yán)重階段或終末期表現(xiàn)。近年來(lái)，學(xué)者越來(lái)越重視能量代謝在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展中的作用，心力衰竭實(shí)質(zhì)上是由于心肌能量代謝異常及能量不足引起的一種超負(fù)荷性心肌病[1]。缺血性心肌病是心力衰竭發(fā)生的重要基礎(chǔ)疾病。心肌缺血時(shí)，心肌脂肪酸和葡萄糖代謝紊亂，能量產(chǎn)生及能量?jī)?chǔ)備均減少，而活性氧自由基產(chǎn)生增多，加速了心力衰竭的發(fā)展與惡化。因此，以心肌能量為治療靶點(diǎn)，改善心肌缺血，延緩心臟重構(gòu)，成為近年來(lái)缺血性心肌病的研究熱點(diǎn)。通絡(luò)方藥“芪藶強(qiáng)心”是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制的治療心力衰竭的中成藥，主要由黃芪、人參、丹參、附子、葶藶子、陳皮、紅花、桂枝、澤瀉等組成，其既具有傳統(tǒng)的強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)張血管作用，又能明顯抑制RAAS等神經(jīng)內(nèi)分泌激素的過(guò)度激活，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)[2-3]，但關(guān)于其對(duì)心肌能量代謝作用的研究并不多。本研究采用芪藶強(qiáng)心提取物干預(yù)體外缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞，觀察其對(duì)缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞葡萄糖代謝及關(guān)鍵酶表達(dá)的影響，探討通絡(luò)方藥“芪藶強(qiáng)心”治療缺血性心肌病的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物配置 1～2 d齡野生型Sprague Dawley(SD)大鼠乳鼠購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。芪藶強(qiáng)心超微粉由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。稱取適量芪藶強(qiáng)心超微粉溶于DMEM培養(yǎng)基，以超聲助溶，濾紙初濾，0.22 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，配制成10 mg/mL 的芪藶強(qiáng)心提取物原液。密封保存于-20 ℃冰箱。曲美他嗪粉劑由施維雅天津制藥有限公司提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，胰酶消化液(美國(guó)Invitrogen公司)，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)活性檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Cayman Chemical 公司)，微板法乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，蛋白酶磷酸酶抑制劑(美國(guó)Thermo Scientific公司)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4(Glut-4)兔抗大鼠單克隆抗體(英國(guó) Abcam公司)，LDH A兔抗大鼠單克隆抗體、丙酮酸脫氫酶(PDH)兔抗大鼠單克隆抗體、檸檬酸合酶(CS)兔抗大鼠單克隆抗體(美國(guó)CST公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國(guó)Abbkine公司)，HRP標(biāo)記的抗大鼠β-actin抗體(美國(guó)Bioworld公司)。

1.3 大鼠乳鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat cardiomyocyte,NRCM)培養(yǎng) 采用酶消化法+差速貼壁法分離培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞。于大鼠乳鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛50 μL行麻醉后，剪開(kāi)其胸腔，彎鑷取出心臟并置于4 ℃ PBS中清洗，然后將心臟組織剪為大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，移入含0.1%胰酶消化液的燒杯中，將燒杯置于37 ℃恒溫磁力攪拌器(1～2 r/s)上消化5 min，收集上清液，加入等量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，4 ℃、300×g離心5 min，棄上清液，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。重復(fù)上述消化過(guò)程7～8次，直至心肌組織完全消化。將收集完畢的細(xì)胞懸液置于37 ℃、含0.05體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)90 min，此時(shí)貼壁的為成纖維細(xì)胞，懸液為心肌細(xì)胞。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新瓶中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 缺氧模型建立 采用缺氧培養(yǎng)箱模擬缺氧環(huán)境。缺氧培養(yǎng)箱各有一進(jìn)氣口和出氣口，進(jìn)氣口連接無(wú)氧氣體源(95% N2和5% CO2)，出氣口可將裝置內(nèi)O2排出。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入缺氧培養(yǎng)箱后，打開(kāi)無(wú)氧氣體源通氣，同時(shí)打開(kāi)出氣口，約5 min后，充氣完成，培養(yǎng)箱中O2基本排凈，迅速關(guān)閉通氣閥門(mén)，此時(shí)培養(yǎng)箱內(nèi)最終O2體積分?jǐn)?shù)<1%，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的缺氧干預(yù)[4]。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方式 將細(xì)胞懸液均勻接種于4個(gè)含8 mL DMEM培養(yǎng)基的10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為：對(duì)照組、缺氧組、芪藶強(qiáng)心+缺氧組、曲美他嗪+缺氧組。對(duì)照組于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。缺氧組細(xì)胞于37 ℃缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。芪藶強(qiáng)心+缺氧組則預(yù)先加入芪藶強(qiáng)心提取物原液(終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，本課題組已于前期采用臺(tái)朌藍(lán)試劑盒篩選出芪藶強(qiáng)心的最適干預(yù)濃度，在0.5 mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率最高[3])，1 h后再置入37 ℃缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。曲美他嗪+缺氧組則預(yù)先加入曲美他嗪粉劑(終濃度為100 μmol/L)[5]，1 h后再置入缺氧培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.6 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)

