張 楠 王 育 程山山

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemical, EDC)是指能夠干擾人體正常激素合成代謝，進(jìn)而影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的外源性物質(zhì)[1]。大部分EDC屬于持續(xù)性有機(jī)污染物(persistent organic pollutant, POP)。全氟化合物(per and polyfluorinated chemical，PFC)是一類合成的含氟化合物，是20世紀(jì)重要的化工產(chǎn)品之一，主要應(yīng)用于紡織品、紙、涂料、消防泡沫、影像材料、航空液壓等領(lǐng)域，其中以全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonic acid，PFOS)的應(yīng)用最為廣泛。PFOS是全氟碳化物的穩(wěn)定終產(chǎn)物，是現(xiàn)有較難降解的POP之一，具有化學(xué)穩(wěn)定、熱穩(wěn)定和生物累積特性，其在人體內(nèi)的半衰期可長(zhǎng)達(dá)幾十年。飲食、飲酒、飲用水?dāng)z入[2]及室內(nèi)灰塵攝入[3]是人類暴露于PFOS的重要途徑，高等動(dòng)物體內(nèi)PFOS的蓄積水平遠(yuǎn)高于有機(jī)氯農(nóng)藥和二噁英等。

胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)是一種常見的妊娠期并發(fā)癥，與多種圍產(chǎn)期不良結(jié)局的發(fā)生相關(guān)。過(guò)去認(rèn)為，F(xiàn)GR主要由孕期母體營(yíng)養(yǎng)不良所致[4]。然而,隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高，F(xiàn)GR的發(fā)生率卻未明顯下降，某些地區(qū)甚至出現(xiàn)升高；因此，孕期女性暴露于環(huán)境有害因素與FGR發(fā)生的相關(guān)性逐步受到學(xué)者關(guān)注。越來(lái)越多的研究探討了EDC暴露在FGR發(fā)病機(jī)制中的作用。研究[5]顯示，PFOS能夠通過(guò)胎盤，其在人類羊水中的水平約為3.6～28.7 ng/mL，在人類臍帶血中的水平約為3.3～16.4 ng/mL。孕婦血清PFOS水平與胎兒出生體重、頭圍和身長(zhǎng)均呈負(fù)相關(guān)，其水平升高會(huì)顯著增加FGR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[6]。

孕期胎兒暴露于過(guò)量的糖皮質(zhì)激素會(huì)誘使胎兒細(xì)胞增殖過(guò)早停止，導(dǎo)致FGR發(fā)生[7]。在妊娠期，表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞層的11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅱ型(11-β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2, 11β-HSD2)能夠?qū)⒕哂猩锘钚缘钠べ|(zhì)醇脫氫氧化為無(wú)活性的可的松，維持母體與胎兒之間糖皮質(zhì)激素的水平差，保護(hù)胎兒組織免受過(guò)量糖皮質(zhì)激素的危害，被稱為胎盤糖皮質(zhì)激素屏障[8]；因此，胎盤中的11β-HSD2是決定胎兒生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。研究[9]結(jié)果表明，胎兒體重與足月胎盤11β-HSD2的酶活性呈正相關(guān)。與正常胎兒胎盤相比，F(xiàn)GR胎兒胎盤中11β-HSD2的表達(dá)水平和酶活性均顯著降低[10]。

細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡方式，天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase3)是其主要執(zhí)行者[11]。研究[12-13]顯示，PFOS暴露可以促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡，包括神經(jīng)元細(xì)胞和肝細(xì)胞等。本研究利用原代培養(yǎng)的人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞，探究PFOS對(duì)人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞11β-HSD2的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集2020年在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科行擇期剖宮產(chǎn)、無(wú)妊娠并發(fā)癥和合并癥的孕期女性足月分娩的胎盤。胎盤娩出后0.5 h內(nèi)置于裝有250 mL PBS的量杯中待用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)(倫理號(hào)為RA-2020-323)，所有產(chǎn)婦術(shù)前均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)及處理 采用改良的Kliman法[14]分離、提純胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。用無(wú)菌剪剪取母體側(cè)胎盤組織60 g，以4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈。采用含0.125%胰蛋白酶和0.03%脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)的混合消化液消化洗凈的胎盤組織，并在37 ℃水浴搖床中消化3次，每次18 min；收集消化液，離心后收集細(xì)胞。采用密度梯度離心法，以Percoll試劑(美國(guó)輝瑞公司)分離細(xì)胞，收集中間層純化的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，放置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2的培養(yǎng)箱中。本團(tuán)隊(duì)前期研究[15]證實(shí)，分離出的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞在體外條件培養(yǎng)3 d后能夠達(dá)到最大合體化，成為胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞完成合體化后，加入不同濃度的PFOS (0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)分別處理24 h后，收集細(xì)胞的RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析 按照UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說(shuō)明書提取胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA進(jìn)行qRT-PCR。qRT-qPCR退火溫度設(shè)為60 ℃，擴(kuò)增周期設(shè)為40次，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以GAPDH為反應(yīng)內(nèi)參，計(jì)算每個(gè)樣品中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。GAPDH引物序列：正向，3’-CCC CTC TGC TGA TGC CCC CA-5’；反向，5’-TGA CCT TGG CCA GGG GTG CT-3’。11β-HSD2引物序列：正向， 3’-GAC ATG CCA TAT CCG TGC TT-5’；反向，5’-GCT GGA TGA TGC TGA CCT TG-3’。

