青正龍，劉學銘，唐道邦，林耀盛，王旭蘋，楊懷谷，鄒金浩，程鏡蓉

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）

肉制品的風味是影響消費者購買意向最為重要因素之一[1]。影響肉制品風味的因素眾多[2]，如蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的氧化降解、微生物的內(nèi)源酶的作用等。就蛋白質(zhì)而言，除了能通過自身的降解產(chǎn)生游離氨基酸、5'-核苷酸等風味物質(zhì)或參與美拉德反應外，它還可以通過對風味化合物進行吸附而改變?nèi)庵破返娘L味[3]。在風味化合物的吸附過程中，蛋白質(zhì)與風味化合物之間的結(jié)合（主要包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合）通常被認為是影響食品風味的重要途徑，近年來受到廣泛關(guān)注[4-6]。

食用菌由于其豐富的鮮味物質(zhì)和營養(yǎng)價值，其在肉制品行業(yè)中的應用近年來受到廣泛的關(guān)注[7-9]。草菇是一種熱帶亞熱帶食用真菌，在東南亞地區(qū)深受消費者的喜愛[10]。當前，草菇在肉制品中的應用研究主要集中在分析草菇對產(chǎn)品風味品質(zhì)的變化[11-12]，而對風味變化的機理研究得較有限。課題組前期研究表明，草菇加入肉糜后肉制品的風味物質(zhì)可以得到提升[13]，但草菇與肉糜蛋白間的相互作用對肉糜蛋白風味吸附能力的影響規(guī)律及其潛在機理尚不明確。利用化學試劑（尿素、鹽酸胍、硫酸鈉等）破壞蛋白分子間的作用力是用來探究蛋白質(zhì)對風味物質(zhì)吸附過程的分子機理的常用方法[4-6]。鑒于此，本文嘗試以草菇提取液和牛肉肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein；MP）為研究對象，選取了六種在草菇和牛肉中具代表性的風味化合物（辛醛、苯甲醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-檸檬烯[12]），使用尿素、鹽酸胍、β-巰基乙醇和丙二醇四種蛋白分子作用力破壞劑對樣品進行處理，以明確牛肉MP 在風味吸附過程中的主要作用力，并嘗試解析草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響規(guī)律及機理，以期為草菇提取液在肉制品風味品質(zhì)改良方面的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇（Volvariella volvacea）、牛肉（牛外脊肉）廣州市澳之星超市；辛醛、苯甲醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇、D-檸檬烯、尿素、鹽酸胍、丙二醇、β-巰基乙醇等 均為色譜純，中國國藥集團有限公司。

T25D 均質(zhì)機 德國IKA 集團；TGL-16M 冷凍高速離心機 湖南湘儀儀器有限公司；57328-U 固相萃取裝置 美國Supelco 公司；6890N/5975B GCMS 氣相色譜聯(lián)用儀 美國Aglient 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 草菇提取液制備 新鮮草菇于37 ℃恒溫烘干至恒重后粉碎，使用20 目聚乙烯篩子過篩，過篩后草菇干粉于4 ℃避光保存?zhèn)溆?。準確稱取0.3 g 草菇干粉加入9.7 g 0.5 mol/L 的磷酸緩沖液（PBS；pH7.4）漩渦混勻，室溫（25±2 ℃）振蕩30 min。8000 r/min 離心5 min，上清液使用中速濾紙過濾，濾液視為草菇提取液。

1.2.2 MP 提取 牛肉MP 的提取參照周昌瑜等[14]的方法，稍作改動。牛外脊肉剔除可見的脂肪和結(jié)締組織后，使用家用攪碎機將其破碎成肉糜。稱取25 g 肉糜加入100 mL 的僵直液（0.1 mol/L NaCl，23.1 mmol/L Na3PO4，4.3 mmol/L MgCl2，1.1 mmol/L EDTA-2Na；pH7），10000 r/min 均質(zhì)1 min 后4000 r/min離心5 min，保留沉淀。再次加入100 mL 僵直液，重復上述步驟三次，最后保留沉淀。沉淀中加入100 mL 0.1 mol/L 的NaCl 溶液，10000 r/min 均質(zhì)1 min 后4000 r/min 離心5 min，重復操作3～5 次，每次保留上清液。所得上清液經(jīng)兩層紗布過濾，收集所有濾液，調(diào)整濾液pH 至6 左右，靜置10 min（以出現(xiàn)絮狀沉淀為準），4000 r/min 離心5 min，收集膏狀殘留物，所得膏狀沉淀視為純化后的MP。所得MP 膏狀物置于100 mL 離心杯中均質(zhì)，混勻后保存于碎冰中備用，并于48 h 內(nèi)使用。