1.6.1 TUNEL染色 ①將心肌細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于24孔板中，制備細(xì)胞爬片；②根據(jù)1.5所述實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方式處理各組細(xì)胞；③干預(yù)結(jié)束后，吸盡培養(yǎng)基， 先后予4%多聚甲醛+PBS固定、3%過(guò)氧化氫甲醇封閉、0.1% Triton X-100細(xì)胞膜通透液冰上孵育；④將爬片移至載玻片上，每個(gè)樣品避光滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液，在37 ℃暗濕盒中反應(yīng)1 h；⑤反應(yīng)結(jié)束后，以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染10 min，樣品上滴加抗促滅劑以封片；⑥熒光顯微鏡下(×200)觀察樣品染色情況，隨機(jī)選取3個(gè)視野，觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞情況，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)量及凋亡比例。

1.6.2 caspase3活性檢測(cè) 各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，分別以0.1%胰酶消化細(xì)胞并收集至細(xì)胞培養(yǎng)基中；4 ℃、600×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀；PBS洗滌1次，吸盡上清液，按照每2×107個(gè)細(xì)胞加入100 μL的比例加入裂解液，重懸、冰浴裂解細(xì)胞15 min；4 ℃、16 000×g離心15 min后，轉(zhuǎn)移上清液至預(yù)冷的離心管內(nèi)作為待測(cè)樣品，同時(shí)取少量樣品，采用Bradford法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度。于96孔板每孔中加入50 μL待測(cè)樣品，每個(gè)樣本均設(shè)復(fù)孔，按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系：37 ℃孵育60～120 min；波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定樣品吸光度(A)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中催化產(chǎn)生了多少量的pNA，參考美國(guó)Chemicon公司的caspase 3酶活力單位的定義，計(jì)算每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)樣品的caspase3酶活力(單位為U/mg)。

1.7 心肌細(xì)胞葡萄糖攝取檢測(cè) DMEM培養(yǎng)基重懸心肌細(xì)胞，以5 000 個(gè)/孔均勻接種于96 孔板中，每個(gè)樣本均設(shè)復(fù)孔，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成100 μL DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，對(duì)4組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)。干預(yù)結(jié)束前10 min加入含有熒光標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育16 h；室溫條件下400×g離心5 min。吸出培養(yǎng)液后，每孔加入200 μL細(xì)胞檢測(cè)液，400×g離心5 min，吸盡上清液。再次加入100 μL細(xì)胞檢測(cè)液，在激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為485/535 nm處檢測(cè)樣品熒光值。

1.8 心肌細(xì)胞ATP水平檢測(cè) 各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后吸凈培養(yǎng)液，加入800 μL裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000×g離心5 min，取上清液樣品。按照說(shuō)明書(shū)，于冰上配制ATP標(biāo)準(zhǔn)液和ATP檢測(cè)工作液。取96孔板，每孔中加入ATP檢測(cè)工作液100 μL，室溫靜置3 min后，每孔加入20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品均設(shè)復(fù)孔，迅速混勻，間隔2 min后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定樣品相對(duì)光單位(RLU)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP水平。應(yīng)用BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)水平，并將ATP水平換算成nmol/mg蛋白質(zhì)單位形式。

1.9 細(xì)胞上清液LDH活性檢測(cè) 4組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，收集細(xì)胞上清液，于4 ℃、1 000×g離心5 min，取上清液為待測(cè)樣品。取96孔板，測(cè)定孔及對(duì)照孔均加入20 μL待測(cè)樣品，每個(gè)樣品設(shè)復(fù)孔，并按說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系，混勻，室溫靜置5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。根據(jù)以下公式計(jì)算樣品LDH活性(U/L)=(測(cè)定孔A值-對(duì)照孔A值)÷(標(biāo)準(zhǔn)孔A值-空白孔A值)×丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度(0.2 μmol/mL)×1 000。

