敖琴，劉俊，胡歡，李培霆，秦龍燕，蒙富雪，李龍*** ，曾家順***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 第三附屬醫(yī)院，貴州 都勻 558000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、自身免疫性和多系統(tǒng)的炎癥性疾病[1]，病變主要侵犯四肢小關(guān)節(jié)，可促使滑膜增生、關(guān)節(jié)滑膜炎及骨與軟骨進(jìn)行性破壞[2]，其中炎癥的產(chǎn)生以及骨和軟骨的破壞與滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)腫瘤樣增殖相關(guān)，RA-FLS的異常增殖主要因?yàn)槠渚哂锌沟蛲龅奶匦訹3-5]。瑞香素(daphnetin，DAP)，又名祖師麻甲素，是一種香豆素類衍生物，具有抗炎、抗腫瘤及抗氧化等作用[6-8]。在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠中，DAP可減弱輔助性T細(xì)胞2(helper T cell，Th2)、輔助性T細(xì)胞17(helper T cell，Th17)型應(yīng)答，抑制白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)及白細(xì)胞介素12(interleukin 12，IL-12)的表達(dá)，從而起到抗炎作用[9-11]；DAP還可促進(jìn)促凋亡基因死亡受體3(death receptor 3，DR3)、細(xì)胞程序性死亡受體5(programmed cell death 5，PDCD5)、人凋亡相關(guān)因子配體(human factor-related apoptosis ligand，F(xiàn)asL)和人抑癌基因P53去甲基化，增加細(xì)胞凋亡[12-14]。目前，DAP在炎癥性疾病中研究相對(duì)較少，且作用機(jī)制還未明確。本研究基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，探討DAP對(duì)人RA-FLS增殖、凋亡的影響，旨在進(jìn)一步明確DAP作用機(jī)制，為將其應(yīng)用于臨床提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株 人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(人RA-FLS)，由貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室蒙富雪老師惠贈(zèng)，購(gòu)于北京北納生物(BNCC340356)。

1.1.2主要藥物和試劑 DAP(上海源葉，純度≥98%)和Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8，大連美倫)，胎牛血清和青霉素/鏈霉素(美國(guó)BI)，二甲基亞砜(中國(guó)索萊寶)，高糖Dulbeccos Modified EagleMedium(DMEM，美國(guó)Gibco)，兔多克隆抗體蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶抗體(protein kinase-like ER kinase，PERK)、兔多克隆ERS相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78抗體(glucose regulated protein 78，GRP78)、兔多克隆凋亡蛋白C/EBP同源蛋白抗體(C/EBPhomologous protein，CHOP)及兔多克隆含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12抗體(cysteinyl aspartate specific proteinase 12，Caspase12；武漢三鷹)，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma gene-2，BCL-2；中國(guó)華安生物)，凋亡試劑盒(美國(guó)BD)。

1.1.3主要儀器 倒置顯微鏡(日本Nikon)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)，曝光機(jī)(美國(guó)Bio-rad)，培養(yǎng)箱(美國(guó)Biobase)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman coulter)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%CO2，2 d換1次液，細(xì)胞長(zhǎng)滿90%左右進(jìn)行1∶3傳代。

1.2.2CCK-8檢查細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞，按100 mL/孔加入96孔板，每組種4個(gè)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，去掉培養(yǎng)基，用0(對(duì)照組)、10、20、30、40、50、60及70 mg/L DAP的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，24 h后加CCK-8增強(qiáng)劑10 μL、孵育2 h，于酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)460 nm處檢測(cè)吸光度(opticail density，OD)值，記錄結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%]，統(tǒng)計(jì)分析后以0、20、40及60 mg/L DAP為實(shí)驗(yàn)分組，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組相同。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，按1.2.2項(xiàng)下分組處理24 h，冷磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細(xì)胞2次，PE AnnexinV和7-AAD溶液避光染色15～30 min；流式細(xì)胞儀于30 min內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)用FlowJo V10軟件進(jìn)行分析。

1.2.4免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá) 提前在6孔板中放入細(xì)胞玻璃爬片，取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，0、20 mg/L DAP處理24 h；清洗、固定、通透、封閉，PERK、GRP78及Caspase12抗體稀釋液孵育過(guò)夜；次日清洗，熒光二抗避光孵育2 h，DAPI染色5 min，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，按1.2.2項(xiàng)下分組處理24 h；PBS清洗細(xì)胞，常規(guī)方法提取總蛋白，通過(guò)蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量；經(jīng)蛋白變性、電泳及轉(zhuǎn)膜后，于5%脫脂奶粉封閉1.5～2.0 h，用PERK、p-PERK、GRP78、CHOP、Caspase-12、Bcl-2及GAPADH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日清洗，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯(lián)的二抗處理2 h；顯色液將信號(hào)可視化，使用Image J進(jìn)行灰度值定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人RA-FLS增殖活性及濃度確定

經(jīng)0、10、20、30、40、50、60、70 mg/L DAP處理RA-FLS 24 h后，CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，與0 mg/L DAP組比較，細(xì)胞的存活率隨DAP濃度增加而受抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度超過(guò)60 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率<50%；0、20、40及60 mg/L DAP組細(xì)胞存活率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此0、20、40及60 mg/L DAP為后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組。見(jiàn)圖1。

