朱林清，曾名湧

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島市海洋食品保鮮技術(shù)工程研究中心，山東青島 266003）

聚球藻PCC7002（Synechococcussp.PCC7002，簡(jiǎn)稱(chēng)“聚球藻”）是一類(lèi)海洋中分布廣泛的單細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌，因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且全基因組序列已被破譯等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是基因工程領(lǐng)域內(nèi)外源基因表達(dá)的理想宿主[1]。除遺傳背景清晰之外，廣鹽性的聚球藻對(duì)高溫、強(qiáng)光均有一定的耐受性，被認(rèn)為是細(xì)胞倍增速度最快的常見(jiàn)模式藻種[2]。近年來(lái)，藻體內(nèi)嗜鐵素[3]、多聚磷酸體[4]、類(lèi)胡蘿卜素[5]、多糖[6]等活性成分的研究使聚球藻逐漸為食品領(lǐng)域內(nèi)的研究者所關(guān)注，使它有望成為工業(yè)領(lǐng)域中又一可供高值化開(kāi)發(fā)的微藻資源。

藻藍(lán)蛋白（Phycocyanin，PC）是存在于藍(lán)藻、紅藻等藻種內(nèi)、由脫輔基蛋白通過(guò)硫醚鍵共價(jià)結(jié)合藻藍(lán)膽素而形成的一類(lèi)胞內(nèi)水溶性蛋白，在葉綠素a 光吸收較差的范圍內(nèi)起著增強(qiáng)光吸收的作用。藻藍(lán)蛋白是我國(guó)《GB 2760-2014 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中唯一被批準(zhǔn)在食品中使用的天然藍(lán)色色素[7]，既可添加到果凍、奶酪、飲料、雪糕等食品中賦予食品新奇的藍(lán)色色澤，又具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生理活性[8]，能發(fā)揮一定的保健功能。然而，當(dāng)藻藍(lán)蛋白配制成酸性食品或進(jìn)行巴氏殺菌時(shí)，其膠體穩(wěn)定性和顏色穩(wěn)定性差，限制了藻藍(lán)蛋白在食品領(lǐng)域的廣泛使用[9]。據(jù)研究[10-11]，藻藍(lán)蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)在50 ℃以上就會(huì)變性，進(jìn)而導(dǎo)致四吡咯發(fā)色團(tuán)的失穩(wěn)以及藍(lán)色色澤的消褪。作為食品加工中必不可少的步驟，熱殺菌對(duì)藻藍(lán)蛋白呈色穩(wěn)定性破壞極大且不可避免。因此，藻藍(lán)蛋白熱處理過(guò)程中的褪色機(jī)理研究對(duì)于其實(shí)際應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義，也是藻藍(lán)蛋白護(hù)色技術(shù)研究的重要理論依據(jù)。

由于螺旋藻已被產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖且被批準(zhǔn)在食品中應(yīng)用，因此目前關(guān)于藻藍(lán)蛋白的研究主要與螺旋藻相關(guān)，而聚球藻藻藍(lán)蛋白的研究則相對(duì)匱乏。郭偉等[12]發(fā)現(xiàn)聚球藻的藻藍(lán)蛋白含量高達(dá)15.81%，與螺旋藻中的含量相當(dāng)，表明聚球藻可作為提取藻藍(lán)蛋白的潛在原料。因此，本研究以聚球藻為原料提取純化藻藍(lán)蛋白，探究藻藍(lán)蛋白在熱處理過(guò)程中的褪色機(jī)理，以期為提高藻藍(lán)蛋白熱穩(wěn)定性提供理論依據(jù)，促進(jìn)對(duì)微藻資源的深度開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

聚球藻（Synechococcussp.PCC7002）干粉 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、收集及凍干獲取，聚球藻PCC7002 由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙進(jìn)東院士惠贈(zèng)；氯化鈣（分析級(jí)）、氯化鈉（分析級(jí)）、硝酸鉀（分析級(jí)）、硫酸銨（分析級(jí)）、溴化鉀（光譜純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖（水溶性）食品級(jí)，浙江一諾生物科技有限公司；甘氨酸（生物技術(shù)級(jí)）、十二烷基硫酸鈉（生物技術(shù)級(jí)）、三羥甲基氨基甲烷（生物技術(shù)級(jí)）、瓊脂（生物技術(shù)級(jí)）、40% Acr/bis（29:1）、1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）、1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、10%AP（過(guò)硫酸銨）、TEMED 北京索萊寶科技有限公司。

