陳世偉，唐淑賢，王舸楠，吳程遠(yuǎn)，張淑慧，趙廷彬，殷海松，鄭志強(qiáng)，喬長(zhǎng)晟,,5,6,

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457；3.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300457；4.軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究所軍需工程技術(shù)研究所，北京 101300；5.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；6.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

普魯蘭多糖又叫普魯蘭糖，短梗霉多糖或茁霉多糖，主要由出芽短梗霉所分泌的一種線性胞外多糖。普魯蘭多糖通過麥芽三糖重復(fù)單元經(jīng)α-1,6 糖苷鍵聚合而成，因此又被叫做聚麥芽三糖[1-2]。普魯蘭多糖是一種水溶性多糖，分子質(zhì)量在4.5×104～6×105Da[3]。普魯蘭多糖獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)使其在食品、化妝品、制藥和生物醫(yī)藥行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。Mert 等[4]將普魯蘭多糖與丙烯酸-衣康酸共價(jià)制備成水凝膠用于傷口敷料。普魯蘭多糖能夠形成透明、耐油和不滲透氧氣的薄膜用于食品包裝[5]。作為淀粉的替代品用于加工食品和口腔護(hù)理產(chǎn)品中[6]。除了其優(yōu)良的風(fēng)味保持性能外，其在運(yùn)輸和傳遞生物活性化合物方面的性質(zhì)使其成為生物醫(yī)學(xué)和制藥應(yīng)用的理想選擇材料[7]。普魯蘭多糖因其極高的商業(yè)價(jià)值在科研領(lǐng)域中始終保持著空前的熱度。因此，對(duì)普魯蘭多糖生物合成代謝機(jī)理的研究，以提高其產(chǎn)量具有重要的意義。

堿基和核苷是一類化合物，在編碼遺傳信息、信號(hào)傳遞和能量代謝等重要生理功能中起著重要作用[8]。尿嘧啶作為一種核苷酸類生長(zhǎng)因子可以調(diào)控微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)。West 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加尿嘧啶可以增加農(nóng)桿菌的凝乳菌產(chǎn)量。Lee 等[10]在培養(yǎng)基中添加尿嘧啶可提高猴頭菌胞外多糖的產(chǎn)生。Saleh 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加尿嘧啶，可促進(jìn)魚類的生長(zhǎng)。Sheng 等[12]研究了尿嘧啶對(duì)普魯蘭產(chǎn)量、生物量和尿苷磷酸化酶（UPase）活性的影響。但是關(guān)于尿嘧啶對(duì)出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖代謝機(jī)理的研究，目前尚未報(bào)道。

本文通過對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子尿嘧啶，研究其對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響。并通過Label-free 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)添加尿嘧啶對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵后期（88 h）的出芽短梗霉胞內(nèi)蛋白質(zhì)的差異進(jìn)行了生物學(xué)分析，為了解尿嘧啶對(duì)出芽短梗霉合成普魯蘭多糖的代謝機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)：CGMCCNO.7055；蔗糖 廣西田東縣制糖有限公司；酵母浸粉 維科特化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；硫酸銨、硫酸亞鐵 天津博迪化工股份有限公司；磷酸氫二鉀 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；硫酸鎂淄博川北化工有限公司；氯化鈉 維科特化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；所有試劑 均為國產(chǎn)分析純；種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖100，酵母浸粉3，（NH4）2SO41，K2HPO42，MgSO40.4，NaCl 2.5，F(xiàn)eSO40.05，用6.0 mol/L HCl 及6.0 mol/L NaOH 溶液 調(diào)節(jié)pH 至6.0，然后于121 ℃下滅菌20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖150，蛋白胨5，MgSO40.4，NaCl 3，K2HPO47，F(xiàn)eSO40.05，用6.0 mol/L HCl 及6.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.0，然后于121 ℃下滅菌20 min。其中實(shí)驗(yàn)組為在發(fā)酵48 h 時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5 g/L的尿嘧啶。

