郭克磊，李穎利，卞博，韓立，李凱，張紅，卞華#（.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南 南陽 47004；2.南陽理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 47004；.南陽市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南 南陽 47000）

硬皮病又名系統(tǒng)性硬化病，是以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化為主要特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要包括纖維化、免疫炎癥、血管損傷等，而免疫系統(tǒng)失調(diào)特別是輔助性 T 細(xì)胞 17（T helper lymphocytes 17，Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）失衡在硬皮病發(fā)病及病程進(jìn)展中起著重要作用[1]。表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子RORγt（又名RORC或RORC2）基因啟動子低甲基化水平會導(dǎo)致維甲酸相關(guān)孤核受體（retinoic acid related nuclear orphan receptor，RORγt）的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Th17分化，如在硬皮病患者Th17細(xì)胞中就存在RORγt基因低甲基化、蛋白高表達(dá)的現(xiàn)象[2－3]。

中醫(yī)學(xué)中無硬皮病這個病名，其應(yīng)屬皮痹等范疇。本課題組前期突破硬皮病的傳統(tǒng)治療觀點(diǎn)，率先提出“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論。結(jié)合硬皮病的臨床表現(xiàn)，本課題組認(rèn)為硬皮病病性屬本虛標(biāo)實(shí)——本虛是肺脾腎三臟之陽氣虛，標(biāo)實(shí)是寒邪凝結(jié)、濕痰瘀等濁邪阻絡(luò)，脈絡(luò)不通；病位在絡(luò)脈，與肺脾腎密切相關(guān)[4]。溫陽化濁通絡(luò)方是以黃芪桂枝五物湯、補(bǔ)肺湯、二仙湯等為基礎(chǔ)創(chuàng)制而成，由黃芪、黨參、桂枝、淫羊藿、積雪草、白芥子等10味藥材組成。諸藥相伍，通補(bǔ)并用，標(biāo)本兼顧，具有補(bǔ)肺健脾益腎、化濁通絡(luò)之效，共奏扶正祛邪之功，對硬皮病具有良好的療效[5]。本課題組前期研究表明，溫陽化濁通絡(luò)方能夠調(diào)節(jié)硬皮病患者外周血Th17/Treg失衡，降低Th17細(xì)胞數(shù)量及白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）水平，同時其還可通過下調(diào)微小核糖核酸-155、IL-6及酪氨酸激酶2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3等的表達(dá)，從而抑制Th17細(xì)胞增殖[6－8]。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用血清藥理學(xué)的方法，通過觀察溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清對Th17細(xì)胞增殖、RORγt mRNA及其蛋白表達(dá)、RORγt基因甲基化的影響，探討其治療硬皮病的作用機(jī)制，為溫陽化濁通絡(luò)方防治硬皮病提供理論參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括ABI Veriti 96W型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、ABI ViiA7型實(shí)時熒光定量PCR儀、NanoDrop 2000型核酸蛋白濃度分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Synergy H1型全功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），GloMax 20/20型發(fā)光檢測儀（美國Promega公司），Mini-PROTEAN 3型蛋白電泳儀、Gel Doc XR+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio Rad公司），F(xiàn)ACSCelesta型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 主要藥品與試劑