GL-2M 高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)有限公司；GXZ-280 光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠(chǎng)；G154T 全自動(dòng)高壓滅菌鍋 致微儀器有限公司；AH110B 高壓均質(zhì)機(jī) ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司；HJ-6CS 磁力攪拌水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；3nh 高品質(zhì)電腦色差儀 深圳市三恩馳科技有限公司；UV-2550 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；F-4600 熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；NicoletiS10傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛公司；Nano-zs 90 激光粒度分析儀 英國(guó)馬爾文儀器公司；Protean 凝膠電泳裝置 美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚球藻干粉的獲取 參照郭偉等[12]的培養(yǎng)方法，選取平板上生長(zhǎng)良好的聚球藻接種于5 L 的Medium A 培養(yǎng)基中通入空氣進(jìn)行培養(yǎng)，環(huán)境溫度設(shè)置為32 ℃；以照明日光燈為光源，光照強(qiáng)度達(dá)到100 μE/（m2·s）。聚球藻培養(yǎng)至穩(wěn)定期后收獲（12～13 d），離心所得的藻液（8000 r/min，10 min）收集藻泥。將藻泥重懸于去離子水中再離心，重復(fù)操作2～3 次進(jìn)行脫鹽，最后將藻泥冷凍干燥得到聚球藻干粉。

1.2.2 藻藍(lán)蛋白提取條件優(yōu)化 參考劉立闖等[13]的方法，并作部分修改。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，以藻藍(lán)蛋白純度和得率為指標(biāo)分別探究提取介質(zhì)、介質(zhì)濃度、藻體濃度、均質(zhì)壓力、均質(zhì)時(shí)間對(duì)高壓均質(zhì)破壁藻細(xì)胞溶出藻藍(lán)蛋白的影響。

1.2.2.1 提取介質(zhì)對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響固定提取介質(zhì)濃度為0.01 mol/L，將凍干藻粉分別溶于NaCl、KNO3、CaCl2、PBS 溶液及去離子水中配制0.5 mg/mL 的藻液，60 MPa 下均質(zhì)5 min 后離心收集上清液（8000 r/min，10 min），用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液的A620、A650和A280。

1.2.2.2 介質(zhì)濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響固定提取介質(zhì)為NaCl 溶液，將藻粉分別溶于0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mol/L 的NaCl 溶液中配制0.5 mg/mL 的藻液，60 MPa 下均質(zhì)5 min 后離心收集上清液（8000 r/min，10 min），用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液的A620、A650和A280。

1.2.2.3 藻體濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響固定提取介質(zhì)為0.04 mol/L NaCl 溶液，將藻粉溶于NaCl 溶液中配制藻體濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的藻液，60 MPa 下均質(zhì)5 min 后離心收集上清液（8000 r/min，10 min），用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液的A620、A650和A280。

1.2.2.4 均質(zhì)壓力對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響 固定提取介質(zhì)為0.04 mol/L NaCl，藻體濃度為2 mg/mL，將藻液分別于20、40、60、80、100 MPa 下均質(zhì)5 min后離心收集上清液（8000 r/min，10 min），用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液的A620、A650和A280。

1.2.2.5 均質(zhì)時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響 固定提取介質(zhì)為0.04 mol/L NaCl，藻體濃度為2 mg/mL，均質(zhì)壓力為80 MPa，將藻液分別均質(zhì)5、7、9、11、13、15 min 后離心收集上清液（8000 r/min，10 min），用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液的A620、A650和A280。

1.2.3 藻藍(lán)蛋白粗提液純化 以藻藍(lán)蛋白純度和回收率為指標(biāo)，通過(guò)殼聚糖絮凝、硫酸銨鹽析純化所得的藻藍(lán)蛋白粗提液。