SBA-40E 生物傳感器 山東省科學(xué)院生物研究所；5 L 自動(dòng)發(fā)酵罐08-F25 型 鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；TDL-5-A 型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；5977B-7890B 氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀 德國安捷倫科技有限公司；LC-20A 高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將4 ℃冰箱中保存待用的斜面取出，放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行活化，時(shí)間為2～3 h。然后從活化好的斜面中挑一環(huán)孢子快速接到種子培養(yǎng)基中，最后放置在搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為180 r/min，28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為28～32 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 搖床發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液，以3%（v/v）的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，本文采用兩階段控溫培養(yǎng)，發(fā)酵前24 h 為32 ℃，發(fā)酵后64 h 溫度調(diào)為28 ℃，轉(zhuǎn)速為400 r/min，培養(yǎng)周期為88 h。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量為3 L，接種量為3%（v/v）即900 mL 種子液，初始pH 調(diào)至6.0，通風(fēng)比為1:1.25 vvm，罐壓為0.02 MPa，轉(zhuǎn)速為400 r/min，本文采用兩階段控溫培養(yǎng)，發(fā)酵前24 h 為32 ℃，發(fā)酵后64 h 溫度調(diào)為28 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)周期為88 h。

尿嘧啶最適添加量的優(yōu)化方法：初始添加量分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，按照搖床發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

尿嘧啶最適添加時(shí)間的優(yōu)化方法：空白組為不添加尿嘧啶，實(shí)驗(yàn)組添加時(shí)間分別為0、24、48、72 h，按照搖床發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 分析方法 殘?zhí)堑臏y(cè)定：參照文獻(xiàn)[13]試驗(yàn)方法，將發(fā)酵液離心，取上清液1 mL 稀釋100 倍定容，用生物傳感器測(cè)定含量。

產(chǎn)量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[14]試驗(yàn)方法，取上述上清液30 mL 加入60 mL 無水乙醇，攪拌均勻放置1 h 后抽濾，所得多糖放在60 ℃烘箱中烘干至恒重并稱重，按照式（1）計(jì)算得出普魯蘭多糖的產(chǎn)量。

式中：m 表示普魯蘭多糖產(chǎn)量，g/L；m1表示干燥濾紙的重量，g；m2表示普魯蘭多糖與干燥濾紙的總量，g。

菌體量的測(cè)定：將5 mL 發(fā)酵液于10 mL 離心管中離心，去上清置于60 ℃烘箱中，烘干至恒重稱重，按照式（2）計(jì)算得出菌體量。

式中：m 表示出芽短梗霉菌體量，g/L；m1表示離心管干重，g；m2表示出芽短梗霉菌體量與離心管總重，g。

1.2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1.2.4.1 樣品的制備與提取 取適量培養(yǎng)至88 h 的發(fā)酵液于5 mL 離心管中，于4 ℃，5000 ×g 下冷凍離心15 min，將上清液去除掉留菌體，使用PBS 溶液對(duì)菌體進(jìn)行洗滌，重復(fù)三次，最后將菌體用液氮進(jìn)行速凍，保存至-80 ℃下備用。本文采用SDT 裂解法[15]。向樣品中加入一定量的SDT 裂解液進(jìn)行超聲，超聲條件設(shè)置為：80 W，工作10 s 間歇15 s 重復(fù)此過程10 次，之后進(jìn)行沸水浴，時(shí)間為15 min。然后將樣品于14000 ×g 下離心40 min 取上清。本文對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量使用的是BCA 法。最后樣品分裝好后，于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 酶解脫鹽及質(zhì)譜分析 參照Zhou 等[16]的方法。酶解后使用C18 Cartridge 對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，然后將肽段凍干后加40 μL 0.1%的甲酸溶液進(jìn)行復(fù)溶，肽段定量。質(zhì)譜分析使用納升流速的HPLC 液相系統(tǒng)Easy nLC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3 組平行樣品計(jì)算結(jié)果的平均值。Origin 2020 軟件作圖。GO 和KEGG 的注釋用Uniprot的Yeast 注釋數(shù)據(jù)完成。使用MaxQuant 軟件（版本號(hào)1.5.3.17）[17]對(duì)質(zhì)譜分析出來的原始數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)鑒定，然后進(jìn)行定量分析。相關(guān)的數(shù)據(jù)參數(shù)和說明如表1 所示。