1.2.3 樣品制備 稱取1 g MP，加入4 mL 草菇提取液漩渦混勻后，在10000 r/min 下均質(zhì)30 s；隨后將樣品置于4 ℃冰箱靜置12 h 后，12000 r/min 離心20 min，保留沉淀，加入4 倍質(zhì)量的0.5 mol/L 的PBS 洗滌沉淀，再次離心（12000 r/min，20 min），重復洗滌3 次。對照組以PBS 代替草菇提取液。

為研究草菇處理后蛋白質(zhì)分子間作用力變化，將上述得到草菇處理組（MP+提取液）及對照組（MP+）各分為5 份，分別使用0.5 mol/L 的PBS、4 mol/L 的尿素、1 mol/L 的鹽酸胍、20%的丙二醇和0.15 mol/L的β-巰基乙醇將上述得到的MP 稀釋至5 mg/mL，草菇提取液處理批次樣品依次標記為MP+提取液、MP+提取液+尿素、MP+提取液+鹽酸胍、MP+提取液+丙二醇和MP+提取液+β-巰基乙醇，未經(jīng)草菇提取液處理的樣品依次標記為MP+、MP+尿素、MP+鹽酸胍、MP+丙二醇和MP+β-巰基乙醇。將上述樣品于4 ℃保存，用于后續(xù)實驗。MP 的濃度以牛血清白蛋白為標準品，采用雙縮脲法[15]測定。所有組別溶劑均為PBS（pH7.4）。

1.2.4 風味吸附能力測定

1.2.4.1 氣質(zhì)聯(lián)用樣品制備 辛醛、苯甲醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3 醇和檸檬烯分別使用少量甲醇溶解，再使用蒸餾水將各風味成分分別稀釋至目標濃度。其中，苯甲醛濃度為50 mg/kg，苯乙醛為2500 mg/kg，辛醛為250 mg/kg，2-庚酮為150 mg/kg，1-辛烯-3-醇為500 mg/kg，D-檸檬烯為2500 mg/kg。取5 mL 1.2.3 中制備的樣品置于20 mL 的頂空萃取瓶中，空白組為5 mL PBS，然后加入200 μL 上述濃度的風味化合物，漩渦震蕩10 s，4 ℃平衡10 h 后進行下一步實驗。

1.2.4.2 頂空固相微萃?。⊿olid phase headspace extraction；SPME）參照徐梓焓等[16]的方法，略作修改。將固相微萃取針插入頂空萃取瓶，伸出內(nèi)部萃取探頭（75 μm（CAR/PDMS））對游離的風味化合物進行萃取，萃取溫度35 ℃，萃取時間30 min。隨后，將萃取纖維針插入進樣口（220 ℃）脫附5 min，不分流進樣。

1.2.4.3 固相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）條件 參照蔣平香等[17]的方法，略作修改。升溫程序：38 ℃條件下保持4 min，然后以5 ℃/min 的速度升溫至130 ℃，再以15 ℃/min 的速度升至180 ℃。進樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣；流速：1 mL/min。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；掃描范圍：29～400 m/z；色譜柱：DB624（30 m×0.25 mm×1.4 μm）。GC-MS 得到的峰譜圖通過MassHunter譜庫進行定性，正、反匹配度大于80（最大值為100）為有效結(jié)果。游離風味化合物的比例計算公式如下所示：

式中：AC為空白組中的自由風味化合物的峰面積；AS為各實驗組中的自由風味化合物的峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)的處理和作圖軟件分別為Excel 2010和Origin 9.0，使用軟件SPSS 22 對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析（P＜0.05）。進行3 次獨立實驗，每組實驗設定3 個平行，結(jié)果表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果及分析