1.2.3.1 殼聚糖濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響 參考廖曉霞等[14]的方法，并作修改。向藻藍(lán)蛋白粗提液中加入殼聚糖，使其濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL，混勻并靜置5 min 后離心收集上清液（8000 r/min，10 min），用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液的A620、A650和A280。

1.2.3.2 硫酸銨飽和度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響 參考于淑坤等[15]的方法，并作改動(dòng)。向經(jīng)終濃度為0.15 mg/mL 的殼聚糖純化得到的上清液緩慢加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨飽和度分別為45%、50%、55%、60%、65%、70%，混勻并在4 ℃過(guò)夜后離心取沉淀（8000 r/min，10 min），將沉淀復(fù)溶于同等體積的PBS 溶液中，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其A620、A650和A280。

1.2.4 藻藍(lán)蛋白干粉的獲取 將經(jīng)0.15 mg/mL 殼聚糖溶液、50%飽和硫酸銨純化后得到的藻藍(lán)蛋白溶液裝于截留分子量為8～10 kDa 的透析袋中脫鹽3 d，透析后的溶液冷凍干燥獲得藻藍(lán)蛋白干粉。

1.2.5 藻藍(lán)蛋白熱致褪色機(jī)理研究 將藻藍(lán)蛋白干粉溶于PBS 溶液配制濃度為0.5 mg/mL 的藻藍(lán)蛋白溶液，將其分別于50、60、70、80、90 ℃水浴中熱處理30 min 后立即冷卻至常溫，測(cè)定經(jīng)熱處理后藻藍(lán)蛋白的色澤指標(biāo)、UV-Vis 光譜、熒光發(fā)射光譜、FTIR 光譜、電位粒徑及亞基分子量分布，未經(jīng)熱處理的藻藍(lán)蛋白溶液作為空白對(duì)照。

1.2.5.1 色澤指標(biāo)測(cè)定 將2 mL 藻藍(lán)蛋白溶液加入24 孔板，孔板下面放空白A4 紙作為空白背景，在同一光源下用色度儀測(cè)定溶液的L*、a*、b*值。

1.2.5.2 UV-Vis 光譜測(cè)定 將1 mL 藻藍(lán)蛋白溶液加入1 cm 石英比色皿，在200～800 nm 處掃描溶液的UV-Vis 光譜，并計(jì)算藻藍(lán)蛋白溶液的色素保留率和Avis/Auv值，溶液測(cè)定前稀釋3 倍。

1.2.5.3 熒光發(fā)射光譜測(cè)定 將1 mL 藻藍(lán)蛋白溶液加入熒光比色皿，PMT 電壓設(shè)置為700 V，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5 nm。其中測(cè)定藻藍(lán)蛋白溶液內(nèi)源熒光光譜的條件[16]為：Ex=295 nm，Em=310～400 nm；特征熒光發(fā)射光譜為：Ex=620 nm，Em=630～680 nm；溶液測(cè)定前稀釋3 倍。

1.2.5.4 粒徑和電位測(cè)定 樣品測(cè)定前不稀釋?zhuān)苜|(zhì)和溶劑折射率分別設(shè)為1.45 和1.33，在25 ℃的平衡溫度下以自動(dòng)模式測(cè)定藻藍(lán)蛋白溶液的電位和粒徑。

1.2.5.5 FTIR 光譜測(cè)定 將熱處理后的藻藍(lán)蛋白溶液凍干成粉，以質(zhì)量比1:100 與KBr 混勻壓片進(jìn)行光譜測(cè)定。以溴化鉀為采集背景，格式設(shè)置為%透過(guò)率，掃描次數(shù)為32，溴化鉀使用前于120 ℃下烘干24 h。

1.2.5.6 SDS-PAGE 電泳測(cè)定 應(yīng)用不連續(xù)電泳系統(tǒng)進(jìn)行蛋白電泳，其中濃縮膠與分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和12%。樣品上樣20 μL，上樣濃度1.5 mg/mL，開(kāi)始電壓恒定為80 V，Marker 分離后（約30 min）將電壓調(diào)至120 V，樣品跑到玻璃板接近底部時(shí)電泳結(jié)束。用鏟子取膠放入平皿，倒入染色液染色2 h，脫色液過(guò)夜脫色。