表1 搜庫參數(shù)Table 1 Parameters of searching

2 結(jié)果與分析

2.1 尿嘧啶對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響

2.1.1 尿嘧啶最佳添加量 在搖瓶發(fā)酵條件下，不同的尿嘧啶添加量對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞生長(zhǎng)和普魯蘭合成的影響結(jié)果如圖1 所示。添加不同濃度的尿嘧啶，對(duì)普魯蘭多糖的產(chǎn)量和菌體量均有一定的促進(jìn)作用。特別是，添加0.5 g/L 的尿嘧啶對(duì)普魯蘭多糖的產(chǎn)量提高最高，由66.13 g/L 提高到73.47 g/L，相比對(duì)照提高了11%，同時(shí)，菌體量從11.68 g/L 提升到12.89 g/L，相比空白組提高10%。這可能是因?yàn)槟蜞奏さ募尤?，影響了普魯蘭合成途徑中某些關(guān)鍵酶的活性，刺激了糖酵解等代謝途徑，有利于合成普魯蘭和菌體的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中尿嘧啶的存在有利于普魯蘭多糖產(chǎn)量的提高，這與Sheng 等[12]的研究結(jié)果一致，且其濃度為0.5 g/L 時(shí)，有最大的促進(jìn)作用。

圖1 不同濃度梯度尿嘧啶對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different concentration gradients of uracil on the fermentation of pululan

2.1.2 尿嘧啶最佳添加時(shí)間 圖2 顯示了不同時(shí)間添加尿嘧啶對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響。由圖2 分析可知，尿嘧啶在不同時(shí)間添加對(duì)普魯蘭多糖的產(chǎn)量具有明顯的差異。從圖2 中可以看出，在48 h 添加0.5 g/L 的尿嘧啶對(duì)普魯蘭多糖的產(chǎn)量提高最高，由65.6 g/L 提高到79.5 g/L，相比對(duì)照提高了21%。尿嘧啶的添加時(shí)間為48 h 對(duì)普魯蘭多糖的產(chǎn)量有最大的促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)樘砑幽蜞奏ず鬄槌鲅慷坦Ｃ购铣善蒸斕m多糖提供了更多的UDPG 前體物。在出芽短梗霉生長(zhǎng)的中后期階段可以大量合成普魯蘭多糖這一次級(jí)代謝產(chǎn)物，然而在中后期階段UDPG 的含量最少，此時(shí)添加尿嘧啶為出芽短梗霉合成普魯蘭多糖提供了更多的前體物質(zhì)。

圖2 不同時(shí)間添加尿嘧啶對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of uracil addition at different time on pullulan fermentation

2.1.3 尿嘧啶對(duì)普魯蘭多糖合成影響的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)上述實(shí)驗(yàn)得出在發(fā)酵48 h 時(shí)添加0.5 g/L 的尿嘧啶對(duì)出芽短梗霉合成普魯蘭多糖的效果最佳，從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面來研究尿嘧啶對(duì)合成普魯蘭多糖的影響。根據(jù)圖3 可以看出，在發(fā)酵前48 h 內(nèi)，空白組與實(shí)驗(yàn)組的菌體量、產(chǎn)量等指標(biāo)并無明顯變化。在48 h加入尿嘧啶后，實(shí)驗(yàn)組普魯蘭多糖產(chǎn)量為86.27 g/L，較空白組的70.13 g/L 提高了23%，然而，實(shí)驗(yàn)組的菌體量小于對(duì)照組，這表明普魯蘭多糖的產(chǎn)量與出芽短梗霉菌體量并無直接關(guān)系，這與Sheng 等[12]的研究結(jié)果一致。為了解尿嘧啶對(duì)出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖內(nèi)在機(jī)理的影響，下面從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度進(jìn)行分析。

圖3 尿嘧啶對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of uracil on the fermentation of pullulan polysaccharide

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.2.1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的定量及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 以變化倍數(shù)大于2.0 倍（上調(diào)大于2 倍或者下調(diào)小于0.5）且Pvalue 小于0.05 的篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)組與空白組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目如表所示。

由表2 可以看出，空白組和實(shí)驗(yàn)組中共篩選出80 個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白有40 個(gè)，下調(diào)蛋白有40 個(gè)。

表2 差異蛋白結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Differential protein results statistics

2.2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的聚類分析結(jié)果 采用層次聚類算法（Hierarchical Cluster）對(duì)差異性表達(dá)蛋白進(jìn)行聚類分析，數(shù)據(jù)用圖4 表示。紅色代表顯著性上調(diào)蛋白，藍(lán)色代表顯著性下調(diào)蛋白，顏色越深差異越明顯。在閾值條件下選擇倍數(shù)變化大于2 的差異蛋白進(jìn)行分析。參與主要代謝途徑的部分差異蛋白如表3 所示，其中表達(dá)量上調(diào)的蛋白質(zhì)包括己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-2 和異檸檬酸裂解酶，表達(dá)量下調(diào)的蛋白質(zhì)包括蘋果酸酶。