黃芪（批號180830，產(chǎn)地為山西）、黨參（批號20180701，產(chǎn)地為山西）、山藥（批號180601，產(chǎn)地為河南）、淫羊藿（批號181001，產(chǎn)地為四川）、熟地黃（批號180301，產(chǎn)地為河南）、桂枝（批號180901，產(chǎn)地為廣西）、積雪草（批號180804，產(chǎn)地為云南）、白芥子（批號180802，產(chǎn)地為河南）等飲片均購自河南省張仲景大藥房，經(jīng)南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院張超云副教授鑒定均為真品。甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱（decitabine，DCA）原料藥（批號S1200，純度＞99.93%）購自美國Selleck公司；CCK-8試劑盒（批號C0038）、BCA蛋白定量試劑盒（批號P0012）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶檢測試劑盒（批號E1960）購自美國Promega公司；第一鏈cDNA合成試劑盒（批號K1622）、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（批號1887047）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光定量PCR試劑SYBR Green（批號04913914001）購自德國Roche公司；DNA提取試劑盒（批號B618503）、DNA純化試劑盒（批號B610367）、瓊脂糖（批號A600014）、UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（批號B511321）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；人IL-17酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號E-EL-H0103c）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；RORγt兔多克隆抗體（批號DF3196）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）鼠單克隆抗體（批號AC002）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號5220-0336）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（批號074-1806）購自美國KPL公司；DNA甲基化修飾試劑盒（批號D5030）購自美國Zymo公司；熱啟動DNA聚合酶（批號M0490S）購自美國New England Biolabs公司；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康SPF級Wistar雌性大鼠，共60只，7～8周齡，體質(zhì)量為220～250 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0011。大鼠飼養(yǎng)于溫度為（24±2）℃、相對濕度為（50±10）%、晝夜交替（12 h/12 h）的環(huán)境中。飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食、飲水。本研究動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南陽理工學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為南理工動倫審〔2018〕011號。

1.4 Th17細(xì)胞

Th17細(xì)胞來源于2018年3月－2019年7月在南陽市中心醫(yī)院確診并接受治療的硬皮病患者血液樣本。經(jīng)患者知情同意后，抽取其外周血5 mL，由南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院韓立老師分選Th17細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀驗(yàn)證其純度為96%～98%[9]。本研究臨床血液樣本的獲取符合相關(guān)臨床試驗(yàn)研究法規(guī)、規(guī)范及《赫爾辛基宣言》要求，并經(jīng)南陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查、批準(zhǔn)后實(shí)施（倫理批件號為2017-11-10-01）。

1.5 質(zhì)粒

pGL3-Basic-luc載體質(zhì)粒（批號E1751）、海腎熒光素酶RL-TK質(zhì)粒（批號E2241）均購自美國Promega公司。

2 方法

2.1 溫陽化濁通絡(luò)方水煎液的制備

按溫陽化濁通絡(luò)方組成稱取相應(yīng)量飲片，加10倍量水（mL/g，下同）浸泡1 h，武火煎煮開以后文火煎30 min，收集藥液；藥渣再加10倍量水以文火煎30 min，收集藥液。合并2次煎煮液，濃縮得到生藥量為1.5 g/mL的水提物（得率為43.44%）。經(jīng)高分辨質(zhì)譜法測定，其中主要含淫羊藿苷（0.98%）、積雪草苷（0.20%）、芥子堿（0.07%）、黃芪甲苷（0.01%）等成分。

2.2 動物分組、給藥及含藥血清的制備

將60只大鼠隨機(jī)分為空白對照組和溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組，每組15只。溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組大鼠分別按照15、30、60 g/（kg·d）[分別為成人臨床等效劑量的1、2、4倍，按照成人臨床日用劑量（141 g/d）及大鼠與成人體質(zhì)量劑量折算系數(shù)（6.25）計算出大鼠的日用藥量為15 g/kg（141 g/60 kg×6.25≈15 g/kg）]灌胃給藥，空白對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水。早晚各給藥1次，連續(xù)灌胃7 d。各組大鼠分別于末次灌胃給藥30 min后，在麻醉狀態(tài)下于股動脈采血，將各組大鼠的血樣混合后在4℃下靜置2 h，再以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，即得空白血清和含藥血清。將血清用0.45 μm濾器過濾除菌，分裝后置于－80℃冰箱中保存，備用。

2.3 CCK-8法檢測Th17細(xì)胞增殖

將Th17細(xì)胞按每孔100 μL（2×103個細(xì)胞）接種到96孔板中，分為空白血清對照組，溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清低、中、高劑量組（后文簡稱含藥血清低、中、高劑量組）和DAC組（陽性對照組），每組設(shè)置6個復(fù)孔；并另外設(shè)置空白孔（加100 μL無細(xì)胞培養(yǎng)基）。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，空白血清對照組加入10%體積空白對照血清，含藥血清低、中、高劑量組分別加入10%體積對應(yīng)含藥血清，DAC組加入1 μmol/L DAC和10%體積空白血清，處理48 h。每孔加入10%體積CCK-8溶液，于37℃下孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度（A），計算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）＝（A給藥組－A空白孔）/（A空白對照組－A空白孔）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 qRT-PCR法檢測細(xì)胞中RORγt、IL-17 mRNA的表達(dá)水平