1.2.6 藻藍(lán)蛋白分析方法 藻藍(lán)蛋白純度級(jí)別的計(jì)算參照Herrera 等[17]的方法，藻藍(lán)蛋白濃度以Soni 等[18]推薦的公式計(jì)算，而藻藍(lán)蛋白色素保留率參考Jespersen 等[10]的方法計(jì)算，如下所示：

式中：P 為藻藍(lán)蛋白純度；[PC]為藻藍(lán)蛋白濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；k 為藻藍(lán)蛋白提取液的稀釋倍數(shù)；m 為藻粉質(zhì)量，mg；ΔEab為相應(yīng)溫度下藻藍(lán)蛋白溶液的總色差，為未經(jīng)熱處理的藻藍(lán)蛋白溶液的色度值；A620（T）為經(jīng)過(guò)相應(yīng)溫度處理30 min 后藻藍(lán)蛋白溶液的A620，A620（0）為未經(jīng)熱處理的藻藍(lán)蛋白溶液的A620。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究中的所有實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3 次，數(shù)值結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，所得數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍(lán)蛋白提取條件優(yōu)化

2.1.1 提取介質(zhì)及介質(zhì)濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響 高壓均質(zhì)是一類(lèi)通過(guò)高速剪切、碰撞及壓力驟減等手段破環(huán)細(xì)胞壁以釋放胞內(nèi)分子的工業(yè)技術(shù)[19]。與反復(fù)凍融、超聲破碎等傳統(tǒng)破壁方法相比，高壓均質(zhì)具有效率高、易控制、便于工業(yè)擴(kuò)大化等優(yōu)勢(shì)。提取介質(zhì)及其濃度的大小關(guān)系到高壓均質(zhì)破壁效果，甚至與目標(biāo)溶出物的穩(wěn)定性相關(guān)。如圖1 所示，盡管NaCl 溶液所提取的藻藍(lán)蛋白純度比氯化鈣溶液低，但得率卻是所有提取介質(zhì)中最高的。劉立闖等[13]研究提取介質(zhì)對(duì)于超聲破碎溶出藻膽蛋白的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)NaCl 溶液在所用溶劑中也具有最高的蛋白溶出率，因此選擇NaCl 溶液作為藻藍(lán)蛋白的提取溶劑。

圖1 提取介質(zhì)對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響Fig.1 Effects of extraction medium on the yield and purity of phycocyanin

相對(duì)于其他提取介質(zhì)而言，NaCl 溶液不但利于藻藍(lán)蛋白的提取且能提高它在溶液中的穩(wěn)定性，因此對(duì)于藻藍(lán)蛋白的提取效率最高。但從圖2 的結(jié)果可知，藻藍(lán)蛋白得率隨NaCl 濃度先升高后降低，與劉立闖等[13]所得到的趨勢(shì)相一致。因此，NaCl 溶液的濃度不易過(guò)高，應(yīng)選擇0.04 mol/L 為宜。

圖2 介質(zhì)濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響Fig.2 Effects of medium concentration on the yield and purity of phycocyanin

2.1.2 藻體濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響 如圖3 所示，藻藍(lán)蛋白得率隨藻體濃度的增加而緩慢增加，在2.0 mg/mL 時(shí)達(dá)到穩(wěn)定。而藻藍(lán)蛋白純度隨著藻體濃度的升高則明顯增大，在2.0 mg/mL 時(shí)達(dá)到最大后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明說(shuō)明單位藻細(xì)胞可利用溶劑的減少能減少雜蛋白的溶出從而提高藻藍(lán)蛋白純度[20]，但藻體濃度過(guò)大時(shí)同樣會(huì)因此不利于藻藍(lán)蛋白的溶出。因此，綜合考慮藻藍(lán)蛋白得率和純度，2.0 mg/mL 為高壓均質(zhì)最適的藻體濃度。