1.10 葡萄糖代謝相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)

1.10.1 細(xì)胞蛋白質(zhì)提取 4組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，加入含有蛋白酶磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(1∶100)，冰上靜置5 min后刮下細(xì)胞，收集至無(wú)菌離心管，冰上靜置30 min。應(yīng)用勻漿器充分勻漿，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液為心肌細(xì)胞胞質(zhì)蛋白。留取10 μL細(xì)胞蛋白質(zhì)，采用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度，余加入5×上樣緩沖液中，充分混勻，100 ℃水浴鍋中煮5 min，自然冷卻后保存于-80 ℃冰箱。

1.10.2 免疫印跡法 配制含10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)進(jìn)行4組細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品電泳。后在冰浴中，采用電轉(zhuǎn)移法(300 mA、90 min)恒流轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將整膜于室溫下，在5%小牛血清(BSA)中封閉1 h。根據(jù)目的蛋白質(zhì)分子量裁剪PVDF膜，分別加入1∶1 000稀釋的Glut-4、LDH A、PDH、CS單克隆抗體，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。棄去一抗，以TBST洗膜3次后，與HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑進(jìn)行曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 芪藶強(qiáng)心減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比，缺氧組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增高[(15.11±2.30)% 比(2.85±0.95)%,P<0.01]，細(xì)胞caspase3活性顯著增強(qiáng)[(81.53±13.78) U/mg比(27.61±5.82) U/mg,P<0.01)]；與缺氧組比較，芪藶強(qiáng)心+缺氧組[(8.23±1.11)%比(15.11±2.30)%,P<0.01)]和曲美他嗪+缺氧組[(7.23±1.23)% 比(15.11±2.30)%,P<0.01)]的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低，caspase3活性顯著受到抑制[芪藶強(qiáng)心：(56.91±6.29) U/mg比(81.53±13.78) U/mg,P<0.01。曲美他嗪：(54.37±4.90) U/mg比(81.53±13.78) U/mg,P<0.01)]。見(jiàn)圖1。提示芪藶強(qiáng)心對(duì)缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。

A 對(duì)照組TUNEL染色(200×) B 對(duì)照組DAPI染色(200×) C 對(duì)照組合并染色(200×) D 缺氧組TUNEL染色(200×) E 缺氧組DAPI染色(200×) F 缺氧組合并染色(200×) G 芪藶強(qiáng)心+缺氧組TUNEL染色(200×) H 芪藶強(qiáng)心+缺氧組DAPI染色(200×) I 芪藶強(qiáng)心+缺氧組合并染色(200×) J 曲美他嗪+缺氧組TUNEL染色(200×) K 曲美他嗪+缺氧組DAPI染色(200×) L 曲美他嗪+缺氧組合并染色(200×) M 4組心肌細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞比例檢測(cè)結(jié)果(與對(duì)照組比較：①P<0.01。與缺氧組比較：②P<0.01) N 4組心肌細(xì)胞caspase3活性檢測(cè)結(jié)果(與對(duì)照組比較：①P<0.01。與缺氧組比較：②P<0.01)圖1 不同干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

2.2 芪藶強(qiáng)心促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞的葡萄糖攝取 缺氧組心肌細(xì)胞葡萄糖攝取率較對(duì)照組顯著降低[(66.82±10.88)%比(100.19±1.40)%,P<0.01]，芪藶強(qiáng)心+缺氧組和曲美他嗪+缺氧組心肌細(xì)胞葡萄糖攝取率分別為(82.75±15.09)%和(80.18±14.42)%，均較缺氧組的(66.82±10.88)%顯著增高(P值均<0.01)。提示芪藶強(qiáng)心可增強(qiáng)缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞葡萄糖攝取能力，其效力與曲美他嗪相當(dāng)。

2.3 芪藶強(qiáng)心抑制缺氧心肌細(xì)胞上清液LDH活性，促進(jìn)細(xì)胞ATP生成 缺氧組心肌細(xì)胞上清液的LDH活性較對(duì)照組顯著增強(qiáng)[(246.92±24.66) U/L 比(149.70±20.17) U/L，P<0.01]，芪藶強(qiáng)心+缺氧組和曲美他嗪+缺氧組細(xì)胞上清液LDH活性值分別為(216.76±15.41) U/L和(198.44±23.51) U/L，較缺氧組的(246.92±24.66) U/L顯著降低(P值均<0.01)。缺氧組心肌細(xì)胞ATP水平較對(duì)照組顯著降低[(4.87±1.02) nmol/mg比(8.21±1.40) nmol/mg，P<0.01]，芪藶強(qiáng)心+缺氧組和曲美他嗪+缺氧組心肌細(xì)胞ATP值分別為(6.61±1.39) nmol/mg和(6.77±0.87) nmol/mg，顯著高于缺氧組的(4.87±1.02) nmol/mg(P值均<0.01)。