表3 差異蛋白結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Differential proteins statistics

圖4 空白組和實(shí)驗(yàn)組差異蛋白質(zhì)聚類分析Fig.4 Differential protein cluster analysis of blank and experimental groups

2.2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的基本本體功能富集分析結(jié)果 基因本體（Gene Ontology，簡(jiǎn)稱GO）作為生物信息領(lǐng)域中一個(gè)極為重要的方法和工具，能夠從更加概括或者系統(tǒng)的方面對(duì)研究的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行更加深入的分析。GO 分析分為三個(gè)方面，分別為生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組和空白組差異蛋白的GO 功能富集分析，得到的結(jié)果如圖5 所示。

由圖5 可以看出，差異蛋白質(zhì)參與了磷脂生物合成過程、甘油磷脂生物合成過程、甘油脂生物合成過程等重要生物學(xué)過程。差異蛋白質(zhì)在分子功能上的體現(xiàn)在磷脂酰絲氨酸脫羧酶活性、碳-碳裂解酶活性、羧基裂解酶活性、含氧酸裂解酶活性、碳水化合物激酶活性。同時(shí)，在紡錘體、微管組織中心、細(xì)胞內(nèi)囊泡等定位蛋白質(zhì)，發(fā)生了顯著變化。

圖5 差異蛋白GO 功能富集分析（Top 20）Fig.5 GO functional enrichment analysis of differential proteins (Top 20)

2.2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的代謝通路分析結(jié)果 通過對(duì)本文所鑒定到的差異性蛋白進(jìn)行KEGG 功能注釋分析，所得到的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6 所示。

通過對(duì)鑒定出來的差異蛋白進(jìn)行KEGG 功能注釋，將其按照所屬的不同代謝途徑進(jìn)行功能分類。并對(duì)不同途徑中富集到的蛋白數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，按照蛋白統(tǒng)計(jì)數(shù)目排列出前20 的代謝通路，統(tǒng)計(jì)注釋結(jié)果如圖6 所示。本文所研究的差異蛋白主要涉及的KEGG 途徑包括：核糖體、甘油磷脂代謝、氧化磷酸化、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、糖酵解、嘧啶代謝、果糖和甘露糖代謝和丙酸代謝。由此可見，上述代謝途徑均可能與普魯蘭多糖產(chǎn)量的變化有關(guān)。

圖6 差異蛋白KEGG 通路注釋Fig.6 Differential protein KEGG pathway annotations

2.2.5 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的代謝途徑分析結(jié)果 隨著質(zhì)譜技術(shù)的革新，極大增強(qiáng)了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)測(cè)量的精度和可靠性[18]。蛋白質(zhì)組學(xué)方法也是揭示細(xì)胞和生物體在系統(tǒng)水平上的生物學(xué)功能、代謝網(wǎng)絡(luò)和功能性蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的有效工具[19]。以此，根據(jù)篩選出的差異蛋白質(zhì)，結(jié)合代謝通路分析結(jié)果，繪制了尿嘧啶引起的差異蛋白對(duì)出芽短梗霉代謝途徑的影響圖，如圖7 所示。

圖7 尿嘧啶引起的差異蛋白對(duì)出芽短梗霉代謝途徑的影響Fig.7 Effect of differential protein induced by uracil on metabolic pathway of Aureobasidium pullulans

由表3 可以看出表達(dá)量上調(diào)的蛋白質(zhì)包括己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-2 和異檸檬酸裂解酶，表達(dá)量下調(diào)的蛋白質(zhì)包括蘋果酸酶。這些蛋白涉及到出芽短梗霉細(xì)胞胞內(nèi)的糖酵解、果糖和甘露糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、丙酮酸代謝和TCA 循環(huán)等代謝途徑。

己糖激酶被定義為磷酸化葡萄糖和其他緊密相關(guān)的己糖（甘糖、2-脫氧葡萄糖、葡萄糖胺和果糖）的第六碳上的酶，是參與磷酸化己糖的關(guān)鍵酶[20]。在糖酵解、果糖和甘露糖代謝途徑中己糖激酶可以催化D-葡萄糖形成D-6 磷酸葡萄糖、D-甘露糖形成D-6 磷酸甘露糖。D-6-磷酸葡萄糖可以轉(zhuǎn)化為D-1-磷酸葡萄糖，D-1-磷酸葡萄糖再轉(zhuǎn)化為UDPG，其為普魯蘭糖合成的前體物質(zhì)[21]。而D-6 磷酸甘露糖可以進(jìn)一步異構(gòu)化形成β-D-6 磷酸果糖，后者進(jìn)入糖酵解反應(yīng)中。因此，己糖激酶的表達(dá)量上調(diào)，一方面導(dǎo)致了UDPG 水平上漲，另一方面促進(jìn)了糖酵解反應(yīng)的進(jìn)行，從而提高普魯蘭多糖合成。