圖3 藻體濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響Fig.3 Effects of algal concentration on the yield and purity of phycocyanin

2.1.3 均質(zhì)壓力對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響 均質(zhì)壓力直接影響著藻細(xì)胞破壁效果的好壞，壓力過(guò)小會(huì)使藻細(xì)胞破壁效果差，壓力過(guò)大則可能破壞目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)而使得率下降。由圖4 可得，隨著均質(zhì)壓力的升高，藻藍(lán)蛋白的得率和純度逐步增大，到80 MPa后趨于平緩。以上結(jié)果與陳裕[21]的研究結(jié)果較為一致，但藻藍(lán)蛋白得率和純度趨于穩(wěn)定時(shí)的壓力值不同，這可能是由于藻種及所用儀器差異引起的。因此，綜合考慮藻藍(lán)蛋白的純度和得率，均質(zhì)壓力以80 MPa 為宜。

圖4 均質(zhì)壓力對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響Fig.4 Effects of homogeneous pressure on the yield and purity of phycocyanin

2.1.4 均質(zhì)時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響 如圖5 所示，隨著高壓均質(zhì)時(shí)間的延長(zhǎng)，藻藍(lán)蛋白純度和得率逐漸趨于穩(wěn)定。綜合得率、純度及操作成本考慮，高壓均質(zhì)的最適時(shí)間為7 min，所得的藻藍(lán)蛋白純度和得率分別可達(dá)到0.6950±0.0043 和10.5081%±0.0936%。

圖5 均質(zhì)時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率和純度的影響Fig.5 Effects of homogenization time on the yield and purity of phycocyanin

2.2 藻藍(lán)蛋白粗提液純化

2.2.1 殼聚糖濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響 殼聚糖是帶有大量氨基基團(tuán)的陽(yáng)離子多糖，可以絮凝帶負(fù)電的藻細(xì)胞及雜蛋白，從而達(dá)到蛋白純化的目的[22]。從圖6 可以看出，藻藍(lán)蛋白回收率隨著殼聚糖濃度的升高而逐步下降到24.96%，而藻藍(lán)蛋白純度則呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)且0.15 mg/mL 的殼聚糖下達(dá)到最高。當(dāng)殼聚糖濃度大于0.20 mg/mL 時(shí)，殼聚糖分子數(shù)的增加使靜電吸附增強(qiáng)而選擇吸附性減弱[23]，沉淀雜蛋白的同時(shí)也會(huì)大量沉淀藻藍(lán)蛋白，導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白回收率和純度均下降。因此，兼顧藻藍(lán)蛋白純度與得率，選擇0.15 mg/mL 作為殼聚糖絮凝的合適濃度，此時(shí)藻藍(lán)蛋白純度可提高到1.2616±0.0183，回收率為88.2811%±1.2027%。

圖6 殼聚糖濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響Fig.6 Effects of chitosan concentration on the purity and recovery of phycocyanin

2.2.2 硫酸銨飽和度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響 高濃度的中性鹽能破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，從而使目標(biāo)蛋白失穩(wěn)從溶液中析出，達(dá)到純化的目的。由圖7 可得，當(dāng)硫酸銨飽和度≥50%時(shí)，藻藍(lán)蛋白回收率已逐步趨于穩(wěn)定，而硫酸銨飽和度為50%時(shí)藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到最大，因此綜合考慮純度和回收率，選擇50%飽和硫酸銨用于藻藍(lán)蛋白純化，所得的藻藍(lán)蛋白純度和回收率分別可達(dá)到1.9084±0.2621 和80.66%±4.41%。

圖7 硫酸銨飽和度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響Fig.7 Effects of ammonium sulfate saturation on the purity and recovery of phycocyanin