2.4 芪藶強(qiáng)心調(diào)控缺氧心肌細(xì)胞葡萄糖代謝關(guān)鍵酶的表達(dá) 缺氧組心肌細(xì)胞Glut-4、PDH、CS蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為0.47±0.09、0.41±0.06、0.48±0.09均顯著低于對(duì)照組的0.98±0.05、0.98±0.04、0.97±0.04(P值均<0.01)，而LDH A相對(duì)表達(dá)量為2.21±0.15顯著高于對(duì)照組的0.98±0.05(P<0.01)。芪藶強(qiáng)心+缺氧組和曲美他嗪+缺氧組細(xì)胞Glut-4、PDH、CS蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為1.18±0.18和1.17±0.14、0.91±0.08和0.92±0.07、1.10±0.18和1.05±0.12，均顯著高于缺氧組的0.98±0.05、0.98±0.04、0.97±0.04(P值均<0.01)，而LDH A相對(duì)表達(dá)量為1.12±0.14和1.18±0.10顯著高于對(duì)照組的0.98±0.05(P值均<0.01)。見(jiàn)圖2。

1 對(duì)照組 2 缺氧組 3 芪藶強(qiáng)心+缺氧組 4 曲美他嗪+缺氧組 A 4組心肌細(xì)胞葡萄糖代謝關(guān)鍵酶的蛋白質(zhì)表達(dá)情況 B Glut-4蛋白質(zhì)灰度值分析結(jié)果(與對(duì)照組比較：①P<0.01。與缺氧組比較：②P<0.01) C LDH A蛋白質(zhì)灰度值分析結(jié)果(與對(duì)照組比較：①P<0.01。與缺氧組比較：②P<0.01) D PDH蛋白質(zhì)灰度值分析結(jié)果(與對(duì)照組比較：①P<0.01。與缺氧組比較：②P<0.01) E CS蛋白質(zhì)灰度值分析結(jié)果(與對(duì)照組比較：①P<0.01。與缺氧組比較：②P<0.01) 圖2 不同干預(yù)組心肌細(xì)胞葡萄糖代謝關(guān)鍵酶蛋白質(zhì)表達(dá)情況

3 討 論

心臟是人體耗能、耗氧較多的器官之一，心肌能量穩(wěn)態(tài)取決于脂肪酸代謝和葡萄糖代謝間的平衡。心肌活動(dòng)所需能量的60%～90%來(lái)自脂肪酸代謝，10%～40%由糖酵解和乳酸氧化產(chǎn)生的丙酮酸提供；而在線粒體中脂肪酸的氧化可抑制丙酮酸的氧化。心肌缺血、缺氧時(shí)，這種不平衡的狀態(tài)會(huì)有所加強(qiáng)，表現(xiàn)為增加線粒體對(duì)脂肪酸的攝取，顯著抑制葡萄糖和乳酸氧化，其結(jié)果是增加了能量產(chǎn)生過(guò)程中的氧需求，ATP生成減少，心臟處于“能量饑餓狀態(tài)”；同時(shí)，中重度心肌缺血時(shí)脂肪酸氧化和糖酵解不匹配，導(dǎo)致游離脂肪酸堆積、細(xì)胞內(nèi)酸中毒等代謝紊亂，引起心肌細(xì)胞凋亡。異常的能量代謝狀態(tài)是心功能進(jìn)行性惡化，進(jìn)而發(fā)展為心力衰竭的重要原因之一。