將Th17細(xì)胞按每孔500 μL（1×105個細(xì)胞）接種到24孔板中，分組同“2.3”項(xiàng)下，每組設(shè)置3個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法加藥處理。處理48 h后，收集細(xì)胞，按照RNA抽提試劑盒步驟提取細(xì)胞中總RNA，并測定總RNA的濃度。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）如下：cDNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，SYBR Green 試劑10 μL，超純水8 μL。反應(yīng)條件如下：95℃熱啟動15 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算各目的基因mRNA的表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物擴(kuò)增長度

2.5 Western blot法檢測細(xì)胞中RORγt蛋白表達(dá)水平

將Th17細(xì)胞按每孔1 mL（2×105個細(xì)胞）接種到12孔板中，細(xì)胞分組及給藥處理方法同“2.3”項(xiàng)下。處理48 h后，在4℃下以2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，以BCA法測定總蛋白的濃度，加入上樣緩沖液將總蛋白煮沸10 min變性。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，取40 μg總蛋白上樣，先在80 V電壓下電泳30 min，待樣品進(jìn)入分離膠后，在120 V電壓下電泳1 h；在200 mA電流下轉(zhuǎn)移1 h至聚偏二氟乙烯膜上，以5%牛血清白蛋白在室溫下封閉1 h；分別加入RORγt一抗（稀釋比例為1∶2 000）、GAPDH一抗（稀釋比例為1∶5 000），4℃孵育過夜；TBST漂洗5 min×5次，分別加入對應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶10 000），室溫孵育1.5 h；TBST漂洗5 min×5次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。使用Image J 1.52 a軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示RORγt蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-17蛋白表達(dá)水平

將Th17細(xì)胞按每孔1 mL（2×105個細(xì)胞）接種到12孔板中，細(xì)胞分組及給藥處理方法同“2.3”項(xiàng)下。處理48 h后，在4℃下以12 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測各組細(xì)胞上清液中IL-17蛋白表達(dá)水平。

2.7 甲基化特異性PCR法檢測細(xì)胞中RORγt基因啟動子甲基化水平

將Th17細(xì)胞按每孔1 mL（2×105個細(xì)胞）接種于12孔板中，細(xì)胞分組、給藥處理方法同“2.3”項(xiàng)下。處理48 h后，收集細(xì)胞，采用柱式法提取細(xì)胞中總DNA，根據(jù)DNA甲基化修飾試劑盒方法進(jìn)行DNA重亞硫酸鹽處理將非甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），甲基化的胞嘧啶（C）保持不變，回收并純化DNA。使用在線工具M(jìn)ethPrimer 2.0（http：//www.urogene.org）設(shè)計RORγt基因啟動子區(qū)甲基化（methylated，M）與非甲基化（methylated，U）引物，甲基化特異性PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1）。使用熱啟動DNA聚合酶進(jìn)行甲基化特異性PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：DNA模板5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，熱啟動DNA聚合酶0.25 μL，反應(yīng)緩沖液10 μL，用水補(bǔ)至總體積50 μL。反應(yīng)條件如下：95℃熱啟動30 s；95℃變性15 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后68℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠，在120 V電壓下電泳20 min，使用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照成像，并采用Image J 1.52 a軟件分析DNA電泳條帶的灰度值，并計算RORγt基因啟動子甲基化水平：RORγt基因啟動子甲基化水平＝給藥組條帶灰度值/空白對照組條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 雙熒光素酶法檢測細(xì)胞中RORγt基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性