1.2.3 免疫印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn) 本研究使用不同劑量的PFOS(0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)處理胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞24 h后，采用自制蛋白裂解液(RIPA)提取細(xì)胞總蛋白。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，取40 μg蛋白質(zhì)樣品，以含10%十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，在室溫下以5%脫脂牛奶封閉含目的蛋白質(zhì)的條帶1 h，PBS洗滌后以11β-HSD2(1∶2 000)、pro-caspase3(1∶1 000)和cleaved-caspase3(1∶1 000)一抗抗體(均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物科技公司)分別在4 ℃下孵育條帶、過(guò)夜。洗膜后，在室溫下與相應(yīng)二抗抗體孵育2 h，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶目的蛋白質(zhì)灰度值。以GAPDH抗體(1∶50 000)(Proteintech中國(guó)公司)作為內(nèi)參，測(cè)定各相關(guān)蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 11β-HSD2 酶活性測(cè)定 通過(guò)檢測(cè)胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞將皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為可的松的轉(zhuǎn)化率來(lái)計(jì)算11β-HSD2的酶活性。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)3 d合體化為胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞后，經(jīng)不同劑量的PFOS(0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)處理24 h后，更換培養(yǎng)液，分別加入1 μmol/L的皮質(zhì)醇孵育3 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。應(yīng)用人皮質(zhì)醇免疫測(cè)定試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司)檢測(cè)培養(yǎng)液中皮質(zhì)醇水平，應(yīng)用人可的松化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒(美國(guó)Innovative Research公司)檢測(cè)培養(yǎng)液中可的松水平，以皮質(zhì)醇至可的松的轉(zhuǎn)化率作為11β-HSD2酶活性的指標(biāo)。

1.2.5 caspase3酶活性測(cè)定 使用Caspase-Glo?Assay kit(美國(guó)Promega公司)試劑盒測(cè)定胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞中caspase3酶活性。將分離的人原代胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞鋪種于96孔板，細(xì)胞濃度為2×104/mL，體外培養(yǎng)3 d后，加入不同劑量的PFOS (0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)處理24 h后，將試劑盒中的caspase3緩沖液加入caspase3底物中，混勻后制成caspase-glo3試劑，在每孔細(xì)胞加入100 μL(設(shè)置空白孔、陰性對(duì)照孔、實(shí)驗(yàn)孔)，輕柔混勻，室溫孵育1 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的數(shù)值，計(jì)算caspase3酶活性的相對(duì)比值。

2 結(jié) 果

2.1 11β-HSD2的表達(dá)水平隨著胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的合體化逐漸升高 體外培養(yǎng)第1、2、3天，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中11β-HSD2的mRNA和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，與未處理時(shí)(即體外培養(yǎng)第0天)比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(體外培養(yǎng)第1、2、3天與未處理時(shí)mRNA相對(duì)表達(dá)量比較：t=3.922，P=0.017；t=6.859，P=0.002；t=7.043，P=0.002。體外培養(yǎng)第1、2、3天與未處理時(shí)蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量比較：t=3.429，P=0.026；t=6.669,P=0.002 6；t=10.279,P=0.000 5)。提示11β-HSD2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨著胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的不斷合體化而逐漸升高。見表1、圖1。

表1 11β-HDS2的表達(dá)水平隨胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的合體化逐漸升高

1為未處理時(shí)，2為體外培養(yǎng)第1天，3為體外培養(yǎng)第2天，4為體外培養(yǎng)第3天圖1 11β-HSD2蛋白質(zhì)表達(dá)情況

2.2 PFOS呈濃度依賴性地抑制人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞 0.01 μmol/L PFOS處理的人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞11β-HSD2的mRNA和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量較未處理時(shí)顯著降低，且11β-HSD2的mRNA和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量隨著PFOS劑量的增加(0.1、1、10 μmol/L)顯著降低(0.01、0.1、1、10 μmol/L與未處理時(shí)mRNA相對(duì)表達(dá)量比較：t=4.121,P=0.021；t=5.692,P=0.008；t=7.810,P=0.002；t=9.413,P=0.001。0.01、0.1、1、10 μmol/L與未處理時(shí)蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量比較：t=4.682，P=0.009；t=7.669，P=0.002；t=10.786，P=0.000 4；t=12.859，P=0.000 2)。同時(shí)，0.01 μmol/L PFOS處理的人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞11β-HSD2酶活性較未處理時(shí)顯著降低，并隨著PFOS劑量的增加(0.1、1、10 μmol/L)，11β-HSD2酶活性受抑制程度顯著增強(qiáng)(0.01、0.1、1、10 μmol/L與未處理時(shí)酶活性水平比較:t=8.348，P=0.011；t=7.581，P=0.002；t=9.012，P=0.001；t=12.498,P=0.000 2)。見表2、圖2。