心肌葡萄糖代謝包括底物水平攝取與利用、線粒體氧化磷酸化、ATP的轉(zhuǎn)移與利用3個(gè)環(huán)節(jié)。目前，臨床常用的改善心肌能量代謝的藥物如曲美他嗪，以抑制脂肪酸β氧化為作用靶點(diǎn)，從而增加葡萄糖代謝，充分利用有限氧，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)與心肌細(xì)胞凋亡[6]。通絡(luò)方藥芪藶強(qiáng)心中的黃芪、附子、人參等成分，具有改善物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)血脂、減少毒性物質(zhì)堆積、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用，作為復(fù)方制劑，具有多途徑、多靶點(diǎn)的綜合保護(hù)效應(yīng)。Lin等[7]對(duì)H9C2心肌細(xì)胞給予芪藶強(qiáng)心超微粉干預(yù)，發(fā)現(xiàn)芪藶強(qiáng)心可使細(xì)胞糖酵解水平升高；隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞氧化代謝水平、線粒體含量、線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白1(SSBP1)等線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)水平均上調(diào)，該作用由過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)及其下游效應(yīng)物的激活所介導(dǎo)。常麗萍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)心肌梗死后心力衰竭大鼠給予芪藶強(qiáng)心干預(yù)8周后，大鼠血清游離脂肪酸和心肌組織n-6系多不飽和脂肪酸水平較對(duì)照組顯著降低，提示芪藶強(qiáng)心可減少毒性脂質(zhì)堆積，保護(hù)心肌細(xì)胞，延緩缺血導(dǎo)致慢性心力衰竭的進(jìn)程。心肌細(xì)胞是心臟組織最重要的組成部分，心肌細(xì)胞產(chǎn)能的高低直接影響了心臟收縮和做功效率[9-10]。相較葡萄糖有氧氧化，相同底物水平的脂肪酸β氧化可提供更多的ATP，但產(chǎn)生等量ATP需要多消耗10%的氧，使心臟做功效率下降[11]；同時(shí)葡萄糖酵解獲能效率為31.0%，有氧氧化獲能效率約為41.5%，故有氧氧化是人體內(nèi)絕大多數(shù)組織細(xì)胞獲取能量的方式?？梢?jiàn)在缺氧條件下，促進(jìn)心肌細(xì)胞葡萄糖攝取和有氧氧化是一種高效的供能方式，減輕心肌細(xì)胞在缺血、缺氧環(huán)境下的損傷，從而改善心功能。

本研究結(jié)果顯示，芪藶強(qiáng)心通過(guò)底物水平的攝取與利用、葡萄糖線粒體氧化磷酸化2個(gè)環(huán)節(jié)改善缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞葡萄糖代謝異常。首先，Glut-4表達(dá)水平的升高促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取與利用；缺氧條件下，丙酮酸易被還原為乳酸(即糖酵解)，LDH A表達(dá)水平及活性的下降可使更多的丙酮酸進(jìn)入線粒體參與有氧氧化過(guò)程；PDH、CS相對(duì)表達(dá)量的增多則分別促進(jìn)丙酮酸進(jìn)一步氧化脫羧生成乙酰輔酶A，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，使其徹底氧化成CO2和水，釋放能量。芪藶強(qiáng)心使心肌細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下，通過(guò)高效的葡萄糖代謝方式產(chǎn)生足夠的ATP，使其免受缺氧刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡，延緩心力衰竭的進(jìn)展。

本研究結(jié)果表明，通絡(luò)方藥芪藶強(qiáng)心可改善缺氧心肌細(xì)胞葡萄糖代謝，其療效與曲美他嗪相當(dāng)。然而，芪藶強(qiáng)心還可以通過(guò)促進(jìn)微血管新生、抑制炎癥反應(yīng)等多靶點(diǎn)效應(yīng)改善缺血心肌的功能與代謝[12-13]。心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床綜合征，改善心肌能量代謝是相對(duì)新型的治療靶點(diǎn)。近期的一項(xiàng)臨床研究[14]結(jié)果表明，使衰竭心臟遠(yuǎn)離脂肪酸代謝而向碳水化合物的氧化代謝轉(zhuǎn)變，有利于改善心肌舒縮功能，減緩泵衰竭進(jìn)程。芪藶強(qiáng)心通過(guò)多個(gè)作用靶點(diǎn)改善心肌細(xì)胞葡萄糖代謝，減少了心肌細(xì)胞凋亡，具有較好的臨床治療意義。然而，本研究?jī)H在體外心肌細(xì)胞水平探討了芪藶強(qiáng)心的作用，觀察指標(biāo)相對(duì)簡(jiǎn)單，其在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平上的效應(yīng)及作用機(jī)制尚未明確，故本研究結(jié)果存在一定局限性。此外，氧化磷酸化的調(diào)控過(guò)程、高能磷酸化合物(ATP)的儲(chǔ)備和利用，亦是干預(yù)心肌能量代謝的重要策略，芪藶強(qiáng)心是否還具有相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。