注：(1)與0 mg/L DAP組比較，P<0.05；(2)與10 mg/L DAP組比較，P<0.05；(3)與20 mg/L DAP組比較，P<0.05；(4)與30 mg/L DAP組比較，P<0.05；(5)與40 mg/L DAP組比較，P<0.05；(6)與50 mg/L DAP組比較，P<0.05；(7)與60 mg/L DAP組比較，P<0.05。

2.2 人RA-FLSA凋亡

結(jié)果顯示與0 mg/L DAP組比較，在藥物處理培養(yǎng)24 h后，隨著DAP藥物濃度增加人 RA-FLS細(xì)胞凋率逐漸增大(P<0.05)，結(jié)果呈劑量依耐性改變。見(jiàn)圖2。

注：A～D分別為0、20、40及60 mg/L DAP組人RA-FLS細(xì)胞凋亡的流式圖，E為細(xì)胞凋亡率的定量結(jié)果；(1)與0 mg/L DAP組比較，P<0.05；(2)與20 mg/L DAP組比較，P<0.05；(3)與40 mg/L DAP組比較，P<0.05。

2.3 免疫熒光檢測(cè)人RA-FLS細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)

采用免疫熒光的方式初步觀察ERS相關(guān)蛋白在DAP處理細(xì)胞后的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，20 mg/L DAP組處理的人RA-FLS細(xì)胞中PERK、GRP78及Caspase-12熒光強(qiáng)度均高于0 mg/L DAP組。見(jiàn)圖3。

注：A、B、C分別為PERK、GRP78及Caspase-12的蛋白表達(dá)；藍(lán)色為細(xì)胞核顯色，綠色為目的蛋白熒光顯色。

2.4 Western blot 檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 mg/L DAP組比較，其余質(zhì)量濃度DAP組對(duì)人RA-FLS細(xì)胞中ERS相關(guān)蛋白PERK、p-PERK、GRP78、CHOP及Caspase-12表達(dá)隨DAP質(zhì)量濃度增加而增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與0 mg/L DAP組比較，其余質(zhì)量濃度DAP組對(duì)人RA-FLS細(xì)胞中ERS抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)隨質(zhì)量濃度增加而減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A、B分別為PERK、p-PERK及GRP78蛋白電泳和定量表達(dá)結(jié)果，C、D分別為CHOP、Caspase12及Bcl-2的蛋白電泳和定量表達(dá)結(jié)果；(1)與0 mg/L DAP組比較，P<0.05；(2)與20 mg/L DAP組比較，P<0.05；(3)與40 mg/L DAP組比較，P<0.05。

3 討論

甲氨蝶呤、羥氯喹目前作為RA在臨床上常用藥[15]，能快速緩解疾病癥狀，再加上生物制劑的加持，使得RA的治療更近一步改善，患者病情可得到極大控制,但部分患者因個(gè)體差異對(duì)藥物的敏感性及耐藥性的不同，療效不一，還會(huì)出現(xiàn)不同程度副作用[16-18]。因此，找到一種合適、更有效的治療方式是至關(guān)重要的[19]。近年來(lái)，中草藥類藥物研發(fā)和應(yīng)用不斷發(fā)展，與化學(xué)類藥劑相比，具有毒性及副作用小的優(yōu)勢(shì)，因此發(fā)掘中草藥類抗炎制劑將更加造福于人類[20-22]。已有相關(guān)研究表明，DAP在CIA中可調(diào)節(jié)輔助性T(helper T cell，Th)細(xì)胞，并通過(guò)線粒體自噬途徑調(diào)節(jié)CIA小鼠FLS炎癥介質(zhì)表達(dá)、促進(jìn)其凋亡[23-25]。本研究結(jié)果顯示，DAP可成劑量依耐性地誘導(dǎo)人RA-FLS細(xì)胞凋亡，與前期誘導(dǎo)CIA-FLS凋亡結(jié)果一致。

ERS是細(xì)胞自我調(diào)節(jié)功能的體現(xiàn)，適當(dāng)?shù)膽?yīng)激可通過(guò)ERS提高細(xì)胞存活率，起到細(xì)胞保護(hù)作用，但當(dāng)過(guò)度刺激超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身調(diào)節(jié)能力時(shí)，ERS反而加重細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的不平衡，通過(guò)誘發(fā)下游凋亡信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。PERK/GRP78/CHOP是ERS中的一條通路，可介導(dǎo)下游凋亡基因的表達(dá)，當(dāng)啟動(dòng)ERS時(shí)，PERK與GRP78解離，以磷酸化活性狀態(tài)激活下游CHOP、Caspase-12及Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27-29]。本研究首先通過(guò)免疫熒光初步檢測(cè)20 mg/LDAP對(duì)人RA-FLS細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，再通過(guò)蛋白印記進(jìn)一步定量印證，結(jié)果顯示，20 mg/L DAP可上調(diào)人RA-FLS細(xì)胞表達(dá)PERK、GRP78以及Caspase-12，對(duì)應(yīng)的蛋白印記結(jié)果也進(jìn)一步證明DAP可成劑量依耐性誘導(dǎo)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)。

綜上所述，DAP對(duì)人RA-FLS的抑制作用可能與ERS介導(dǎo)的凋亡相關(guān)，但本研究?jī)H先探討DAP在人RA-FLS細(xì)胞中與ERS的初步聯(lián)系，后續(xù)仍需加入抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)還需進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)加以研究，深入探討潛在分子機(jī)制，為DAP治療RA提供更具說(shuō)服力的理論支撐。