2.3 藻藍(lán)蛋白熱致褪色機(jī)理研究

2.3.1 色澤指標(biāo)分析 如圖8 的結(jié)果所示，隨著加熱溫度升高，L*值、b*值逐步變大，即溶液顏色逐步由暗變亮、由藍(lán)變黃，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白的深藍(lán)色澤隨溫度的升高而逐步消褪。在處理溫度為50 ℃時(shí)，藻藍(lán)蛋白溶液的b*值與未經(jīng)熱處理的無(wú)顯著差異（P＞0.05），且ΔEab很小。然而，當(dāng)溫度到達(dá)60 ℃時(shí)，b*值和ΔEab便開(kāi)始顯著增大，說(shuō)明60 ℃可能是藻藍(lán)蛋白溶液的藍(lán)色大幅消褪的分界點(diǎn)。

圖8 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白溶液L*，a*，b*值的影響Fig.8 Influence of different heating temperature on L*,a*,b *value of phycocyanin solution

2.3.2 UV-Vis 光譜分析 藻藍(lán)蛋白的特征吸收峰波長(zhǎng)在620 nm 左右，是蛋白質(zhì)及其所連接的發(fā)色團(tuán)所處狀態(tài)的外在光譜性質(zhì)體現(xiàn)，因此A620的變化可以用于表示色素保留率以及發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)的破壞程度[24-25]。如圖9 所示，藻藍(lán)蛋白色素保留率由50 ℃時(shí)的90.17%下降到60 ℃時(shí)的27.21%，導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白溶液在60 ℃時(shí)的b*值和ΔEab顯著（P＜0.05）增大。另外，當(dāng)溫度升至80 ℃時(shí)，藻藍(lán)蛋白溶液的色素保留率相對(duì)于60 ℃時(shí)的保留率出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明80 ℃下藻藍(lán)蛋白色澤消褪的程度可能進(jìn)一步加深。

圖9 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白色素保留率的影響Fig.9 Influence of different treatment temperatures on the retention rate of phycocyanin pigment

大部分蛋白質(zhì)含有色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸，因而在280 nm 處有特征吸收峰。如圖10 所示，隨著處理溫度增加到60 ℃，280 nm 處的蛋白吸收峰消失，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白有序三維結(jié)構(gòu)在60 ℃下被破壞，從而將芳香族氨基酸埋藏得更深[26]。與此同時(shí)，游離藻藍(lán)膽素發(fā)色團(tuán)的360 nm 處特征吸收峰隨280 nm 處吸收峰的消失而出現(xiàn)，這是因蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)變性四吡咯發(fā)色團(tuán)重排而引起的[27]。

圖10 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白紫外可見(jiàn)光光譜的影響Fig.10 Influence of different treatment temperatures on the ultraviolet visible light spectra of phycocyanin

Avis/Auv是可見(jiàn)光區(qū)（～600 nm）最大吸收峰值與紫外區(qū)（～360 nm）最大吸收峰值之比，可作為四吡咯發(fā)色團(tuán)構(gòu)象的粗略度量[28]。由圖11 的結(jié)果可知，當(dāng)處理溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，Avis/Auv值由3.09（＞＞1，天然的線(xiàn)性構(gòu)象）變?yōu)?.86（＜1，游離的螺旋構(gòu)象），說(shuō)明發(fā)色團(tuán)發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，即上述因蛋白結(jié)構(gòu)變性引起的重排。區(qū)別于有序的化學(xué)變性，熱處理同時(shí)影響藻藍(lán)蛋白的發(fā)色團(tuán)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而引起褪色[29]。另外，從80 ℃起發(fā)色團(tuán)的Avis/Auv值趨于穩(wěn)定（P＞0.05）且360 nm 處的吸收峰消失，這可能是80 ℃下形成的蛋白聚集體將四吡咯發(fā)色團(tuán)包埋于其內(nèi)的結(jié)果。

圖11 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白溶液Avis/Auv 值的影響Fig.11 Influence of different heating temperature on Avis/Auv value of phycocyanin solution