表2 PFOS呈濃度依賴性地抑制人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞11β-HSD2的表達(dá)和酶活性

1為未處理時(shí)，2為0.001 μmol/L PFOS，3為0.01 μmol/L PFOS，4為0.1 μmol/L PFOS，5為1 μmol/L PFOS，6為10 μmol/L PFOS圖2 PFOS抑制11β-HSD2蛋白質(zhì)的表達(dá)情況

2.3 PFOS呈濃度依賴性地促進(jìn)人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡 0.01 μmol/L PFOS處理的人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞pro-caspase3蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量較未處理時(shí)顯著降低，且蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量隨著PFOS劑量的增加(0.1、1、10 μmol/L)顯著降低(0.01、0.1、1、10 μmol/L與處理時(shí)比較:t=7.181，P=0.002；t=13.095，P=0.000 2；t=11.150，P=0.000 3；t=15.685，P<0.000 1)。同時(shí)，0.01 μmol/L PFOS處理的人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞cleaved-caspase3的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量較未處理時(shí)顯著升高，并隨著PFOS劑量的增加顯著升高(0.01、0.1、1、10 μmol/L與未處理時(shí)比較:t=3.354，P=0.028；t=5.578，P=0.025；t=8.126，P=0.001 2；t=14.087，P=0.000 1)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.01 μmol/L PFOS處理的人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞caspase3的酶活性較未處理時(shí)顯著增強(qiáng)，并隨著PFOS劑量的增加,其活性顯著增強(qiáng)(0.01、0.1、1、10 μmol/L與未處理時(shí)比較:t=4.142，P=0.014；t=7.430，P=0.002；t=7.043，P=0.005；t=15.263,P=0.000 1)。見表3、圖3。

表3 PFOS呈濃度依賴性地促進(jìn)人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡

1為未處理時(shí)，2為0.001 μmol/L PFOS，3為0.01 μmol/L PFOS，4為0.1 μmol/L PFOS，5為1 μmol/L PFOS，6為10 μmol/LPFOS圖3 pro-caspase3和cleaved-caspase3蛋白質(zhì)表達(dá)的情況

3 討 論

PFOS作為EDC對(duì)人體健康有巨大的潛在危害，可誘導(dǎo)多系統(tǒng)毒性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，PFOS對(duì)人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞11β-HSD2的表達(dá)有顯著抑制作用，同時(shí)能夠促進(jìn)人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。

胎盤是女性妊娠期的特殊器官，主要在胎盤合體絨毛層合成的11β-HSD2不僅能夠代謝糖皮質(zhì)激素，保護(hù)胎兒免受過(guò)高水平的糖皮質(zhì)激素作用，還與哺乳動(dòng)物的許多胎源性疾病密切相關(guān)。抑制、敲除或干擾胎盤中11β-HSD2的表達(dá)，與妊娠時(shí)間縮短、胎兒出生體重下降及子代的生長(zhǎng)發(fā)育編程受影響有關(guān)[16]。本課題組前期的研究[17]結(jié)果表明，在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞向合體滋養(yǎng)細(xì)胞分化的過(guò)程中，11β-HSD2的表達(dá)量逐漸增加，在細(xì)胞完成合體化后其表達(dá)達(dá)到峰值。在研究中，應(yīng)用不同劑量的PFOS(0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)處理胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PFOS能夠抑制胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞11β-HSD2的表達(dá)和酶活性，且隨著PFOS劑量的增高，抑制作用也逐漸增強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡方式，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的適度凋亡對(duì)維持胎盤的正常功能具有重要作用，但是擾亂胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程也會(huì)對(duì)胎盤的功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致妊娠合并癥與并發(fā)癥的發(fā)生。caspase3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，其活化的標(biāo)志是從前體型的pro-caspase3轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚偷腸leaved-caspase3，也是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性事件。在存在子癇前期和FGR患者的胎盤中，cleaved-caspase3蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯增加[18]。本研究通過(guò)檢測(cè)不同劑量PFOS(0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)處理后胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞中pro-caspase3和cleaved-caspase3蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)PFOS能夠呈濃度依賴性地下調(diào)胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞中pro-caspase3蛋白質(zhì)表達(dá)，上調(diào)cleaved-caspase3蛋白質(zhì)表達(dá)，同時(shí)caspase3的酶活性隨著PFOS濃度的升高而增強(qiáng)。上述結(jié)果提示，PFOS能夠促進(jìn)胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，且隨著PFOS劑量的增高其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。但是PFOS對(duì)11β-HSD2和caspase3作用之間的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究予以明確。

綜上所述，本研究證實(shí)了EDC PFOS能夠抑制人胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞11β-HSD2的表達(dá)和酶活性，促進(jìn)該細(xì)胞凋亡，且作用強(qiáng)度隨著PFOS濃度的升高而增強(qiáng)。筆者推測(cè)，這可能是PFOS暴露導(dǎo)致FGR等妊娠合并癥與并發(fā)癥發(fā)生的主要原因之一，其可影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。