6-磷酸果糖激酶-2 在糖酵解代謝中可以催化D-6 磷酸果糖形成2,6-二磷酸果糖。而2,6-二磷酸果糖是6-磷酸果糖激酶-1 的最強(qiáng)激活劑同時(shí)也是糖異生途徑1,6-二磷酸果糖酶的抑制劑，其也是丙酮酸激酶的激活劑。6-磷酸果糖激酶-1 作為糖酵解途徑中的限速酶，因?yàn)?,6-二磷酸果糖的增多可以降低ATP、檸檬酸對(duì)其的抑制作用，從而促使6-磷酸果糖激酶-1 的活性增強(qiáng)。因此，6-磷酸果糖激酶-2 的表達(dá)量上調(diào)，使6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶的活性增強(qiáng)，1,6-二磷酸果糖酶的活性下降，這種三重調(diào)節(jié)作用的結(jié)合，解除了糖酵解反應(yīng)的速率限制，從而提高糖原的利用效率。

異檸檬酸裂解酶在醛酸和二羧酸代謝過程中可以促進(jìn)異檸檬酸分解成琥珀酸。琥珀酸在TCA 循環(huán)中是一種必不可少的物質(zhì)，而琥珀酸含量的增加有利于TCA 循環(huán)的進(jìn)行。TCA 循環(huán)是在線粒體中運(yùn)行的一種雙向通路，在大多數(shù)真核生物中已成為一個(gè)中心代謝中樞，是能量代謝的中心過程[22]。因此異檸檬酸裂解酶的表達(dá)量上調(diào)使TCA 循環(huán)更加高效的進(jìn)行。

蘋果酸酶在丙酮酸代謝過程中是催化蘋果酸生成丙酮酸的關(guān)鍵酶，蘋果酸酶的表達(dá)量下調(diào)，從而抑制了蘋果酸生成丙酮酸。Xue 等[23]研究了過表達(dá)蘋果酸-丙酮酸途徑可促進(jìn)脂肪酸的生物合成。而蘋果酸酶的表達(dá)量下降，積累的蘋果酸有助于TCA 循環(huán)的進(jìn)行，從而為出芽短梗霉菌體的生長(zhǎng)和普魯蘭多糖的合成提供了更多的能量。

3 結(jié)論

通過Label-free 技術(shù)研究了添加尿嘧啶對(duì)出芽短梗霉合成普魯蘭多糖過程中胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果表明共篩選出80 個(gè)差異性蛋白質(zhì)，其中包括40個(gè)上調(diào)蛋白和40 個(gè)下調(diào)蛋白。GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)兩組間的差異蛋白主要參與磷脂生物合成過程、甘油磷脂生物合成過程以及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程等。通過對(duì)本文所鑒定到的差異蛋白進(jìn)行KEGG 功能注釋分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要涉及的KEGG 途徑包括氧化磷酸化、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、糖酵解、果糖和甘露糖代謝和丙酸代謝等代謝途徑。結(jié)合出芽短梗霉合成普魯蘭多糖的代謝途徑分析兩組間的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)己糖激酶的表達(dá)量上調(diào)，增強(qiáng)了糖酵解和果糖和甘露糖相關(guān)代謝途徑，為出芽短梗霉合成普魯蘭多糖提供了更多的UDPG 前體物質(zhì)；6-磷酸果糖激酶-2 表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)了糖酵解反應(yīng)的高效進(jìn)行；異檸檬酸裂解酶的表達(dá)量上調(diào)促進(jìn)了乙醛酸和二羧酸代謝，蘋果酸酶的下調(diào)抑制了丙酮酸代謝，這兩個(gè)途徑可間接增強(qiáng)TCA 循環(huán)，從而為出芽短梗霉菌體的生長(zhǎng)和普魯蘭多糖的合成提供了更多的能量。研究結(jié)果有助于理解尿嘧啶在普魯蘭生物合成中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步提高普魯蘭的產(chǎn)量提供了新途徑。