先將RORγt基因啟動子片段克隆構(gòu)建到pGL3-Basic-luc載體上，命名為pGL3-RORγt-luc，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序正確后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將Th17細(xì)胞按每孔500 μL（1×105個細(xì)胞）接種于24孔板中，細(xì)胞分組同“2.3”項(xiàng)下。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，每孔轉(zhuǎn)染0.5 μg pGL3-RORγt-luc及10 ng RL-TK質(zhì)粒，6 h后更換為新鮮培養(yǎng)基，同時細(xì)胞給藥處理同“2.3”項(xiàng)下。處理48 h后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞中RORγt基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清對Th17細(xì)胞增殖的影響

與空白血清對照組[（100.700±6.500）%]比較，含藥血清低、中、高劑量組和DAC組細(xì)胞的增殖率[（88.040±2.970）%、（75.182±4.216）%、（58.440±5.575）%、（58.440±5.575）%、（44.461±3.147）%，n＝6]均顯著降低（P＜0.05），并且具有一定的劑量依賴趨勢。

3.2 含藥血清對細(xì)胞中RORγt、IL-17 mRNA表達(dá)的影響

與空白血清對照組比較，含藥血清各劑量組和DAC組細(xì)胞中RORγt mRNA表達(dá)水平以及含藥血清中、高劑量組和DAC組細(xì)胞中IL-17 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞（上清液）中RORγt、IL-17 mRNA及其蛋白表達(dá)水平的測定結(jié)果（±s，n＝3）

表2 各組細(xì)胞（上清液）中RORγt、IL-17 mRNA及其蛋白表達(dá)水平的測定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白血清對照組比較，P＜0.05

組別空白血清對照組含藥血清低劑量組含藥血清中劑量組含藥血清高劑量組DAC組蛋白/（pg/mL）80.730±2.113 73.380±2.304a 64.270±3.415a 57.190±2.119a 55.120±4.334a RORγt mRNA 1.050±0.099 0.778±0.058a 0.584±0.061a 0.355±0.054a 0.244±0.040a蛋白1.645±0.035 1.151±0.042a 0.953±0.017a 0.652±0.063a 0.151±0.041a IL-17 mRNA 1.000±0.156 0.915±0.035 0.742±0.062a 0.672±0.080a 0.464±0.039a

3.3 含藥血清對細(xì)胞（上清液）中RORγt、IL-17蛋白表達(dá)的影響

與空白血清對照組比較，含藥血清各劑量組、DAC組細(xì)胞（上清液）中RORγt、IL-17蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、表2。

圖1 各組細(xì)胞中RORγt蛋白表達(dá)的電泳圖

3.4 含藥血清對細(xì)胞中RORγt基因啟動子甲基化的影響

與空白血清對照組比較，含藥血清中、高劑量組和DAC組細(xì)胞中RORγt基因啟動子甲基化水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表3。

圖2 各組細(xì)胞中RORγt基因啟動子甲基化檢測的電泳圖

3.5 含藥血清對細(xì)胞中RORγt基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

與空白血清對照組比較，含藥血清各劑量組和DAC組細(xì)胞中RORγt基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性均顯著降低（P＜0.05），且具有一定的劑量依賴趨勢。結(jié)果見表3。

表3 各組細(xì)胞中RORγt基因啟動子甲基化水平及其轉(zhuǎn)錄活性測定結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組細(xì)胞中RORγt基因啟動子甲基化水平及其轉(zhuǎn)錄活性測定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白血清對照組比較，P＜0.05

組別空白血清對照組含藥血清低劑量組含藥血清中劑量組含藥血清高劑量組DAC組轉(zhuǎn)錄活性7.323±0.505 6.565±0.398a 5.600±0.450a 5.170±0.332a 4.140±0.512a甲基化水平1.000±0.050 1.017±0.032 1.133±0.031a 1.223±0.025a 1.467±0.061a

4 討論

在血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，研究者通常會選擇雄性大鼠或雌雄各半的大鼠來制備含藥血清，但也有部分研究僅選用雌性大鼠來進(jìn)行含藥血清的制備[10]。因硬皮病的發(fā)病對象以女性為主（男女發(fā)病率之比為1∶3～1∶8）[11]，為了避免雄性大鼠血清中某些成分對細(xì)胞的影響，也為了與臨床研究對象保持一致[12]，故本研究僅選用了雌性大鼠作為研究對象。DAC為DNA甲基化酶抑制劑，其可通過抑制DNA甲基化酶的表達(dá)起到抑制DNA甲基化的作用[13]，因此本研究選擇DAC作為陽性對照藥。