2.1 尿素處理下草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響

尿素是一種常用的蛋白質(zhì)變性劑，它可以通過破壞疏水相互作用和氫鍵使蛋白質(zhì)變性[18]。從圖1可以看出，相較于MP+體系，MP+尿素體系中游離的辛醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-檸檬烯顯著增加（P＜0.05）。特別地，MP+體系中游離的辛醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-檸檬烯百分比分別為24%、84.97%、82%和76.63%。而MP+尿素體系中游離的辛醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-檸檬烯百分比分別提高到179.71%、129.46%、107.16%和142.87%。即尿素處理后的MP 對辛醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-檸檬烯的結(jié)合由原來的吸附作用（游離的風味化合物百分比小于100%）轉(zhuǎn)變?yōu)獒尫抛饔茫ㄓ坞x的風味化合物百分比大于100%），這表明MP 對以上風味化合物成分吸附主要取決于疏水相互作用和氫鍵作用。Kun 等[6]研究植物蛋白與風味化合物的結(jié)合時也發(fā)現(xiàn)，醛類與蛋白質(zhì)的氨基（-NH2）和巰基（-SH）可以通過疏水相互作用結(jié)合。酮和醇與蛋白質(zhì)之間容易發(fā)生疏水相互作用[19]，因此MP 在疏水作用力減弱后對2-庚酮和1-辛烯-3-醇吸附能力的下降。D-檸檬烯作為極性分子，在體系中游離百分比的降低可能是基于同樣的原因。另一方面，MP 的非共價鍵被破壞雖然并未導致MP 對苯乙醛的吸附行為轉(zhuǎn)變?yōu)獒尫判袨?，但MP 對苯乙醛的吸附能力顯著下降（P＜0.05），這表明非共價鍵在維持苯乙醛和MP 的結(jié)合中發(fā)揮了重要作用。

圖1 尿素處理下草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響Fig.1 Effects of VV on MP flavor adsorption capacity under urea

草菇提取液處理前后MP 對風味化合物的吸附有顯著變化。如圖1 所示，MP+和MP+提取液體系中游離辛醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇和D-檸檬烯濃度的差異并不顯著，這可能是因為MP 對這幾種風味化合物的吸附已飽和[20]。尿素處理后，MP 對辛醛、2-庚酮、D-檸檬烯均表現(xiàn)為釋放行為，但MP+提取液+尿素體系中MP 對辛醛、2-庚酮、D-檸檬烯的釋放作用較對照組（MP+尿素）明顯減弱。具體來看，三者吸附能力由179.71%、129.46%和142.87%分別下降至109.64%、104.65%和102.81%，說明草菇提取液有效緩解了尿素對MP 中疏水相互作用力或氫鍵的破壞。這表明草菇提取液可能通過增強MP 疏水相互作用力或氫鍵來影響MP 對辛醛、苯乙醛、2-庚酮和D-檸檬烯的吸附。

2.2 鹽酸胍處理下草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響

鹽酸胍（Guanidine hydrochloride，GuCl）作為一種蛋白變性劑可以削弱蛋白中的疏水相互作用力、氫鍵和離子鍵等非共價鍵[21]。如圖2，鹽酸胍處理后，樣品的游離的辛醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-檸檬烯百分比均較未處理組顯著增加，這與尿素處理后的變化趨勢一致，進一步證實了以上風味物質(zhì)與MP 的相互作用中非共價鍵（疏水相互作用力、氫鍵和離子鍵）的貢獻。非共價鍵被破壞后，游離苯乙醛的增加較其它幾種風味物質(zhì)更低，這可能是苯乙醛與MP 的結(jié)合除了非共價結(jié)合外還存在其他因素的影響。

圖2 鹽酸胍處理下草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響Fig.2 Effects of VV on MP flavor adsorption capacity under guanidine hydrochloride