2.3.3 熒光發(fā)射光譜分析 內(nèi)源熒光的產(chǎn)生是由于藻藍(lán)蛋白中色氨酸的熒光發(fā)射所引起的，與蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)狀態(tài)密切相關(guān)[30]。內(nèi)源熒光的藍(lán)移或強(qiáng)度減小表明體系環(huán)境（含色氨酸）非極性增強(qiáng)，而色氨酸熒光的紅移或強(qiáng)度增大則是氨基酸暴露于極性環(huán)境中的結(jié)果[31]。如圖12 結(jié)果所示，隨著溫度升高，色氨酸的內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降且吸收峰波長(zhǎng)藍(lán)移，說(shuō)明色氨酸所處環(huán)境非極性增強(qiáng)，藻藍(lán)蛋白在60 ℃起由于有序三維結(jié)構(gòu)的破壞而開(kāi)始發(fā)生聚集。

圖12 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白內(nèi)源性熒光發(fā)射光譜的影響Fig.12 Influence of different treatment temperatures on the endogenous fluorescence emission spectra of phycocyanin

藻藍(lán)蛋白由于四吡咯發(fā)色團(tuán)的存在，在620 nm處被激發(fā)后能發(fā)射出自身的特征性熒光。由圖13可知，藻藍(lán)蛋白特征熒光隨溫度的升高發(fā)生明顯的藍(lán)移和強(qiáng)度下降，60 ℃下以脫輔基蛋白有序三維結(jié)構(gòu)為重要基礎(chǔ)的藻藍(lán)膽素?zé)晒馓匦源蠓鶞p少，這與梁霄等[32]的結(jié)果一致。綜合之前的結(jié)果，可以得出：在熱處理時(shí)間為30 min 的前提下，60 ℃作為藻藍(lán)蛋白藍(lán)色色澤消褪的關(guān)鍵溫度點(diǎn)；在此溫度下，熱處理引起的脫輔基蛋白有序的三維結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致依托于蛋白骨架的藻藍(lán)膽素天然構(gòu)象及光學(xué)性質(zhì)遭到破壞，從而使溶液中有呈色活性的藻藍(lán)蛋白分子大幅減少，藻藍(lán)蛋白溶液的藍(lán)色色澤因此大幅消褪。

圖13 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白特征性熒光發(fā)射光譜的影響Fig.13 Influence of different treatment temperatures on the characteristic fluorescence emission spectra of phycocyanin

2.3.4 粒徑和電位分析 如表1 所示，未經(jīng)熱處理的藻藍(lán)蛋白無(wú)法測(cè)定出其平均粒徑，與先前研究結(jié)果相一致[33-34]，可能是藻藍(lán)蛋白的水溶性大或是自身顏色干擾所引起的。50 ℃下的粒徑同樣無(wú)法測(cè)出，說(shuō)明50 ℃下處理30 min 能較好保持藻藍(lán)蛋白的天然狀態(tài)；60 ℃下藻藍(lán)蛋白由于蛋白結(jié)構(gòu)破壞而趨于聚集，可以用于解釋280 nm 左右吸收峰的消失；而80 ℃下藻藍(lán)蛋白粒徑顯著增大（P＜0.05），藻藍(lán)蛋白進(jìn)一步的聚集可能將游離四吡咯發(fā)色團(tuán)包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部，使溶液的藍(lán)色再度變淺，與2.3.2 的結(jié)果相印證。

表1 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白粒徑及電位的影響Table 1 Influence of different treatment temperatures on particle size and potential of phycocyanin

2.3.5 FTIR 光譜分析 如圖14 所示，藻藍(lán)蛋白的紅外特征吸收峰分別在3413、1654.47、1541.79、1399.25、1078.35 cm-1處，與文獻(xiàn)[35]中報(bào)導(dǎo)的基本一致。未經(jīng)熱處理的藻藍(lán)蛋白紅外光譜上3413.43 cm-1的峰對(duì)應(yīng)O-H 和N-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)及帶有氫鍵結(jié)合的仲胺基，該吸收峰在50 ℃下出現(xiàn)藍(lán)移并隨著熱處理溫度升高峰形逐步尖銳，與蛋白質(zhì)分子相關(guān)的氫鍵作用加強(qiáng)有關(guān)[36]。而出現(xiàn)氫鍵作用加強(qiáng)的原因可能是蛋白質(zhì)與水之間的氫鍵相互作用被蛋白質(zhì)之間的氫鍵相互作用代替，表明蛋白質(zhì)水化能力的降低及蛋白質(zhì)聚集程度的增大[37]。1654.47 和1541.79 cm-1分別代表著蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶，對(duì)于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化十分敏感。代表α螺旋的1654.47 cm-1處尖銳峰在60 ℃后逐鍵變寬，表明藻藍(lán)蛋白分子中主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞。