Th17細(xì)胞是以分泌IL-17A為主的CD4+T細(xì)胞亞群，Th17細(xì)胞的異常增殖會促進(jìn)IL-17等促炎因子的產(chǎn)生，引起組織損傷及纖維化[14]。轉(zhuǎn)錄因子RORγt是調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化和發(fā)育的關(guān)鍵因子，其可與靶基因啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)IL-17等炎癥因子的表達(dá)，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15]。萬琳琳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，硬皮病患者外周血中Thl7細(xì)胞數(shù)量以及IL-17、RORγt表達(dá)水平明顯高于非活動期硬皮病患者和正常人，并與活動期硬皮病患者病情活動度呈正相關(guān)。Okamoto等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，博來霉素誘導(dǎo)的硬皮病模型小鼠的皮膚和肺組織中Th17細(xì)胞浸潤明顯，血清、皮膚和肺組織中IL-17A和RORγt表達(dá)水平顯著升高。上述研究表明，Th17細(xì)胞異常增殖及IL-17、RORγt在硬皮病患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)在疾病進(jìn)程中起著重要作用。由此可見，通過RORγt調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞平衡可能是治療硬皮病的潛在靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清可抑制硬皮病患者外周血來源Th17細(xì)胞的增殖以及IL-17、RORγt mRNA及其蛋白的表達(dá)。梁娟等[18]發(fā)現(xiàn)，紅花水煎液可通過降低硬皮病模型小鼠皮膚組織中RORγt蛋白的表達(dá)，抑制免疫炎癥反應(yīng)來發(fā)揮其抗皮膚纖維化的作用。其結(jié)果也表明，中醫(yī)藥可通過干預(yù)Th17細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來發(fā)揮治療硬皮病的作用。但本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清對正常人Th17細(xì)胞中RORγt mRNA及蛋白表達(dá)也有一定的抑制作用，說明溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清對硬皮病患者Th17細(xì)胞的作用可能是非特異性的。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾之一，在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，基因DNA高度甲基化會導(dǎo)致基因低表達(dá)，而低甲基化則使基因高表達(dá)[19]。Mazzoni等[2]發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞中RORC2基因啟動子呈低甲基化水平，而初始T細(xì)胞和Th1細(xì)胞中RORC2基因啟動子呈高甲基化水平，這提示RORC2基因甲基化水平的降低可能是初始T細(xì)胞和Th1細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化的必要條件。由此可見，從調(diào)節(jié)RORγt基因甲基化的表觀遺傳學(xué)角度出發(fā)來調(diào)控Th17細(xì)胞數(shù)量，可作為硬皮病防治的新思路。本研究發(fā)現(xiàn)，溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清可以升高Th17細(xì)胞中RORγt基因啟動子甲基化水平，并可抑制RORγt基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性，說明溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清可通過調(diào)節(jié)RORγt基因甲基化影響Th17細(xì)胞數(shù)量。

綜上，溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清可通過促進(jìn)RORγt基因啟動子甲基化及下調(diào)RORγt基因轉(zhuǎn)錄活性，抑制RORγt表達(dá)及IL-17分泌，從而抑制Th17細(xì)胞的增殖。但是本研究也可能存在如下問題：（1）雖然通過制備含藥血清可以更好地模擬中藥的有效成分，更準(zhǔn)確、科學(xué)地進(jìn)行中藥復(fù)方體外藥效學(xué)和藥理學(xué)評價[20]，但是在血清中檢測到的成分是否為有效成分很難確定，而且血清中化學(xué)成分含量復(fù)雜，給鑒定帶來了巨大的困難[21]。（2）溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清對Th17細(xì)胞的作用具有非特異性，而Th17細(xì)胞的增殖及RORγt的表達(dá)受到多種方式的調(diào)節(jié)，后續(xù)還需深入研究溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清是否通過其他途徑調(diào)節(jié)正常人及硬皮病患者Th17細(xì)胞增殖。