在MP+提取液體系中，游離的2-庚酮和1-辛烯-3-醇分別為76%和75.5%，低于MP+體系中的82.41%和81.6%，這表明草菇提取液促進了MP 對2-庚酮和1-辛烯-3-醇的吸附。這一趨勢與尿素溶劑體系相一致。值得注意的是，鹽酸胍處理下，草菇提取液對MP 吸附風味物質(zhì)（辛醛、苯甲醛、苯乙醛和D-檸檬烯）的能力并未表現(xiàn)出顯著影響，而對2-庚酮和1-辛烯-3-醇的吸附能力（119.12%和117.61%）較MP+鹽酸胍組（107.25%和92.4%）有所提高，這一趨勢則與含有尿素的體系相反。與本研究結(jié)果相似地，汪娟[22]在研究中發(fā)現(xiàn)鹽酸胍處理后的大豆蛋白對1-辛烯-3-醇的吸附能力同樣有所下降。一般地，鹽酸胍與尿素的主要區(qū)別是鹽酸胍可以破壞蛋白質(zhì)中的非共價鍵，包括疏水互作用力、氫鍵和離子鍵，而尿素則主要破壞蛋白中的疏水相互作用力或氫鍵[22]。因此這一趨勢的變化可能是由離子鍵被破壞引起的，即MP 對2-庚酮和1-辛烯-3-醇的吸附能力中，離子鍵也起了部分作用。另一方面，帶有胍陽離子的鹽酸胍可以通過氫鍵附著于蛋白上[23-24]，使MP 表面負電荷強度降低，導致MP 對2-庚酮和1-辛烯-3-醇吸附能力的下降。

2.3 丙二醇處理下草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響

丙二醇（Propylene glycol，PG）作為一種有機試劑可以削弱蛋白間的疏水相互作用力，但與尿素和鹽酸胍不同的是，它還可以增強氫鍵和離子鍵[21]。因此，它可以作為一種有效檢測蛋白質(zhì)和風味化合物之間氫鍵、離子鍵以及疏水相互作用的試劑[25]。與含有尿素和鹽酸胍溶劑體系相比，丙二醛處理后，樣品中游離辛醛、苯乙醛、1-辛烯-3 醇的百分比顯著降低。這表明，除了疏水相互作用外，氫鍵和離子鍵也參與了MP 和風味化合物的相互作用。與MP+和MP+提取液體系相比，丙二醛處理后樣品中游離的辛醛、苯乙醛、2-庚酮和D-檸檬烯百分比都有不同程度的增加，這可能是因為MP 與以上風味物質(zhì)的相互作用過程中，疏水相互作用力相較氫鍵和離子鍵貢獻更大[26]。特別地，MP+丙二醇體系中游離的1-辛烯-3 醇百分比（71.43%）低于MP+體系（82%），這可能是1-辛烯-3 醇中極性的羥基可以通過氫鍵和離子鍵與蛋白質(zhì)相結(jié)合導致的。蘆曦[27]在研究大豆分離蛋白和檸檬風味化合物過程中認為醇類化合物與蛋白的結(jié)合過程中，氫鍵和離子鍵發(fā)揮主要作用。如圖3所示，在含有丙二醇的體系中，MP 對2-庚酮的吸附行為轉(zhuǎn)變?yōu)榱酸尫判袨?，這表明2-庚酮與MP 的結(jié)合中疏水相互作用力的貢獻要大于氫鍵或離子鍵的作用，這與Damodaran 等[19]的結(jié)論相一致。

圖3 丙二醇處理下草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響Fig.3 Effects of VV on MP flavor adsorption capacity under propylene glycol

草菇提取液處理前后MP 對風味物質(zhì)吸附能力的區(qū)別如圖3。比較MP+和MP+提取液體系，草菇提取液處理前后MP 對辛醛吸附無顯著變化（P＞0.05）。但在MP+提取液+丙二醇中游離的辛醛百分比為52.94%，顯著低于MP+丙二醇的57.86%（P＜0.05），這可能是因為草菇提取液改變了MP 的疏水作用力。與之相反地，在2-庚酮的吸附過程中，MP+提取液中游離的2-庚醛百分比為75.26%，顯著低于MP+中的84.97%（P＜0.05）。而MP+提取液+丙二醇中游離的2-庚醛百分比為154.15%卻顯著高于MP+丙二醇（127.31%）（P＜0.05）。這可能是草菇提取液破壞了MP 的氫鍵和離子鍵，從而使MP 對辛醛和2-庚酮的吸附能力產(chǎn)生影響。