圖14 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白紅外光譜的影響Fig.14 Influence of different treatment temperatures on the infrared spectra of phycocyanin

2.3.6 SDS-PAGE 電泳分析 如圖15 所示，純化后的聚球藻7002 的藻藍(lán)蛋白由α、β兩種亞基構(gòu)成，這與之前的研究結(jié)果一致[38]。隨著熱處理溫度的升高，α亞基的條帶仍清晰可見(jiàn)，但β亞基的條帶顏色卻逐漸變淡，說(shuō)明β亞基對(duì)于高溫的熱穩(wěn)定性可能遠(yuǎn)不及α亞基。藻藍(lán)蛋白單體（αβ）分子上共價(jià)結(jié)合著3 個(gè)四吡咯發(fā)色團(tuán)，其中1 個(gè)結(jié)合在α亞基的84 位半胱氨酸殘基上，而另外兩個(gè)結(jié)合在β亞基的84、155 位半胱氨酸殘基上[39]，因此β亞基的破壞可能是藻藍(lán)蛋白藍(lán)色色澤嚴(yán)重消褪的主要原因之一。

圖15 不同處理溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白亞基分子量的影響Fig.15 Influence of different treatment temperatures on the molecular weight of phycocyanin subunits

3 結(jié)論

本研究以聚球藻 PCC7002 為原料，通過(guò)高壓均質(zhì)得到純度為0.6950±0.0043 的藻藍(lán)蛋白，得率為10.5081%±0.0936%；通過(guò)殼聚糖絮凝和硫酸銨鹽析藻藍(lán)蛋白純度可提高到1.9084±0.2621，接近于工業(yè)級(jí)（A620/A280≥2.0）。本研究中藻藍(lán)蛋白的提取純化可為聚球藻藻藍(lán)蛋白的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)，促進(jìn)對(duì)微藻資源的開(kāi)發(fā)。

進(jìn)一步地，本研究對(duì)聚球藻藻藍(lán)蛋白在熱處理過(guò)程中的褪色機(jī)理進(jìn)行研究。從60 ℃起，熱處理引起的脫輔基蛋白有序空間結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致依托于蛋白骨架的藻藍(lán)膽素天然構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變、藻藍(lán)蛋白紫外吸收和特征熒光明顯下降，溶液中具備呈色活性的藻藍(lán)蛋白分子因此大幅減少，藻藍(lán)蛋白溶液的藍(lán)色色澤大幅消褪；粒徑分析結(jié)果進(jìn)一步表明，藻藍(lán)蛋白分子在60 ℃下開(kāi)始聚集，80 ℃下更大程度的聚集可能使蛋白聚集體將四吡咯發(fā)色團(tuán)包埋于其內(nèi)，藻藍(lán)蛋白色澤消褪的程度加深。另外，F(xiàn)TIR 光譜和SDSPAGE 揭示，熱處理對(duì)藻藍(lán)蛋白分子中β亞基的破壞程度遠(yuǎn)高于α亞基，且主要破壞的是藻藍(lán)蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋。因此，保持藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定或者至少保持藻藍(lán)膽素發(fā)色團(tuán)依托蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，是保證藻藍(lán)蛋白在熱處理過(guò)程中保持穩(wěn)定藍(lán)色色澤的關(guān)鍵因素所在。本研究對(duì)藻藍(lán)蛋白護(hù)色措施的研究、藻藍(lán)蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，然而本研究對(duì)于熱處理過(guò)程中藻藍(lán)蛋白三聚體-單體水平的變化以及這種變化是否是藻藍(lán)蛋白褪色的主要原因之一仍存在疑問(wèn)，需要后續(xù)進(jìn)一步的探討。