2.4 β-巰基乙醇處理下草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響

β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）作為一種常用的還原劑，常用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原[28]。如圖4 是以0.15 mol/Lβ-ME 處理的體系中不同游離的風味化合物百分比。除苯甲醛外，β-ME 處理后樣品游離的風味化合物百分比較對照組（MP 和MP+提取液組）顯著提高（P＜0.05）。對于辛醛、苯甲醛、苯乙醛和2-庚酮，除了非共價結(jié)合外，它們的羰基基團還可與蛋白質(zhì)的氨基（-NH2）和巰基（-SH）發(fā)生共價結(jié)合[6,29]。因此MP+β-ME 體系中游離的辛醛、苯甲醛、苯乙醛和2-庚酮的百分比顯著（P＜0.05）高于MP+體系，這說明β-ME 破壞了這些風味物質(zhì)與MP 的共價結(jié)合。樓宵瑋等[30]在研究氯化鈉對MP 和風味物質(zhì)相互影響中，認為蛋白結(jié)構(gòu)的變化會削弱MP 與醛酮類化合物結(jié)合形成席夫堿的能力，從而使MP 對風味化合物的吸附能力減弱，游離的風味化合物增多。對于1-辛烯-3 醇和D-檸檬烯，β-ME 可以通過還原MP 中的二硫鍵使MP 三級和四級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[31]。因此在含有β-ME 的體系中，MP 對1-辛烯-3 醇和D-檸檬烯吸附能力的下降（游離的1-辛烯-3 醇和D-檸檬烯百分比上升）可能是MP 的結(jié)構(gòu)改變引起的。

圖4 β-巰基乙醇處理下草菇提取液對MP 風味吸附能力的影響Fig.4 Effects of VV on MP flavor adsorption capacity under β-mercaptoethanol

草菇提取液處理前后的MP 對風味化合物吸附能力的改變主要體現(xiàn)在辛醛、苯甲醛和苯乙醛這三種醛類。如圖4，在未經(jīng)β-ME 處理的樣品中，除苯甲醛外，MP+和MP+提取液體系對醛類物質(zhì)的吸附能力并未表現(xiàn)出顯著區(qū)別（P＞0.05）。而在β-ME 處理后，MP+提取液+β-ME 體系中，游離的辛醛、苯甲醛和苯乙醛百分比分別為54%、55.25%和71.14%，顯著低于（P＜0.05）MP+β-ME（84.23%、202.73%和107.46%）。表明在β-ME 的存在下，草菇提取液促進了MP 對醛類的吸附。這可能是因為草菇中的內(nèi)源酶誘發(fā)了MP 分子內(nèi)更多二硫鍵的形成[12]。而β-ME 的加入將二硫鍵還原為巰基，這一方面直接為醛類物質(zhì)增加了結(jié)合位點，另一方面二硫鍵的破壞使蛋白結(jié)構(gòu)展開，暴露了其它非共價結(jié)合和共價結(jié)合位點，從而使MP 對辛醛、苯甲醛和苯乙醛的吸附增加。以上結(jié)果表明，草菇提取液可能通過改變MP共價結(jié)合位點數(shù)和結(jié)構(gòu)，從而影響MP 對醛類物質(zhì)的吸附能力。

3 結(jié)論

本研究利用尿素、鹽酸胍、丙二醇和β-巰基乙醇對草菇提取液處理后的MP 間作用力進行破壞，探究草菇提取液處理前后的MP 風味吸附能力及蛋白間作用力的變化。研究發(fā)現(xiàn)，選取的6 種風味物質(zhì)與MP 的作用中，疏水相互作用力起到了關(guān)鍵的作用，其次是氫鍵、共價結(jié)合和離子相互作用。而草菇提取液可以通過增強MP 非共價鍵從而提高MP 對2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-檸檬烯的吸附能力，同時還可以通過對MP 共價鍵的影響，使MP 對苯甲醛的作用由釋放轉(zhuǎn)變?yōu)槲健１狙芯繃L試從MP 的作用力變化解析草菇對MP 風味吸附能力的影響，其研究結(jié)果有助于闡明草菇改善肉制品風味的作用機理，為草菇在風味肉制品開發(fā)中的應用提供理論依據(jù)。